Locorotondo, 4-5 Giugno 2009

Locorotondo, 4-5 Giugno 2009 c/o Aula polifunzionale Istituto Tecnico Agrario "Basile-Caramia"

Con il patrocinio delComune di Locorotondo

Università degli Studidi Bari

Istituto per i Processi Chimico-FisiciCNR Bari

Università del SalentoDipartimento di

Scienza dei Materiali

CON IL CONTRIBUTO DI

SPAGNUOLO FRANCESCO STRUMENTAZIONE SCIENTIFICA

BARI

Società Italiana di FotoBiologia Sezione Nazionale della International Union for Photobiology

Congresso Annuale 2009 4 – 5 giugno 2009 Locorotondo (BA)

ATTI DEL CONVEGNO

Comitato Organizzatore

Lucia Catucci

Luigi Ceci

Roberto Comparelli

Livia Giotta

Francesca Italiano

Francesco Milano

Massimo Trotta

Comitato Scientifico

Gianfranco Canti Sergio Caffieri

PierGiacomo Calzavara-Pinton Giovanni Checcucci

Franco Fusi Francesco Ghetti

Giulio Jori Giuseppe Palumbo

Massimo Trotta

Segreteria Organizzativa Francesco Milano

Istituto per i Processi Chimico-Fisici – CNR sede di Bari Via Orabona, 4 – 70126 Bari

PROGRAMMA

Giovedì 4 giugno 9.00 Apertura del Congresso. Saluto delle Autorità

Chairperson Massimo Trotta 9.30 – 10.10 Plenary Lecture: Péter Maróti Luminescence as indicator of state of the photosynthetic apparatus of

bacteria Comunicazioni orali (15 minuti): 10.10 – 10.25 Federica Gevi: Characterization of antenna isoforms from spinach leaves

grown under different light conditions 10.25 – 10.40 Tomas Morosinotto: Regulation of light harvesting in plants: a structural

basis for the pH-dependent xanthophyll cycle 10.40 – 11.55 Roberto Improta: Quantum-mechanical studies of the DNA excited states:

from the isolated nucleobases to the double strand 10.55 – 11.10 Vincenzo De Leo: Activity of cytochrome bc1 complex in cardiolipin

enriched chromatophores from Rhodobacter sphaeroides

11.10 – 11.30 Coffee Break

Comunicazioni orali: Chairperson Francesco Ghetti 11.30 – 11.45 Leonardo Beccarisi: Valutazione delle condizioni ambientali nella grotta

Zinzulusa in relazione all’impianto d’illuminazione 11.45 – 12.00 Mariateresa Volpicella: Analisi per mutagenesi inserzionale della resistenza

ai metalli pesanti del batterio fotosintetico R. sphaeroides 12.00 – 12.15 Fulvio Ciriaco: Interpretazione quantitativa delle oscillazioni del

semichinone in centri di reazione indotte da luce impulsata: un approccio simulativo

12.15 – 12.30 Ivan Husu: Intensità della luce di misura e costanti cinetiche caratteristiche del processo di ricombinazione di carica nel centro di reazione di Rb. sphaeroides

12.30 – 12.45 Disma Mastrogiacomo: Heavy metal binding properties of photosynthetic biofilms studied by ATR-FTIR difference spectroscopy

12.45 – 13.00 Fabio Mavelli: Studio teorico-sperimentale delle cinetiche di ricombinazione di carica in liposomi a composizione variabile

13.00 – 14.30 Pausa pranzo

Chairperson Franco Fusi 14.40 – 15.20 Plenary Lecture: Teresa Pellegrino

Novel Inorganic hybrid nanostructures for biomedical applications


Tavola Rotonda FotoBiologia e Nanostrutture Moderatori Roberto Comparelli & Giuseppe Palumbo

15.40 – 16.00 Marco Marchetti Nanotubi inorganici geomimetici sintetici per applicazioni biomediche

16.00 – 16.20 Nicoletta Depalo Funzionalizzazione e bioconiugazione di nanocristalli colloidali

16.20 – 16.40 Elena Reddi Nanosistemi per ottimizzare la terapia fotodinamica dei tumori: aspettative e limitazioni

16.40 – 17.00 Cosimo D’Andrea Tecniche di imaging e spettroscopia di fluorescenza di nanoparticelle per applicazioni diagnostiche e terapeutiche

17.00 – 17.20 Luca De Stefano Biosensori e biochip ottici basati sulla nanotecnologia del silicio poroso

17.20 – 18.20 Discussione.

18.30 Assemblea dei Soci

20.30 Cena sociale

Venerdì 5 giugno

9.00 – 9.30 Giorgio Petrelli (Sindaco di Locorotondo) Francesco Dall’Acqua Luigi Musajo: padre della fotobiologia italiana Chairperson Francesco Dall’Acqua 9.30 – 10.10 Plenary Lecture: PierGiacomo Calzavara-Pinton PDT e dermatologia: dove siamo

Comunicazioni orali: 10.10 – 10.25 Sergio Caffieri: Fotostabilità di flavonoidi 10.25 – 10.40 Andrea Ventrella: Studies on the influences of heavy metals and herbicides

on photosynthetic materials by using optical assays 10.40 – 10.55 Raffaella Verrone: Effect of cyclodextrins on mycotoxin photodegradation 10.55 – 11.10 Francesca Cialdai: Caratterizzazione dell’autofluorescenza di cellule di

neuroblastoma (SH-SY5Y) sottoposte a campo elettrico


Chairperson PierGiacomo Calzavara-Pinton Comunicazioni orali: 11.30 – 11.45 Marina Venturini: Microscopia laser confocale a riflettanza per la

valutazione in vivo di lesioni melanocitarie e tumori cutanei non melanoma 11.45 – 12.00 Elisa Corteggiani Carpinelli: Biofuel from microalgae, exploiting solar

energy for future sustainability 12.00 – 12.15 Angela Chiaviello: Photodynamic therapy combined with aspirin, causes

proteasome malfunctioning and promotes apoptosis of human-derived H1299 and A549 lung adenocarcinoma cells

12.15 – 12.30 Fulvio Ratto: Analisi di seconda armonica nella saldatura laser della cornea 12.30 – 12.45 Giovanni Romano: Sicurezza nell’uso dei laser in fotobiologia e

fotomedicina 12.45 – 13.00 Gabriele Bonaventura: Evidenze per una transizione globulare del dna

forza ionica indotta: uno studio di light scattering

13.00 – 14.30 Pausa pranzo

Chairperson Giuseppe Palumbo 14.40 – 15.20 Plenary Lecture: Clara Fabris

Fotosensibilizzazione di agenti patogeni di origine microbica: studi di base e prospettive terapeutiche

Comunicazioni orali: 15.20 – 15.35 Francesca Italiano: Studio della risposta metabolica di cellule di

rhodobacter sphaeroides esposte a stress abiotico da ioni cromato 15.35 – 15.50 Fernanda Ricchelli: Switch from inhibition to activation of the

mitochondrial permeability transition during hematoporphyrin-mediated photooxidative stress

15.50 – 16.05 Carlo Musio: Structural and regulatory facets of the opsin-like visual pigments in Hydra

15.05 – 16.20 Andrea Pardini: Spatial distribution of pigments in selected heterotrich ciliates by means of Multidimensional Confocal Fluorescence Microscopy


Chairperson Gianfranco Canti Comunicazioni orali: 16.40 - 16.55 Monica Camerin: Sintesi e caratterizzazione di squaraine come

fotosensibilizzatori nella terapia fotodinamica 16.55 - 17.10 Barbara Cellamare: Attività fotodinamica dei complessi di inclusione

pigmento fotosintetico/ciclo destrina 17.10 - 17.25 Antonella Di Poto: The effect of photodynamic treatment combined with

antibiotic action or hostdefence mechanisms on staphylococcus aureus biofilms

17.30 Saluti finali e chiusura del Congresso

PLENARY

LECTURES

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LUMINESCENCE AS INDICATOR OF STATE OF THE PHOTOSYNTHETIC APPARATUS OF BACTERIA

Péter Maróti and Emese Asztalos

Department of Biophysics, University of Szeged, Hungary

Although the importance of fluorescence of bacteriochlorophyll from photosynthetic bacteria has been recognized since decades, it has not become a routine tool in photosynthesis research in sharp contrast to chlorophyll fluorescence in oxygenic phototrophs. By kinetic measurements of prompt and delayed fluorescence from bacteriochlorophyll in purple nonsulphur bacteria Rhodobacter sphaeroides on wide (from 10 s to 1 s) time range, we will show its widespread use in investigation of function and structural organization the photosynthetic apparatus including the energetics, energy transfer, electron transport and proton uptake of the primary processes. Special interest will be paid to detect delayed fluorescence that has extremely small intensity (about 106 times smaller than that of the prompt fluorescence) and is always accompanied with the intense prompt fluorescence that blinds the photodetector. Several examples will demonstrate that native luminescence combined with kinetic absorption change spectrometry characterizes light-induced redox changes and their reverse (waste) processes in different levels of organizations (isolated reaction center protein, membrane fragments and intact whole cells) of the bacteria. By synchronization of the growth of bacteria, some luminescence-detected phenomena can be revealed which might be specific to age, to level of organization of the intracytoplasmic membrane (ICM) or to cell cycle of the bacteria (see the

Figures). As all of these characteristics are sensitive to assembly of photosynthetic units and to environmental effects, luminescence can be used to monitor these processes.

3

NOVEL INORGANIC HYBRID NANOSTRUCTURES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS

Teresa Pellegrino

National Nanotechnology Laboratory of CNR-INFM, Unità di ricerca Istituto Italiano di Tecnologia and Scuola Superiore ISUFI Via per Arnesano, 73100 Lecce (Italy)

The development of nanoscale "devices" able to perform, in parallel several tasks will offer

new solutions in both diagnosis and medical therapy.

In particular, nanostructures displaying at the same time fluorescence and magnetic properties

are potentially useful tools for biomedical applications, as dual modality imaging probes

based on optical and magnetic resonance imaging (MRI), or for bio-separation and bio-

sensing as for example the simultaneous magnetic separation and multiplexing optical

detection of different tumour cell populations. We report here the fabrication of two different

kinds of magnetic-fluorescent nano-tools. The first type is based on single superparamagnetic

nanoparticles functionalized with fluorophore molecules while the second type consists of

spherical nano-beads which display both fluorescent and magnetic features, based on grafting

fluorescent oligothiophene molecules to an amphiphilic polymer that is then used to enwrap

iron oxide nanoparticles acting as the magnetic domain. We report also cell imaging and cell

separation experiments, in which we demonstrate a cell separation efficiency of the level

required for cell sorting applications.

4

LUIGI MUSAJO: PADRE DELLA FOTOBIOLOGIA ITALIANA

Francesco Dall’Acqua

Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova

Luigi Musajo nasce a Locorotondo nel 1904. Si laurea in Chimica nel 1926 a Bologna,

elaborando una tesi sperimentale con il Prof. Ciamician. Si trasferisce a Bari, sotto la guida

del prof. Ciusa, come aiuto alla Cattedra di Chimica Farmaceutica. Ottiene la Libera Docenza

nel 1932 e frequenta nel 1937 il Laboratorio di Chimica dell’Università di Vienna, sotto la

direzione del prof. Späth.

Nel 1942 è chiamato in cattedra a Cagliari, quindi a Modena, dove rimane dal 1945 al 1951,

per poi passare a Padova, dove percorrerà tutta la sua carriera accademica (Direttore

dell’Istituto di Chimica Farmaceutica e del Centro sulla Chimica del Farmaco del CNR,

Preside, Prorettore, ecc.), assumendo importanti incarichi a livello nazionale e internazionale.

Luigi Musajo muore a Modena nel 1974.

Proprio a Vienna, sotto la guida del prof. Späth, scopre le furocumarine (dette anche

psoraleni); si dedica all’estrazione ed alla caratterizzazione di varie furocumarine, coltivando

essenzialmente l’aspetto della chimica delle sostanze naturali.

L’incontro con la fotobiologia avviene qualche anno più tardi: in occasione di un periodo di

licenza come ufficiale delle Armi Navali, si trova in una spiaggia poco lontana da

Locorotondo per fare qualche bagno di sole. In quella circostanza Musajo segue un

suggerimento popolare secondo il quale applicando sulla pelle dell’olio di bergamotto ed

esponendosi successivamente al sole, si ottiene un’intensa abbronzatura. Altro che

abbronzatura! Durante la notte infatti si sviluppa nella parte della pelle che ha trattato, un

forte eritema con gonfiore e dolore.

La sua curiosità di scienziato lo stimola a voler approfondire le motivazioni di un fenomeno

così pesante; grazie agli studi viennesi, si rende conto che l’effetto fotosensibilizzatore (come

egli lo definì) poteva venir attribuito proprio ad uno psoralene contenuto nell’olio di

bergamotto, il bergaptene, che ora chiamiamo 5-metossipsoralene o 5-MOP.

Da questo momento il Prof. Musajo dedica molto del suo impegno alla fotobiologia, e le

ricerche sue e del gruppo di ricercatori da lui forgiato si distingue a livello internazionale per

gli studi sul meccanismo d’azione delle furocumarine, portando infine, in collaborazione con i

dermatologi della Harvard Medical School, alla terapia PUVA.

5

TERAPIA FOTODINAMICA IN DERMATOLOGIA, OGGI

PierGiacomo Calzavara-Pinton

Clinica Dermatologica, Università e Spedali Civili di Brescia.

Dopo più di 100 anni dalle prime evidenze, la terapia fotodinamica (PDT) ha conquistato un

ruolo per quanto ancora (?) marginale nell’armamentario terapeutico dermatologico.

In Europa sono registrati attualmente due farmaci per uso locale dermatologico: il

metilaminolevulinato (Metvix, Galderma e Photocure) con l’indicazione basalioma, malattia

di Bowen e cheratosi attinica e gli ALA-patch di Intendis e Photonomic, non disponibili in

Italia. Levulan, DUSA è registrato solo negli USA e Canada. Sono inoltre disponibili varie

preparazioni locali galeniche di ALA per quanto vi siano dubbi sulla liceità della loro

commercializzazione dato che ALA è in vendita come reagente ma non è disponibile/

registrato come farmaco in Europa.

L’ uso di Metvix è frenato dal costo elevato e dalla mancata rimborsbilità del farmaco da

parte dei diversi SSR in Italia. Attualmente solo le Regioni Veneto e Lombardia hanno

deliberato sul loro rimborso per quanto con codici DRG diversi (Asportazione chirurgica per

il Veneto, Chemioterapia per la Lombardia: questi corrispondono a un rimborso di circa 700/

1000 euro nel primo caso e 424 nel secondo. Inoltre la Lombardia ha posto dei criteri

dimensionali precisi.

L’ efficacia/tollerabilità di ALA/MAL sono state poi investigate in un ampio spettro di

patologie dermatologiche infettive, infiammatorie e neoplastiche, talora senza solidi dati

sperimentali che ne giustificassero l’ impiego. I dati pubblicati si riferiscono perlopiù a studi

osservazionali su piccole casistiche o casi anedottici e come tali non possono mostrare gli

effettivi vantaggi della PDT in confronto al benchmark delle terapie convenzionali. E difatti l’

uso della PDT per queste indicazioni non si è mai diffuso nella pratica clinica.

L’ uso di fotosensibilizzanti per via generale è stato limitato a pochissime situazioni cliniche

e difficilmente si intravede in grado di attrarre un significativo interesse e conseguenti

investimenti nei prossimi anni.

L’ esperienza di questi ultimi anni ci permette di prevedere che ALA/MAL si stabilizzerà in

una nicchia consolidata di mercato per le indicazioni oncologiche attualmente registrate

mentre la ricerca di nuove molecole per uso locale e sistemico in Dermatologia soffre di una

grave carenza di investimenti limitata ad una frazione infinitesimale del budget dedicato alla

ricerca farmacologica.

6

FOTOSENSIBILIZZAZIONE DI AGENTI PATOGENI DI ORIGINE MICROBICA: STUDI DI BASE E PROSPETTIVE TERAPEUTICHE

Clara Fabris

Dipartimento di Biologia, Università di Padova

L’individuazione di modalità terapeutiche diverse dall’impiego di antibiotici per la cura di

infezioni di origine microbica rappresenta un settore di ricerca molto attivo. L’applicazione

della terapia fotodinamica (PDT) in campo antimicrobico costituisce una valida alternativa

per il trattamento di infezioni localizzate grazie ad una duplice selettività: l’applicazione in

situ del fotosensibilizzatore e l’irradiamento diretto dell’area lesionata.

L’utilizzo di fotosensibilizzatori con cariche positive intrinseche o l’inserimento di gruppi

funzionali carichi positivamente nel macrociclo tetrapirrolico di derivati porfirinici ha

consentito di indurre un’estesa inattivazione di un ampio spettro di microrganismi tra cui

batteri Gram-positivi e Gram-negativi, funghi, lieviti, micoplasmi e protozoi parassiti.

La PDT antimicrobica risulta particolarmente favorevole grazie ad alcune caratteristiche, tra

cui, oltre all’ampio spettro d’azione, l’efficienza di inattivazione nei confronti di specie

antibiotico-resistenti, la ridotta probabilità di insorgenza di processi mutageni, la mancanza di

selezione di ceppi fotoresistenti e l’elevata selettività d’azione nei confronti dei patogeni

rispetto ai principali costituenti dei tessuti ospiti.

Studi condotti in vitro e su modelli animali hanno permesso di studiare dettagliatamente

l’efficacia e la potenzialità della PDT antimicrobica. Sulla base dei dati ottenuti è possibile

ipotizzare che la PDT potrà trovare un ruolo specifico per il trattamento di determinate

patologie originate da microrganismi.

7

TAVOLA

ROTONDA

8

NEW SYNTHETIC GEOMIMETIC INORGANIC NANOTUBES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS

M. Marchetti1, I. Foltran1,2, E. Foresti1, M. Lelli1, I.G. Lesci1, F. Pierini1, and N. Roveri1

1Alma Mater Studiorum University of Bologna, Department of Chemistry “G. Ciamician”, Via Selmi 2, 40126 Bologna – Italy.

2University of Eastern Piedmont “Amedeo Avogadro”, Department of Medical Sciences, Via Solaroli 17, 20068 Novara – Italy.

Asbestos is a mineral group formed by anphibole (inosilicate minerals) like amosite,

crocidolite and serpentine like chrysotile. We hardly find only chrysotile in nature, because

this material usually enhances together its polymorphous like lizardite and antigorite[1].

Moreover these fibres are usually contaminated by metal traces like iron, aluminium and

nickel, which substitute themselves to silicon or to magnesium or they can create different

structural anomalies. The main problem regarding natural chrysotile is its high toxicity grade [2-3]. In nanotechnology natural chrysotile is scarcely utilized just because of its high toxicity

and non homogenous chemicals and structural properties. This problem can be overcome by

the synthesis of stoichiometric geomimetic chrysotile fibres utilizing the previously reported

synthetic method starting from SiO2, MgCl2*6H2O, H2O in a basic medium at 300 °C and 82

atm for 36 h[4].Geomimetic synthetic chrysotile fibres have a tubular morphology with

variable length and external and internal diameter of 21±1 nm and 7±1 nm respectively. They

can be synthesized with controlled and homogeneous stoichiometry, morphology and

structure. The absence of metallic ions contamination makes these nanotubes not toxic.

For technological applications metallic nanowires can be prepared filling the geoinspired

nanotubes with metallic nanoparticles of Ag, Cu, Au and for biomedical applications they

can be utilize as innovative drug delivers. Furthermore they can also be used to prepare

innovative nano-hybrids consisting of chrysotile nanotubes[4-5] as inorganic building blocks,

and of functional organic molecules such as porphyrin chromophores [6].

1 D.R. Veblen, and P.R. Buseck, Science, 206 1979, 1398. 2 E. Gazzano, E. Foresti, I. G. Lesci, M. Tomatis, C. Riganti, B. Fubini, N. Roveri, D. Ghigo, Toxicology and

Applied Pharmacology, 206, 2005, 356-364. 3 C. Riganti, E. Aldieri, L. Bergandi, I. Fenoglio, C. Costamagna, B. Fubini, A. Bosia, and D. Ghigo, Free

Radical Biol. Med., 32, 2002, 938. 4 G. Falini, E. Foresti, M. Gazzano, A. E. Gualtieri, M. Leoni, I. G. Lesci, N. Roveri, Chem. - Eur. J., 10, 2004,

3043-3049. 5 N. Roveri, G. Falini, E. Foresti, G. Fracasso, I. G. Lesci, P. Sabatino, J. Mater. Res., 21, 2006, 2711-2725. 6 G. De Luca, A. Romeo, V. Villari, N. Micali, I. Foltran, E. Foresti, I. G. Lesci, N. Roveri, T. Zuccheri, L.

Monsù Scolaro JACS (Communication), 2009, In press.

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FUNZIONALIZZAZIONE E BIOCONIUGAZIONE DI NANOCRISTALLI COLLOIDALI

N. Depalo1,2, R. Comparelli2, P. Carrieri1, M. Corricelli1,2, M. Striccoli2, M. L. Curri2, A.Agostiano1,2

1Dipartimento di Chimica – Università degli Studi di Bari; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, sede di Bari

Negli ultimi anni, lo studio della materia su scala nanometrica ha suscitato notevole interesse

nel campo della ricerca scientifica, in virtù della forte dipendenza tra le proprietà chimico-

fisiche dei nanomateriali e le loro dimensioni. In particolare, l’interesse verso i sistemi

nanocristallini nasce dalla possibilità di ottenere differenti proprietà del sistema: funzionalità,

reattività e solubilità. Una tale versatilità può essere conseguita mediante un’opportuna

modulazione delle dimensioni, della forma e della superficie dei nanocristalli, sia durante che

subito dopo il processo di sintesi. Inoltre, la combinazione tra materiali differenti permette di

generare caratteristiche innovative che non potrebbero diversamente essere peculiari di una

singola nanostruttura.

Infine, la possibilità di manipolare opportunamente la loro superficie, allo scopo di

aumentarne la bio-compatibilità e per ottenerne l’immobilizzazione su substrati e/o

l’incorporazione in matrici differenti, rende le nanoparticelle colloidali estremamente versatili.

Uno degli obiettivi principali nelle applicazioni dei nanocristalli è dunque la loro solubilità in

ambienti chimico-fisici differenti. Ciò si può ottenere attraverso trattamenti post-sintesi che li

rendano biocompatibili e solubili in acqua, preservando il più possibile le loro specifiche

proprietà.

Nel presente seminario verranno illustrate alcune tra le più recenti tecniche di

funzionalizzazione e bioconiugazione di nanocristalli colloidali di differente composizione e

forma (CdSe@ZnS, CdS, TiO2, Fe2O3 e TiO2/Fe2O3) e le loro possibili applicazioni.

10

NANOSISTEMI PER OTTIMIZZARE LA TERAPIA FOTODINAMICA DEI TUMORI: VANTAGGI E LIMITAZIONI

Compagnin C.1, Mancin F.3, Moret F.1, 2Papini E., Rio Echevarria I.1, Segat D.1, Selvestrel F.1,Tavano R.2, Reddi E.1

1Dipartimento di Biologia, 2Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e 3Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova

La terapia fotodinamica (PDT) è una procedura per il trattamento dei tumori solidi che

prevede la somministrazione di un agente foto sensibilizzante (PS) seguita da irradiamento

con luce rossa della massa neoplastica. Il PS attivato dalla luce produce specie reattive

dell’ossigeno (ROS) e di conseguenza la morte delle cellule tumorali. La PDT è poco invasiva

e più selettiva delle convenzionali terapie antitumorali perché il danno cellulare è limitato

all’area esposta ad irradiamento. Tuttavia alcuni effetti collaterali, come la fotosensibilità

cutanea prolungata e generalizzata, rendono desiderabile un miglioramento della PDT

soprattutto per quanto riguarda la localizzazione del PS nel tumore che attualmente è poco

selettiva. Una aumentata selettività di localizzazione potrebbe rendere la terapia efficace con

diminuite dosi di PS e minori effetti collaterali. Come, in generale per le terapie antitumorali,

si ritiene che le nanotecnologie possano fornire gli strumenti adatti per raggiungere questo

obiettivo. Infatti l’incorporazione di PS in nano sistemi di diversa natura è oggetto di studio

molto intenso perché considerata una strategia promettente che permetterà di sfruttare

pienamente le potenzialità della PDT. In teoria, un miglioramento della selettività di

accumulo nei tumori di PSs veicolati da nano sistemi di opportune dimensioni, dovrebbe

essere possibile sfruttando un targeting sia passivo che attivo basato sull’effetto EPR

(enhanced permeabilità and retention) dovuto alla maggiore permeabilità della

vascolarizzazione del tumore rispetto ai tessuti sani. Non solo liposomi e nanoparticelle (NP)

di polimeri biodegradabili vengono utilizzati per il delivery di diversi PS alle cellule tumorali

ma anche NP non biodegradabili e metalliche vengono proposte nonostante non siano

disponibili informazioni adeguate sulla loro biocompatibilità. La maggior parte degli studi sul

delivery di PS mediante NP sono stati effettuati con cellule tumorali in vitro mentre solo

alcuni studi in vivo sono riportati in letteratura. Saranno presentati e discussi i risultati più

recenti e significativi sul delivery di PSs mediante NPs con lo scopo di mettere in evidenza i

potenziali vantaggi che la nano medicina può offrire per migliorare la selettività della PDT ma

anche i problemi e le limitazioni che sembrano emergere dalle informazioni sinora disponibili. Progetto NANOPHOTO, contratto 20103, finanziato da FP7.

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TECNICHE DI IMAGING E SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA DI NANOPARTICELLE PER APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE E TERAPEUTICHE

Cosimo D’Andrea

Ingegneria dei Processi Industriali - Politecnico di Milano

L’uso di nanostrutture ha trovato recentemente vaste applicazioni in biologia e medicina

(Nanomedicina) sia per quanto riguarda l’aspetto diagnostico che terapeutico. Esse riguardano

aree quali l’imaging molecolare, diagnosi, drug delivery e rigenerazione di tessuti.

Parallelamente abbiamo assistito ad una rapida evoluzione della tecnologia che ha permesso

di osservare eventi molecolari con una maggiore sensibilità sia in vitro sia in vivo. Tra le

numerose tecniche utilizzate (MRI, PET, ottiche, etc …) le tecniche ottiche hanno assunto un

ruolo di crescente interesse per le loro caratteristiche di non invasività, elevata sensibilità e di

relativa facilità d’uso da parte dell’operatore.

In questa presentazione verranno mostrate due applicazioni, la prima in vitro su campioni

cellulari e la seconda in vivo su cavie, di tecniche ottiche di imaging e spettroscopia di

fluorescenza.

I fulleroli (fullereni idrosolubili) sono studiati per consentire ai farmaci di superare la barriera

oculare e raggiungere specifici comparti dell’occhio. Tuttavia il loro uso è subordinato allo

studio della loro fototossicità. In questa lavoro abbiamo studiato la fototossicità in vitro nel

caso di cellule umane della retina e lente. Le misure sono state realizzate in microscopia

utilizzando, come sistema di rivelazione, sia un sistema per spettroscopia di fluorescenza

risolta in tempo basato sulla tecnica di conteggio a singolo fotone correlato nel tempo

(TCSPC), sia una telecamera intensificata con risoluzione temporale inferiore ai 100 ps.

Tecniche di imaging e spettroscopia di fluorescenza sono state utilizzate insieme ad un mezzo

di contrasto (Indocyanine Cardio Green) per valutare in vivo la vascolarizzazione di tumori

impiantati in topi. Queste tecniche hanno permesso di valutare il vascular shutdown a seguito

di un trattamento con vascular disrupting agent (ZD6126).

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BIOSENSORI E BIOCHIP OTTICI BASATI SULLA NANOTECNOLOGIA DEL SILICIO POROSO

Luca De Stefano

Istituto per la Microelettronica e Microsistemi – Consiglio Nazionale delle Ricerche

Recentemente vi è un forte interesse alla realizzazione di dispositivi su scala micro- e nano-

metrica integrati su chip che possano trovare applicazione in medicina e biologia. Date le loro

dimensioni, tali micro- e nano-sistemi possono naturalmente interagire con le biomolecole, e

funzionare quindi come biosensori “selettivi” da utilizzare nel campo della diagnostica,

oppure come biochip, ossia come mini-laboratori integrati e specializzati. L’approccio

richiesto in questo tipo di progetti di ricerca è necessariamente multidisciplinare in quanto

utilizza competenze sviluppate in diversi campi, quali la fisica, l’ingegneria, la chimica, la

biologia e la medicina. Oggetto del seminario è presentare in sintesi l’attività scientifica

recentemente sviluppata presso l’IMM-CNR di Napoli relativa alla realizzazione di biosensori

e biochip ottici in silicio – utilizzando cioè

la stessa piattaforma che è alla base dei sorprendenti avanzamenti registrati negli ultimi anni

nel campo delle tecnologie elettroniche e fotoniche - per lo studio delle interazioni

biomolecolari in proteomica e genomica.

13

COMUNICAZIONI

ORALI

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CHARACTERIZATION OF ANTENNA ISOFORMS FROM SPINACH LEAVES GROWN UNDER DIFFERENT LIGHT CONDITIONS.

Gevi Federica, Timperio Anna Maria, Blasi Barbara and Lello Zolla

Dipartimento Scienze Ambientali (DISA), Università “La Tuscia” – Viterbo

The major light-harvesting complex (LHC-II) of higher plants plays a crucial role in capturing

light energy for photosynthesis and in regulating the flow of energy within the photosynthetic

apparatus. Native LHC-II isolated from plant tissue consists of three isoforms, Lhcb1, Lhcb2,

and Lhcb3, which form homo- and heterotrimers. Usually plants are exposed to environment

where light and temperature conditions are largely variable. The plants haven’t possibility of

moving so they have evolved several mechanism of acclimation. Among all the

environmental parameter light intensity has a major influence on plants life. When the plants

are exposed to high excess of light to optimize performance and to avoid photodamage

releases a monomers of LHCII from PSII to PSI preferentially in phosphorilated form

(Timperio et al. 2005). During light stress at 100 E m-2 s-1 plants must balance the excitation

of the two photosystem (Dilly-Hartwig H .1998, Allen et al. 2001) and so there is a migration

of light-harvesting complex type 2 (Lhcb2) from grana to PSI containing stroma exposed

membranes. Changes in the association-dissociation state of LHCII are the regulatory

mechanism that optimize light-harvesting function under different stress condition. In this

communication we want to investigate the behaviour of antenna proteins (Lhcb) during

different acclimatation, then to correlate the expression of the Lhcb1 isoforms to relative

mRNA. For this aim we used a microRotofor (Biorad) that avoid detergent and we obtained

the antenna proteins in their native form. Moreover it does not require the addition of any

chemicals such as a dye. Separation of complexes is based on the protein’s real

physicochemical properties which inevitably change when dye is added, the pH of each native

complex was also determined this is the case of various complexes of LHCII trimers, which

have different pH but similar molecular masses. Afterwards a reverse-phase HPLC method on

line with mass spectrometry allowed us to have a qualitative and quantitative analysis of Lhcb

proteins.Timperio AM, Zolla L. J Biol Chem. 2005;280(32):28858-66. Allen, J. F., and Forsberg, L. (2001) Trends Plant Sci. 6, 317–326 Dilly-Hartwig H, Allen JF, Paulsen H, Race HL. FEBS Lett. 1998 Sep 11;435(1):101-4.

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REGULATION OF LIGHT HARVESTING IN PLANTS: A STRUCTURAL BASIS FOR THE PH-DEPENDENT XANTHOPHYLL CYCLE

Giorgia Saga1, A. Giorgetti2, GM Giacometti1, R. Bassi2, T. Morosinotto1

1Dipartimento di Biologia, Università degli studi di Padova, Italy 2Dipartimento di Biotecnologie, Università degli studi di Verona, Italy

Plants adjust their photosynthetic activity to changing light conditions. A central role in this

regulation mechanisms is played by the xanthophyll cycle in which the carotenoid

violaxanthin (V) is converted into zeaxanthin (Z) in strong light. Zeaxanthin acts as a

allosteric activator of photoprotection in plants, enhancing dissipation of the excess absorbed

energy as heat (Non Photochemical Quenching, NPQ) and the scavenging of Chl triplets and

reactive oxygen species. Violaxanthin de-epoxidase (VDE), the enzyme responsible for Z

synthesis, is activated when the thylakoid lumen becomes acidified as a result of high

illumination.

Despite the fundamental role of zeaxanthin in photoprotection, biochemical and structural

information on the enzyme responsible of its synthesis were still lacunose, impairing a deep

understanding of the regulation of the reaction. We recently obtained the first structural data

on this key enzyme of for the regulation of light harvesting and Non Photochemical

Quenching. We determined the structures of the central lipocalin domain of VDE (VDEcd) at

acidic and neutral pH. At neutral pH, VDEcd is monomeric with its active site occluded in the

lipocalin barrel. Upon acidification, the barrel opens up resulting in a functional dimerization

of the enzyme.

Site directed mutagenesis allowed the identification of the binding sites of the two substrates

as well as the key residues for enzyme activity.

In silico molecular dynamics studies coupled with site directed mutagenesis allowed also

describing a mechanisms for the pH induced protein conformational change.

Taken together, these data represent a significant step toward a better understanding of the

mechanism of zeaxanthin formation in vivo.

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QUANTUM-MECHANICAL STUDIES OF THE DNA EXCITED STATES: FROM THE ISOLATED NUCLEOBASES TO THE DOUBLE STRAND

Roberto Improta1, Fabrizio Santoro2, Alessandro Lami2, Vincenzo Barone3

1Istituto Biostrutture e Bioimmagini – CNR, Napoli; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, Pisa; 3Scuola Normale Superiore, Pisa.

We have studied the static [1-8] and dynamical behavior of the DNA and of its constituents in

their excited states, with special focus on solvent effect [1-4] and on the influence of base

stacking and base pairing [5-8].

Excited state geometry optimizations in solution and extensive explorations of the excited-

state surfaces in the Franck-Condon region show that solvent can modulate the accessibility

of an additional decay channel, involving a dark n/ excited state. This finding is confirmed

by quantum dynamical calculations and provides the first unifying explanation for the

experimental trend of pyrimidine excited-state lifetime in different solvents.

Quantum mechanical calculations on adenine stacked oligomers and on the double strand

tetramer formed by two thymine-adenine stacked pairs in aqueous solution provide a detailed

atomistic picture of the excited state decay and of the emission process, and highlight the

specific roles of base-stacking and pairing. While absorption involves excited states

delocalized over different stacked bases, emission mainly takes place from individual

monomers and it is ruled by thymine bases. The long living components of the excited state

population of (dA)·(dT) oligomers correspond to a dark excimer produced by inter-monomer

charge transfer between two stacked adenine bases, whereas adenine-thymine proton transfer

plays a minor role in the excited state decay.

[1] T. Gustavsson, A. Banyasz, E. Lazzarotto, D. Markovitsi, G. Scalmani, M.J. Frisch, V. Barone, R. Improta J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 607 [2] F. Santoro, V. Barone, T. Gustavsson, R. Improta J. Am. Chem. Soc. 128 (2006), 16312 [3] Y. Mercier, F. Santoro, M. Reguero, R. Improta J. Phys. Chem. B 112 (2008) 10769 [4] V. Karunakaran, K. Kleinermanns, R. Improta, S. A. Kovalenko J. Am. Chem. Soc. 131 (2009)

5839. [5] F. Santoro, V. Barone, R. Improta Proc. Nat. Acac. Sci. U.S.A. 104 (2007) 9931 [6] F. Santoro, V. Barone, R. Improta J. Comput. Chem 29 (2008) 957 [7] R. Improta Phys. Chem. Chem. Phys 10 (2008) 2656 [8] F. Santoro, V. Barone, R. Improta submitted

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ACTIVITY OF CYTOCHROME BC1 COMPLEX IN CARDIOLIPIN ENRICHED CHROMATOPHORES FROM RHODOBACTER SPHAEROIDES

Vincenzo De Leo1, Lucia Catucci1,2, Francesco Milano2, Angela Corcelli2,3, Angela Agostiano1,2

1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy. 2Istituto per I Processi Chimico Fisici - CNR, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy.

3Dipartimento di Biochimica Medica e Biologia Medica, Università di Bari, P.zza G. Cesare, 70124 Bari, Italy

Rhodobacter sphaeroides is a Gram-negative bacterium of the Proteobacteria group, which is

capable of growing in the presence of light and in anaerobic conditions by means of

photosynthesis. Previous results demonstrated that the exposure of Rhodobacter (R.)

sphaeroides cells to hypertonic solutions of NaCl caused a considerable increase in

Cardiolipin (CL) plasma membrane content (1-2). As CL rises by increasing the incubation

time of R. sphaeroides in hypertonic solutions, it was possible to isolate chromatophores

containing different CL amounts by starting from cells incubated in NaCl solutions for

different times and to use this natural vesicles in the study of functional relationships between

CL and photosynthetic enzyme. Cytochrome bc1 is an integral enzyme complex with a

dimeric structure which plays a key role in electron transfer both in the respiratory and in the

photosynthetic processes. No previous direct evidence for a CL role on cytochrome bc1

complex of photosynthetic apparatus is available in literature. However, it is known that CL

can perform a specific function on mitochondrial bc1 complex (3). In this work, the

cytochrome bc1 enzymatic activity was comparatively evaluated in both control and CL

enriched chromatophores and a significant increase in enzymatic activity was found in the

latter. Since during the incubation time (5h) in hyperosmotic media the protein membrane

profile and the pigments of the vesicle remains unchanged, we can relate this increased

activity to an higher turnover number for the enzyme. It is concluded that, in analogy with the

mitochondrial complex, CL is required for optimal functioning of cytochrome bc1 complex in

photosynthetic bacteria.

(1) Catucci et al., (2004) Biochemistry 43, 15066-15072 (2) De Leo et al., (2009) J. Lipid Res. 50, 256–264. (3) Palsdottir et al., (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1666, 2-18

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INFLUENZA DELL’ILLUMINAZIONE ARTIFICIALE SULLE CONDIZIONI AMBIENTALI ALL’INTERNO DELLA GROTTA ZINZULUSA

D’Agostino D.1, Beccarisi L.2, Cataldo R.3

1 Scuola Superiore ISUFI, Università del Salento; 2 Di.S.Te.B.A., Università del Salento; 3 Dipartimento di Scienza dei Materiali, Università del Salento

La Grotta Zinzulusa (Castro, Lecce) risulta tra i siti più importanti dal punto di vista

biospeleologico, a livello internazionale, per la ricchezza di specie animali endemiche. Fin

dagli anni ’50, l’impianto di illuminazione è stato del tipo a luce incandescente, favorendo lo

sviluppo di comunità vegetali fototrofiche sulle superfici rocciose nella zona interna. Nel

marzo del 2008 è stato installato un nuovo impianto di illuminazione, costituito da corpi

illuminanti a 3 e 9 led da 1 watt ciascuno, con l’obiettivo di limitare i livelli di illuminazione

ad un’intensità massima di 40 lux, ridurre le emissioni dell’ultravioletto, del rosso e

dell’infrarosso, ed evitare la diretta illuminazione delle concrezioni. Lo scopo di questo studio

è quello di valutare l’influenza dell’illuminazione artificiale sulle condizioni ambientali della

grotta. Da dicembre 2007 dieci sensori rilevano in continuo temperatura ed umidità lungo il

percorso solitamente seguito dai visitatori. Dalle misure si nota che le caratteristiche

microclimatiche risentono dell’ambiente esterno solo dopo i primi 150 m dall’ingresso. Per

quanto riguarda le misure di luminosità all’interno della grotta, prima e dopo la sostituzione

dell’impianto d’illuminazione, si osserva come l’intensità luminosa sia aumentata e

l’irraggiamento sia diffuso. La risposta delle comunità vegetali alla luce è stata studiata

attraverso un campionamento sistematico, lungo transetti disposti radialmente intorno alle

lampade e distanti tra loro 30 cm. Nella zona d’ingresso si riscontra la presenza di formazioni

dense e compatte di licheni, briofite e pteridofite. Nella zona interna sono state rilevate alghe

verdi endolitiche (Chlorophyta), cianobatteri (Cyanophyta, specialmente sugli apici

stillicidiosi delle concrezioni calcitiche), talli di briofite e piccoli licheni. In assenza di luce,

mancano le specie fototrofiche e si rinvengono solo talli fungini, frequentemente organizzati

in vermicolazioni. Le diverse comunità fototrofiche hanno una risposta sensibilmente

differente al gradiente di luce; comunque tutte trovano il loro optimum ecologico nel breve

intervallo compreso tra 50 e 150 lux. L'attuale situazione conferisce un miglior confort al

visitatore ed una migliore percezione dell’ambiente durante il percorso e non favorisce lo

sviluppo di comunità biologiche estranee alla grotta nelle immediate vicinanze dei punti luce;

questa sembra essere una buona soluzione al difficile compromesso tra fruizione e

conservazione della grotta.

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ANALISI PER MUTAGENESI INSERZIONALE DELLA RESISTENZA AI METALLI PESANTI DEL BATTERIO FOTOSINTETICO R. SPHAEROIDES

Volpicella M.1, Leoni C.1, Italiano F.2, Di Paolo F.2, Trotta M.2, Gallerani R.1, Ceci L.R.3

1Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare - Università degli studi di Bari, 2Istituto per i Processi Chimico Fisici (CNR Bari), 3Istituto di Biomembrane e Bioenergetica (CNR

Bari).

Tra i microrganismi impiegati nelle strategie di bonifica ambientale (bioremediation), grande

interesse suscitano gli organismi fotosintetici che mostrano da un lato tolleranza ai metalli

pesanti e dall’altro una buona capacità di bioaccumulo. Tra gli organismi fotosintetici i batteri

rossi non sulfurei occupano una piccola ma importante nicchia ecologica. Essi possono

crescere in condizioni in cui la fotosintesi ossigenica non può avvenire, come per esempio in

ambienti a potere riducente anche particolarmente alto.

La ricerca oggetto di questo studio intende approfondire lo studio del metabolismo di R.

sphaeroides (ceppo wild-type: 2.4.1). Esso è un batterio fototrofico facoltativo rosso, non

sulfureo, Gram-negativo, non patogeno, in grado di acquisire energia mediante diversi

processi quali la fotosintesi, la litotrofia e la respirazione aerobica ed anaerobica. E’ stata

anche dimostrata la sua efficacia nella decontaminazione del terreno di crescita da diversi

ossidi metallici e ossianioni , ed è pertanto oggetto di studi di bioremediation. Il genoma di R.

sphaeroides 2.4.1 è stato completamente sequenziato (http://mmg.uth.tmc.edu/sphaeroides/);

è costituito da due cromosomi circolari: cromosoma I (CI, ~3,0 MBP), cromosoma II (CII,

~0,9 MBP), e altri cinque repliconi.

In considerazione della capacità del R. sphaeroides di crescere in presenza di elevate

concentrazioni di ioni Co2+ (sino a 25 mM), è stata messa in atto una strategia per la

identificazione dei geni necessari alla resistenza verso tali ioni. A tale scopo è stata costruita

una libreria di R. sphaeroides mediante inserzione di trasposoni. I primi risultati dello

screening di tale libreria hanno permesso l’individuazione di mutanti incapaci di crescere su

un terreno a bassa concentrazione di Co2+ (5 mM) per i quali è in corso la determinazione

delle curve di risposta alla dose di cobalto. Lo studio delle sequenze di tali cloni mediante la

tecnica del genome walking potrebbe consentire l’identificazione di geni che conferiscono al

batterio la resistenza a basse concentrazioni di Co2+.

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INTERPRETAZIONE QUANTITATIVA DELLE OSCILLAZIONI IN CENTRI DI REAZIONE INDOTTE DA LUCE IMPULSATA: UN APPROCCIO SIMULATIVO.

Fulvio Ciriaco1, Anna Lisa Bottalico1, Donato Frascati1, Francesco Milano2, Massimo Trotta2.

1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, 2Istituto Processi Chimico Fisici, CNR Bari.

L'osservazione delle oscillazioni del semichinone dei centri di reazione (RC) in presenza di

donatori elettronici esogeni al dimero, in seguito ad esposizione ad una successione di flash

luminosi, è una fonte preziosa di informazioni sulla cinetica e sulla termodinamica dei

processi collegati al ciclo di riduzione del chinone nel sito QB.

Nell’approccio classico all'interpretazione quantitativa dei dati si opera a concentrazioni di

chinone (Q) molto maggiori di quelle di RC; [Q] può quindi essere considerato costante

durante l'esperimento e si perviene ad una relazione lineare fra le concentrazioni a flash

successivi ottenendo facilmente una soluzione algebrica del problema.

Questo approccio presenta due limiti: il primo è che molti effetti non vengono presi in

considerazione dal modello perché non è possibile inserirli nel contesto della soluzione

algebrica del problema, il secondo è che le condizioni imposte all'esperimento diminuiscono il

numero di parametri che è possibile

ottenerne.

Per esempio, un forte eccesso di Q può

rendere inaccessibile il valore della costante

di binding per il chinone. Lo schema a

fianco mostra un modello base per la

simulazione di condizioni sperimentali

generiche. Sono state introdotte variabili

concentrazione per ciascuna delle specie

coinvolte; con un metodo adattativo

vengono trovati i valori dei parametri

sperimentali non noti che ottimizzano l'accordo fra i dati sperimentali ed i dati simulati.

L'uso di questa metodica ci ha permesso di evidenziare fattori non presenti nello schema base

e che sono stati introdotti in affinamenti progressivi del modello, come per esempio

l'inattivazione parziale del sito di legame per Q a seguito dei flash, e l’efficienza non unitaria

del flash

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INTENSITÀ DELLA LUCE DI MISURA E COSTANTI CINETICHE CARATTERISTICHE DEL PROCESSO DI RICOMBINAZIONE DI CARICA NEL CENTRO DI REAZIONE DI RB. SPHAEROIDES

M. Giomini1, M. Giustini1, I. Husu1, A. Mallardi2, G. Palazzo3

1Dipartimento di Chimica, Università di Roma “La Sapienza”; 2Istituto per i Processi Chimico-Fisici, CNR, Bari; 3Dipartimento di Chimica, Università di

Bari

Il Centro di Reazione (RC) dei batteri fotosintetici, un complesso transmembrana proteina-

pigmenti, rappresenta la più piccola unità funzionale in grado di convertire energia luminosa

in energia chimica. L'interazione con luce di frequenza opportuna induce una serie di reazioni

di trasferimento elettronico a partire da un donatore primario (un dimero di molecole di

batterioclorofilla, D), attraverso vari accettori intermedi, fino agli accettori finali (nel RC di

Rb. sphaeroides due molecole di ubichinone, Q), localizzati in domini distinti della proteina.

Il primo, QA, si trova in una tasca relativamente apolare; il secondo, QB, è in un ambiente più

polare dal quale può scambiare con il pool di chinoni presenti all’interno della membrana.

Sebbene identici, i due chinoni presentano potenziali di riduzione diversi in virtù del

differente intorno proteico. Pertanto lo stato a cariche separate D+QAQB- è più stabile di D+QA

-

ed il trasferimento elettronico da QA- a QB porta alla formazione di D+QAQB

-. In assenza di un

riducente l’elettrone, giunto fino a QA o QB, ritorna al donatore D mediante un processo noto

come ricombinazione di carica. L'alterazione dello stato redox dei cofattori del RC comporta

inoltre profonde alterazioni nel suo spettro d'assorbimento. Ciò fa sì che la fotolisi, un

particolare tipo di spettroscopia UV-Vis-NIR risolta nel tempo, sia la tecnica d’elezione per

valutare l’evoluzione delle reazioni fotochimiche nel RC. In essa due raggi non interferenti di

intensità diverse sono focalizzati sul campione: uno ha la funzione di innescare le reazioni di

trasferimento elettronico (raggio d'eccitazione), l'altro quella di monitorare le variazioni di

assorbanza indotte dall’eccitazione (raggio di misura). Se il primo provoca una perturbazione

istantanea degli stati elettronici dei cofattori (pochi ns nel nostro caso), il secondo, di intensità

ben più modesta, induce una perturbazione continua, i cui effetti sono di norma trascurati.

Il lavoro da noi presentato esamina gli effetti che l'intensità del raggio di misura induce sulla

ricombinazione di carica in soluzione, a partire dagli stati D+QAQB- e D+QA

-, in quest’ultimo

caso attinenti RC privi di chinone al sito QB od in cui il trasferimento elettronico da QA- a QB

è bloccato da inibitori (erbicidi). Il principale risultato è una formulazione dei parametri

cinetici della ricombinazione che per la prima volta in letteratura tiene conto dell’intensità

della luce di misura.

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HEAVY METAL BINDING PROPERTIES OF PHOTOSYNTHETIC BIOFILMS STUDIED BY ATR-FTIR DIFFERENCE SPECTROSCOPY

D. Mastrogiacomo1 L. Giotta2, L. Valli1, F. Italiano3, F. Milano3 and M. Trotta3

1Dipartimento di Ingegneria dell’Innovazione, University of Salento, S.P. per Monteroni,

73100 Lecce, Italy. 2 Dipartimento di Scienza dei Materiali, University of Salento, S.P. per

Monteroni, 73100 Lecce, Italy. 3Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR Bari via

Orabona 4, 70126 Bari, Italy

Bioadsorption of heavy metal ions on phototrophic cells represents an interesting issue due to

promising applications in bioremediation. In several cases the ability of microorganisms to

adsorb and remove toxic ions is mainly ascribable to metabolism-independent interaction of

heavy metals with cell-surface components. Moreover heavy metal cation binding properties

of bacterial surfaces are often associated to the proton uptake ability of cell envelopes, due to

the involvement of a number of acidic moieties, such as carboxylates or phosphonates, in

metal binding processes.

We have developed a new method for the identification and characterization of functional

groups lying on the surface of bacterial cells, involved in both proton and metal cation uptake.

Our approach is based on the infrared absorption analysis of bacterial biofilms deposited onto

the internal reflection element (IRE) of an Attenuated Total Reflection (ATR) device. By

means of a flow cell, attached microorganisms are exposed cyclically to bathing media

differing for pH and metal concentration. Reversible binding processes are revealed by the

appearance of characteristic signals in the resulting difference spectra. The assignment of

infrared difference bands allows eventually the identification of chemical moieties involved in

the reversible binding processes under investigation. The technique has been applied

successfully1,2 to the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides enlightening the key role

played by outer membrane carboxylates in the immobilization of Ni2+ ions.

1 Buccolieri, A.; Italiano, F.; Dell'Atti, A.; Buccolieri, G.; Giotta, L.; Agostiano, A.; Milano, F.; Trotta,M., Annali Di Chimica 2006, 96, (3-4), 195-203

2 F. Italiano; A. Buccolieri; L. Giotta; A. Agostiano; L. Valli; F. Milano and M. Trotta (International Biodeterioration & Biodegradation accepted for publication)

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STUDIO TEORICO-SPERIMENTALE DELLE CINETICHE DI RICOMBINAZIONE DI CARICA IN LIPOSOMI A COMPOSIZIONE VARIABILE.

Altamura E.1, Mavelli F.1, Milano F.2, Trotta M.2

1Dipartimento di Chimica, Università di Bari; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici, CNR Bari

Vescicole di molecole lipidiche vengono utilizzate come modelli cellulari per lo studio di

reazioni enzimatiche che possono avvenire sia nel pool acquoso che nella membrana. In anni

recenti, vescicole formate da fosfolipidi quali fosfatidilcolina, fosfatidilglicerolo e

cardiolipina sono state utilizzate per studiare il processo di ricombinazione di carica (CR) del

centro di reazione (RC) fotosintetico [1]. I dati ottenuti in presenza di un pool variabile di

ubichinone-10 (UQ10) sono stati confrontati con la soluzione di un sistema di equazioni

differenziali e i parametri cinetici ricavati mediante minimizzazione degli scarti quadratici

medi fra dati sperimentali e curve calcolate [2]. Il limite dell’approccio cinetico classico è che

studia l’andamento temporale medio di una vescicola senza considerare né le differenze

dimensionali dei diversi aggregati presenti in soluzione, né il loro diverso riempimento

molecolare. Per superare questo limite, abbiamo utilizzato un programma, sviluppato nel

nostro gruppo di ricerca[3], per la simulazione stocastica di sistemi reagenti

compartimentalizzati. Abbiamo così potuto studiare la cinetica del processo di CR tenendo

conto del differente stato iniziale delle singole vescicole per mettere in evidenza come le

distribuzioni molecolari dei soluti influenzino l’andamento macroscopico del sistema, in

particolare a basse concentrazioni di chinone esogeno. Tale approccio è stato anche utilizzato

nel caso di vescicole contenenti RC e chinone, perturbate mediante l’addizione di materiale

lipidico aggiuntivo sotto forma di micelle, che, rapidamente assorbite dai liposomi, fanno

diminuire la concentrazione locale di proteina e ligando, accelerando la cinetica di CR. Infine,

liposomi contenenti RC privati del chinone secondario sono state mescolati con liposomi

contenenti UQ10 portando ad un rallentamento della cinetica di CR per effetto dello scambio

del chinone fra le vescicole. In questo tipo di esperimenti la reazione di CR è stata utilizzata

per monitorare, in maniera indiretta, la dinamica delle vescicole lipidiche.

[1] Nagy L, Milano F, Dorogi M, Agostiano A, Laczko G, Szebenyi K, Varo G, Trotta M and Maroti P, Biochemistry: 43, (2004) 12913-23 [2] Milano F, Agostiano A, Mavelli F and Trotta M, Eur J Biochem: 270, (2003) 4595-4605 [3] F. Mavelli , K. Ruiz-Mirazo, Phil. Trans. R. Soc. London B: 362, (2007) 1789-1802

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FOTOSTABILITÀ DI FLAVONOIDI

Sergio Caffieri, Giorgia Miolo, Stefano Dall’Acqua

Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova

I flavonoidi sono composti naturali, ampiamente diffusi nelle piante superiori. Grazie alle loro

proprietà antiossidanti, vengono impiegati come nutriceutici per garantire l'ottimale

funzionamento di fegato e sistema immunitario, oltre a contribuire alla prevenzione di

patologie cardiovascolari, infiammatorie e tumorali. L'ampia varietà di azioni biologiche e

salutistiche ascritte ai flavonoidi dipende in gran parte dalla loro capacità di bloccare il danno

provocato dai radicali liberi. In questo senso, essi vengono considerati avere attività analoga o

addirittura sinergica con l’acido ascorbico.

Per la loro elevata capacità di assorbire in tutto il range dell’ultravioletto, alcuni di questi

composti vengono considerati anche come potenziali filtri solari. Un filtro solare deve tuttavia

rispondere, oltre ad altri, al requisito della fotostabilità. Gli studi finora condotti hanno

riportato risultati discordanti: in alcuni casi l’irradiazione prolungata dei flavonoidi in

soluzione porta ad estensiva degradazione; in altri la molecola risulta stabile.

Abbiamo voluto riconsiderare l’effetto della luce ultravioletta su cinque flavonoidi:

quercetina, rutina, apigenina, galangina e genisteina. La fotostabilità dipende dalla posizione

del fenile nel sistema cromenico e dalla presenza dell’ossidrile libero in posizione 3. Infatti,

quercetina e galangina – che hanno il fenile in 4 e l’ossidrile in 3 – si degradano, mentre

rutina (ossidrile in 3 glicosilato), apigenina (H in posizione 3) e genisteina (fenile in 3) sono

stabili.

Per la quercetina è stato caratterizzato un prodotto che deriva dalla fotodegradazione, cui

segue l’immediata ossidazione ad opera dell’ossigeno atmosferico.

L’ipotetico intermedio di questo processo è strutturalmente molto simile all’acido ascorbico.

Un meccanismo simile sembra essere alla base della degradazione della quercetina in

ambiente acquoso alcalino, che avviene tuttavia senza il coinvolgimento della luce.

Al contrario, l’ambiente alcalino favorisce la fotodegradazione della genisteina che altrimenti

risulta fotostabile.

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STUDIES ON THE INFLUENCES OF HEAVY METALS AND HERBICIDES ON PHOTOSYNTHETIC MATERIALS BY USING OPTICAL ASSAYS

A. Ventrella1, 2, L. Catucci1, 2, G. Lobascio1, A. Agostiano1, 2

1Department of Chemistry, University of Bari, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici - CNR, Bari, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy.

[email protected].

The widespread use of toxic compounds like heavy metals or herbicides (i.e. triazine- or urea-

derivatives) in the industrial or in the agricultural fields has increased the interest in studying

the interactions between these species and the living organisms. In particular, the

photosynthetic organisms can modify their chemical and physical properties when they grow

or they are simply in contact with different kinds of pollutants. In this work, photosynthetic

materials, i.e. chloroplasts, thylakoid membranes, photosynthetic proteins were prepared from

spinach leaves, and then studied before and after the additions of heavy metal ions (copper,

mercury, nickel, manganese and cobalt) or herbicides (diuron, atrazine and terbutryn) through

the observation of changes in their activities by means of Hill Reaction optical assays and

fluorescence emission measurements.

It was noticed that copper and mercury showed intense inhibiting effects on the electron

transfers of each photosynthetic material tested, in a way that depended on the metal

concentrations; the other heavy metal under investigation did not affect significantly the

photosynthetic activities, in the range of concentrations analyzed (10-8-10-3 M).

Concomitantly, only copper was found to exert a remarkable influence on the fluorescence

emission intensity, especially on the photosynthetic membranes: actually, emission intensity

was found to decrease at higher copper concentrations. The Hill Reaction and the emission

assays on copper were found to respond at concentrations even below the Cu(II) legal limits.

The investigations on herbicides indicated that the electron transfers of each photosynthetic

material was strongly inhibited at concentrations of toxic species higher than 10-7 M. On the

other hand, the emission measurements showed that thylakoid membranes can easily respond

to the additions of every herbicide tested, since great increments in the emission intensities

were recorded by increasing the herbicide concentrations.

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EFFECT OF CYCLODEXTRINS ON MYCOTOXIN PHOTODEGRADATION

R. Verrone1,2, L. Catucci1,2, A. Agostiano1,2, V. Lippolis3, M. Pascale3

1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy [email protected] 2Istituto per i Processi Chimico Fisici-CNR, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy 3Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari-CNR, Via G. Amendola 122/O,

70126 Bari, Italy

Mycotoxins are toxic secondary metabolites occurring frequently in many foods and

beverages produced by several fungal species, mainly of the genera Aspergillus, Penicillium

and Fusarium. Physicochemical properties of mycotoxins depend on several factors, such as

solvent polarity or pH, and can be affected by the presence of cyclodextrins (CDs) [1-2]. In

this work, the effect of different CDs in several solvents on photodegradation of ochratoxin A

(OTA) and a fluorescent derivative of T-2 toxin with 1-anthroylnitrile (T2-AN) upon UV

steady-state irradiation has been investigated. Spectroscopic data showed that heptakis-2,6-di-

O-methyl- -CD (DIMEB) caused the most important changes in spectroscopic properties of

both OTA and T2-AN in pure water solutions. It was also proved that DIMEB affected

photodegradation in two different ways: it slowed down photodegradation rate of OTA

neutral form, whereas increased photodegradation rate of T2-AN in all tested solvents.

1. Y.V. Il’ichev, J.L. Perry, R.A. Manderville, C.F. Chignell, J.D Simon, J. Phys. Chem. B 105 (2001) 11369-11376

2. R. Verrone, L. Catucci, P. Cosma, P. Fini, A. Agostiano, V. Lippolis, M. Pascale, J. Incl. Phen. Macrocyc. Chem. 57 (2007) 475-479

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CARATTERIZZAZIONE DELL’AUTOFLUORESCENZA DI CELLULE DI NEUROBLASTOMA (SH-SY5Y) SOTTOPOSTE A CAMPO ELETTRICO

F. Cialdai1, M. Monici2, G. Romano1, S. Benvenuti1, P. Manetti3, F. Fusi1

1Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 2ASACampus, ASA Res. Div., Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 3Scienza e Tecnica dello Sport,

Università di Firenze

Molti tessuti sono sensibili a campi elettrici endogeni ed esogeni e presentano una spontanea

attività elettrica. Numerosi studi hanno dimostrato che i campi elettrici possono indurre una

quantità di effetti, come riorganizzazione del citoscheletro, ridistribuzione dei recettori di

superficie, cambiamenti nelle dinamiche del calcio intracellulare, migrazione, crescita di coni

neuronali, differenziazione cellulare, etc....

In campo clinico, l’elettroterapia è stata applicata con successo per il trattamento delle fratture,

per favorire i processi riparativi delle fibre nervose e la rigenerazione dei tessuti molli, nella

medicina sportiva ed anche associata alla chemioterapia.

Lo studio che descriviamo riguarda l’effetto di campi elettrici alternati (10KHz) sul

metabolismo energetico di cellule di neuroblastoma. La linea cellulare SH-SY5Y, utilizzata

per gli esperimenti, è riconosciuta come modello sperimentale per studi sulla differenziazione

neuronale ed emissione di dendriti.

Le caratteristiche scelte per il campo elettrico (in particolare ampiezza e frequenza) sono tali

da generare correnti con valori di circa 1-5 mA; tali valori sono caratteristici dei piu’ comuni

trattamenti di elettro-stimolazione muscolare, effettuati su pazienti attraverso l’applicazione di

tensioni alternate a media-alta frequenza (100Hz-10KHz).

L’effetto sul metabolismo energetico cellulare è stato studiato monitorando la fluorescenza

spontanea delle cellule, notoriamente imputabile ai coenzimi piridinici e flavinici nelle forme

ridotta ed ossidata, rispettivamente. Si sono utilizzate a questo scopo tecniche di microscopia

e spettroscopia di auto fluorescenza (AF).

I risultati preliminari dell’imaging di AF rivelano nei campioni trattati una diversa

distribuzione intracellulare dell’AF, rispetto ai controlli. In questi ultimi l’AF è diffusa e

distribuita in modo omogeneo, mentre nei trattati risulta organizzata e localizzata, con una

disposizione che sembra corrispondere a quella dei mitocondri. Parallelamente alle misure di

imaging è stata effettuata un’ analisi spettrale che rivela un significativo allargamento della

banda spettrale verso le lunghezze d’onda del rosso.

28

MICROSCOPIA LASER CONFOCALE A RIFLETTANZA PER LA VALUTAZIONE IN VIVO DI LESIONI MELANOCITARIE E TUMORI CUTANEI NON MELANOMA

Venturini M1, Sala R1, Manganoni AM1, Santoro A2, Facchetti F2, Calzavara-Pinton PG1.

1Clinica Dermatologica e MTS, Università degli Studi di Brescia, Spedali Civili di Brescia 2I° Servizio di Anatomia Patologica, Università degli Studi di Brescia, Spedali Civili di

Brescia

La microscopia laser confocale a riflettanza è una promettente ed innovativa tecnica di

diagnostica non invasiva che permette la visualizzazione in vivo ed in tempo reale di sezioni

tissutali ad alta risoluzione, sfruttando una sorgente di luce laser a diodi di 830 nm in grado di

fornire una valutazione “en-face” dell’epidermide e del derma superficiale (250-300 m)

attraverso “sezioni ottiche” orizzontali.

La fonte di contrasto è fornita dalle differenze nell’indice refrattivo delle diverse cellule

permettendo buone correlazioni isto-morfologiche in vivo con l’istologia classica sia della

cute normale sia della cute affetta da lesioni infiammatorie e neoplastiche (melanoma,

carcinoma basocellulare, cheratosi attiniche, carcinoma spinocellulare).

Il vantaggio di questa tecnica è l'immediatezza della diagnosi, la valutazione di una lesione in

vivo, la possibilità di verificare le modificazioni della lesione in seguito ad un trattamento

medico o chirurgico.

Lo scopo della nostra presentazione sarà quello descrivere tramite microscopia laser confocale

a riflettanza le caratteristiche in vivo delle lesioni melanocitarie e dei tumori cutanei non

melanoma.

29

BIOFUEL FROM MICROALGAE, EXPLOITING SOLAR ENERGY FOR FUTURE SUSTAINABILITY

Corteggiani Carpinelli E1, Sforza E 2 , Simionato D1, Longo S1 , Bertucco A2, Valle G 3Giacometti G M1, Morosinotto T1

1Department of Biology, University of Padova, via Ugo Bassi 58/B, 35121 Padova, Italy; 2Department of Chemical Engineering Principles and Practice, University of Padova, Via Marzolo 9, 35131 Padova, Italy ; 3CRIBI Biotechnology Centre, University of Padova, via

Ugo Bassi 58/B, 35121 Padova, Italy;

Biofuels may represent an important resource to balance CO2 emissions and replace

exhausting fossil fuels since they are made from non-toxic, biodegradable and renewable raw

materials.

One interesting perspective is to exploit microalgae for biofuels production, since they do not

compete for arable land with food production and they show high potential productivity.

In order to improve the efficiency of the process and make biofuels production from

microalgae economically competitive, we tested a number of microalgal species to select

strains capability for fast growth in photobioreactors and high lipid production and we

focused our attention on the eustigmatophyte Nannochloropsis. Furthermore we now aim to

optimise the biodiesel production of these microalgae using a biotechnological approach.

Such a perspective is at the moment strongly limited by the poor molecular characterisation of

the organism. To fulfil this gap in the actual knowledge we are now applying the latest DNA

sequencing technologies for de novo sequencing of nuclear and plastidial genomes of

Nannochloropsis gaditana to characterise lipid production in this organism at the molecular

level. The same techniques will be also applied to evaluate expression profiles in different

growing conditions, known to induce or inhibit lipid biosynthesis. The results of this work

will help identifying the limiting steps for lipid biosynthesis providing a framework for

genetic analysis of interesting traits, assisted selection of productive algal strains and for

subsequent genetic manipulations.

30

PHOTODYNAMIC THERAPY COMBINED WITH ASPIRIN CAUSES PROTEASOME MALFUNCTIONING AND PROMOTES APOPTOSIS OF HUMAN-DERIVED H1299 AND A549 LUNG

ADENOCARCINOMA CELLS

Angela Chiaviello1 and Giuseppe Palumbo1,2

1Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano” and 2Istituto di Endocrinologia ed Oncologia Sperimentale "G. Salvatore" – CNR, Università Federico II,

Naples, Italy

Purpose: We found that Photofrin/photodynamic therapy (PDT) at sub-lethal doses induced

only a transient stall in proteasome activity in the human lung carcinoma cell A549 (p53++)

and H1299 (p53--) as by the half-life lengthening of Bcl-2, I B and p27KIP1, proteins that

physiologically undergo proteasomal degradation. Since the same effects were obtained with

aspirin we evaluated whether the stall of the proteasome machinery could be protracted by

combining PDT with it and thus facilitate apoptosis of neoplastic cells surviving PDT.

Experimental Design: Of the treatment regimens tested, the most effective were those in

which aspirin was administered after PDT. Accordingly, cells were irradiated with fluences

varying from 0.54 to 1.10 Jcm-2 and then incubated with aspirin (from 10 to 1.5 mM).

Photofrin concentration and incubation time were constant (2.5 μg/mL and 16 h). Using these

conditions, we analyzed cell viability, colony-forming efficiency, cycle profiles, expression

patterns of specific proteins and ubiquitination state after individual and combined treatments.

Results: Alone, PDT and aspirin each transiently appeared to induce proteasomal malfunction

and accumulation of cells in G2M phase, but did not induce apoptosis. At variance, when

aspirin was added to cells after PDT, as a consequence of a sustained proteasome block, it was

observed a G2 accumulation, progressive caspase-3 activation and PARP cleavage. This

hypothesis was proved by direct monitoring of the proteasome activity in cells treated with

PDT or/and aspirin.

Conclusions: Protracted inhibition of proteasome using combinations of low-toxicity drugs

and PDT may improve PDT efficacy by killing apoptosis-resistant cancer cells.

31

ANALISI DI SECONDA ARMONICA NELLA SALDATURA LASER DELLA CORNEA

P. Matteini1, F. Ratto1, F. Rossi1, R. Cicchi2, C. Stringari2, D. Kapsokalyvas2, F.S. Pavone2,R. Pini1

1Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara”, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino, I-50019, Italy; 2LENS, European Laboratory for

Non-Linear Spectroscopy, Via Nello Carrara 1, Sesto Fiorentino, I-50019, Italy

La saldatura laser di tessuti connettivi realizzata attraverso la mediazione di un cromoforo

esogeno (Indocianina Verde) risulta un’alternativa di notevole interesse per la sigillatura di

ferite accidentali e incisioni chirurgiche, in grado di minimizzare le reazioni da corpo estraneo,

la formazione di cicatrici, nonchè i tempi di guarigione. In particolare, la saldatura laser della

cornea si sta affermando come una soluzione ideale a complemento di diverse applicazioni di

chirurgia oftalmica (~ 100 pazienti trattati presso l’Ospedale della Misericordia e Dolce di

Prato). Tra le problematiche inerenti, la possibilità di monitorizzare il progresso del

trattamento al livello ultrastrutturale in vivo rappresenta una frontiera di grande attualità.

Secondo la realizzazione più efficace, la saldatura laser comporta una sostanziale

disorganizzazione dell’architettura delle componenti fibrillari dei tessuti connettivi, senza

tuttavia indurne la denaturazione. Recentemente, abbiamo dimostrato la possibilità di valutare

lo stadio di tale disorganizzazione attraverso l’analisi di opportune sequenze di immagini di

microscopia di seconda armonica modulata in polarizzazione, una sonda minimamente

invasiva, virtualmente adatta per l’utilizzo in vivo, e particolarmente specifica per le fibre di

collagene. In particolare, discutiamo qui l’elaborazione di parametri semi-empirici

direttamente associati alla composizione di ordine e disordine nel reticolo delle fibre di

collagene su scale micrometriche e submicrometriche (con risoluzione laterale migliore di ~

400 nm). Oltre all’applicazione citata nel contesto della saldatura laser della cornea, il nostro

approccio può consentire lo sviluppo di uno strumento diagnostico importante, e attualmente

insostituibile, nella caratterizzazione di diverse deformazioni patologiche dell’architettura dei

tessuti connettivi.

32

SICUREZZA NELL’USO DEI LASER IN FOTOBIOLOGIA E FOTOMEDICINA

G. Romano1, L. Mercatelli2, A. Guasti3, F. Cialdai1, M. Monici4, F. Fusi1

1Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 2Istituto Nazionale di Ottica Applicata-CNR, Firenze; 3 Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze;

4ASACampus, ASA srl c/o Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze

Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente impiego di sorgenti laser nei laboratori di

ricerca ed ambulatori biomedici. Il loro ampio utilizzo in fotomedicina e fotobiologia, pero’,

non è stato accompagnato da un’altrettanto ampia attenzione a problematiche legate alla

sicurezza dell’utilizzatore e ad un possibile “inquinamento” del setup sperimentale dovuto

alla presenza di luce spuria (es.: riflessioni). Tali questioni, infatti, seppur ponendosi a latere

della misura o del trattamento terapeutico in questione, sono tuttavia di estremo interesse

anche ai fini dell’esecuzione di una “buona misura” o di un “buon trattamento”.

L’analisi delle succitate problematiche passa attraverso una conoscenza delle tipologie di

sorgenti laser, suddivise in base alle loro caratteristiche di emissione, ma anche attraverso

l’analisi degli effetti che si hanno quando tali sorgenti interagiscono con i vari materiali (es.:

superfici di vetro, metalliche, polimeri).

In questa comunicazione verrà in un primo tempo illustrata la classificazione dei laser in base

alle classi di pericolosità. Verranno quindi presentate e commentate alcune misure sulle

caratteristiche ottiche dei materiali (in particolare di riflettanza totale, speculare, a piccolo

angolo) effettuate nello spettro UV-visibile-vicino IR, traendo conclusioni su quali possono

essere le misure da adottare per minimizzare la presenza di radiazione luminosa indesiderata o

dannosa.

33

EVIDENZE PER UNA TRANSIZIONE GLOBULARE DEL DNA FORZA IONICA INDOTTA: UNO STUDIO DI LIGHT SCATTERING.

M. Zimbone1, P. Baeri1, M.L. Barcellona2, G. Li Volti2, G. Bonaventura2, O. Viscuso3

1Dipartimento di Fisica e Astronomia. 2Dipartimento di Chimica Biologica, Chimica Medica e Biologia Molecolare. 3Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Catania.

Lo studio e la conoscenza delle transizioni Coil-Globule che avvengono nel DNA senza

l’aggiunta di surfattanti cationici ricopre particolare importanza in ambito biologico sia per le

consequenze funzionali che la comprensione di tali meccanismi molecolari comporta, che per

la sua importanza nelle applicazioni biotecnologiche, come per es. vettori genici in sistemi

vettoriali non virali. Rilevante importanza riveste, inoltre, tale transizione per l’attività delle

topoisomerasi e per la modulazione della velocità di rinaturazione del DNA.

L’analisi dei processi di condensazione del DNA può essere effettuata attraverso diverse

tecniche tra le quali il dynamic light scattering (DLS) capace di monitorare cambiamenti nelle

sue caratteristiche idrodinamiche alle quali conseguono transizioni conformazionali.

Sono state analizzate molecole di DNA naturali all’interno di un intervallo di pesi molecolari

compreso tra 102 e 105 paia di basi. Sono state registrate le funzioni di autocorrelazione per

diversi valori del vettore di scattering da cui è stato calcolato il coefficiente di diffusione e

quindi il raggio idrodinamico per i diversi campioni di DNA in funzione della lunghezza della

catena, espressa come paia di basi, e delle condizioni sperimentali (forza ionica, pH).

Le analisi effettuate attraverso la tecnica del DLS indicano che le molecole di DNA con un

numero di paia di basi superiore a 105 nelle nostre condizioni sperimentali, (100mM Na+)

condensano in strutture compatte mentre molecole di lunghezza inferiore si avvicinano al

modello ‘random coil’, dove la lunghezza di persistenza è più piccola della lunghezza del

polimero. I dati ottenuti sono stati comparati con i dati riportati in letteratura per alcuni

modelli standard di polimeri in soluzione e la discrepanza tra i nostri dati e le teorie di

Mansfield e Douglas (1) per le catene corte e di Rouse-Zimm per le lunghe è stata discussa. I

nostri risultati, confortati anche da osservazioni ottenute attraverso la microscopia elettronica,

dimostrano che il rapporto raggio idrodinamico-gyration radius è direttamente dipendente

dalle dimensioni del polimero analizzato e che, anche ad una concentrazione ionica come

quella da noi utilizzata, la molecola del DNA và incontro ad una transizione, indicata come

condensazione, paragonabile a quella che in letteratura viene riportata solo in presenza di

agenti surfattanti. (1) Mansfield M., Douglas J. Macromolecules, 2008,41,5422.

34

1 m

AFM image of a chromate exposed R. sphaeroides cell

STUDIO DELLA RISPOSTA METABOLICA DI CELLULE DI RHODOBACTER SPHAEROIDESESPOSTE A STRESS ABIOTICO DA IONI CROMATO

F. Italiano1, F. Milano1, L. Giotta2, L. R. Ceci3, F. De Leo3, R. Gallerani4, L. Zolla5, A. Timperio5, A. Agostiano1 e M. Trotta1

1Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, Bari; 2Dipartimento di Scienza dei Materiali – Università del Salento; 3Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, CNR, Bari; 4Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare –Università di studi di Bari; 5Dipartimento di Scienze

Ambientali –Università della Tuscia, Viterbo

Rhodobacter (R.) sphaeroides è un batterio fotosintetico facoltativo metabolicamente versatile noto per la sua capacità di crescere in ambienti con elevato contenuto di ioni metallici tossici, tra cui CrO4

2-, e di bioassorbirne quantità significative, che si localizzano sia a livello della superficie esterna che del corpo cellulare1,2. La risposta metabolica all’esposizione a stress abiotico da cromato è qui presentata in dettaglio. R. sphaeroides è in grado di crescere fino ad una concentrazione di cromato pari a 0.4 mM. Si osserva, inoltre, un incremento della durata della fase lag all’aumentare della concentrazione di CrO4

2- nel mezzo di crescita, presumibilmente dovuto all’induzione di meccanismi di adattamento. Il microrganismo presenta una attività cromato-reduttasica principalmente legata alla frazione cellulare solubile. I dati ottenuti indicano l’esistenza di un meccanismo di resistenza basato sulla riduzione intra ed extra-cellulare di cromato e sulla conseguente immobilizzazione di Cr3+ all’interno della cellula. L’analisi proteomica degli estratti cellulari solubili di cellule cresciute in condizioni controllo ed in presenza di cromato ha consentito di ottenere numerose informazioni sulla risposta metabolica a tale contaminante. L’esposizione a CrO4

2- determina un’alterazione dell’espressione di 75 proteine solubili coinvolte nel metabolismo energetico, nella difesa dallo stress ossidativo, nel riparo di proteine e DNA, nella biosintesi di aminoacidi solforati e tioli, in processi di trasferimento elettronico, nella biosintesi della parete cellulare. In particolare, l’espressione differenziale degli enzimi D-alanina-D-alanina ligasi e dTDP-glucosio 4,6-deidratasi potrebbe indicare una variazione della composizione della parete cellulare ed un’alterazione della morfologia cellulare in accordo con quanto riportato in letteratura per E. coli3. Tali indicazioni sembrano confermate da preliminari indagini condotte mediante AFM, tecnica che consente, in condizioni fisiologiche, di ottenere immagini ad alta risoluzione della struttura cellulare e di studiarne le caratteristiche di elasticità e rigidità e come queste siano influenzate dalla esposizione al metallo4.1. Buccolieri, A. et al, Ann Chim -Rome 2006, 96, 195-204. 2. Giotta, L.; et al. Chemosphere 2006, 62, (9), 1490-1499. 3. Ackerley, D. F.; et al. J Bacteriol 2006, 188, (9), 3371-81. 4. Ubbink, J.; Schar-Zammaretti, P., Micron 2005, 36, (4), 293-320.

35

SWITCH FROM INHIBITION TO ACTIVATION OF THE MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION DURING HEMATOPORPHYRIN-MEDIATED PHOTOOXIDATIVE STRESS

Justina Šileikyt , Alessandra Zulian, and Fernanda Ricchelli

C.N.R. Institute of Biomedical Technologies at the Department of Biology, University of Padova, Italy

The mitochondrial permeability transition (PT) features an abrupt increase of mitochondrial

inner membrane permeability to solutes with molecular masses up to about 1500 Da. PT

results from opening of a protein channel, the mitochondrial permeability transition pore

(PTP), that is formed under certain pathological stimuli, most notably as a result of calcium

overload and oxidative stress. Although the molecular structure of PTP has yet to be

identified its role as a mechanism for the execution of cell death is no longer questioned.

We have studied the mitochondrial permeability transition pore (PTP) under oxidizing

conditions with mitochondria-bound hematoporphyrin, which generates reactive oxygen

species (mainly singlet oxygen, 1O2) upon UV/visible light-irradiation and promotes the

photooxidative modification of vicinal targets. We have characterized the PTP-modulating

properties of two major critical sites endowed with different degrees of photosensitivity: (i)

the most photovulnerable site comprises critical histidines, whose photomodification by

vicinal hematoporphyrin causes a drop in reactivity of matrix-exposed (internal), PTP-

regulating cysteines thus stabilizing the pore in a closed conformation; (ii) the most

photoresistant site coincides with the binding domains of (external) cysteines sensitive to

membrane-impermeant reagents, which are easily unmasked when oxidation of internal

cysteines is prevented. Photooxidation of external cysteines promoted by vicinal

hematoporphyrin reactivates the PTP after the block caused by histidine photodegradation.

Thus, hematoporphyrin-mediated photooxidative stress can either inhibit or activate the

mitochondrial permeability transition depending on the site of hematoporphyrin localization

and on the nature of the substrate; and selective photomodification of different

hematoporphyrin-containing pore domains can be achieved by fine regulation of the

sensitizer/light doses. These findings shed new light on PTP modulation by oxidative stress.

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STRUCTURAL AND REGULATORY FACETS OF THE OPSIN-LIKE VISUAL PIGMENTS IN HYDRA

Silvia Santillo, Carlo Musio

Istituto di Cibernetica “E. Caianiello”, CNR, 80078 Pozzuoli (NA)

Novel opsins are non-image forming (or non-visual) photopigments which have been recently

identified in retinal and extraretinal photoreceptor cells of both vertebrates and invertebrates.

Such novel opsins detecting environmental irradiance integrate canonical visual function and

regulate physiological and behavioral rhythms. We are aimed to investigate diurnal and

circadian opsin expression oscillations in the cnidarian Hydra, an eyeless old metazoan

having only a non-visual photoreception and showing the first appearance of a nervous

system. To this regard, we have selected vertebrate opsin-like sequences - possibly related to

visual and non-visual opsin types - expressed in Hydra and available in the Hydra EST

database (GeneBank CN775258, CN554795; CB073527, DT617488). Quantitative RT-PCR

has showed fluctuations with different trends for daily and circadian cycles suggesting that

rhythms are possibly endogenous and that light has a direct role in the regulation of the

photopigment molecule supply. A recent study on Hydra genomic organization of

photopigments has proposed a large amount of distinctive opsins by means of genome

assemblies of various organisms (Hydrazome database, http://hydrazome.metazome.net). As

support for the suitability of our selected Hydra EST opsin sequences, we found in

Hydrazome that two sequences (CB073527 and CN554795) are aligned on the same contig

39347 spanning from the position 487820 to 488855. Moreover they partially overlap to form

a unique EST transcript assembly (ace7004.yi.0). The predicted peptide sequence (Hma2

233963) presents homologies with various novel vertebrate opsins including those of the

human and mouse retinal pigment epithelium. Above all, Hma2 233963 presents Tyr in the

counterion position which is an identifying structural marker of the majority invertebrate

opsins as well as of some novel vertebrate opsins (in particular melanopsin and peropsin).

Altogether those data are consistent with the hypothesis of a putative common evolutionary

similarity between vertebrate novel opsins and invertebrate opsins. In conclusion the bulk of

above results strengthens our goal to study Hydra visual pigments facing the photoregulation

of the opsin gene expression and the comparative sequence analysis. Both approaches are

addressed to a better understanding of the evolution of opsin visual pigments and overall of

the light sensing modality in Metazoa.

37

SPATIAL DISTRIBUTION OF PIGMENTS IN SELECTED HETEROTRICH CILIATES BY MEANS OF MULTIDIMENSIONAL CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY

Andrea Pardini1, Ranieri Bizzarri2,2b, Alberto Diaspro3,3b, Paolo Bianchini3, Cesare Usai1,Paola Ramoino4, Giovanni Checcucci1 and Giuliano Colombetti1

1Istituto di Biofisica, CNR, Italy; 2NEST, Scuola Normale Superiore, Italian Institute of Technology UdR, Pisa, Italy; 2bNEST, CNR-INFM; 3LAMBS, Dept. of Physics, Univ. of

Genova, Genova, Italy; 3b Neuroscience and Brain Technology Department, IIT, Morego (GE), Italy; 4DIPTERIS, Univ. of Genova, Genova, Italy

Some colored heterotrich ciliates, like Blepharisma japonicum and Fabrea salina,

show photomotile responses triggered by endogenous pigments of the hypericin family.

B. japonicum exists in two forms: the wild one contains red blepharismin, the other one,

generated by irradiating the cells with dim visible light, blue blepharismin. B. japonicum

shows step-up photophobic response, whereas F. salina, that contains fabrein, a

hypericin-like pigment the molecular structure of which is unknown, shows step-down

photophobic responses and positive phototaxis.

We showed by confocal microscopy that the pigments are localized not only in

pigment granules, but also in the cilia, the motor organelle of these protista. . This fact implies

that the structure of the pigment in the cilia differs from that in the cell body, (being pigment

granules too big to be accommodated in the axoneme) and suggests that ciliary pigments

might play a decisive role in photoreception.

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) shows that there is a spatial

distribution of lifetimes, which are, for every type of organism, shorter for the pigment in the

cilia. This might indicate a functional role for these pigments. Furthermore, lifetimes for

F. salina are always longer than those of B. japonicum. In order to further characterize the

structure of ciliary pigments by means of spectroscopic methods, we have also performed

spatially resolved static and time-resolved fluorescence anisotropy measurements.

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SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI SQUARAINE COME FOTOSENSIBILIZZATORI NELLA TERAPIA FOTODINAMICA

M. Camerin1, M. Soncin1, V. Rapozzi4, L. Beverina2, F. Ricchelli3, G. Pagani2 e G. Jori1

1Dipartimento di Biologia, Università di Padova, Padova, Italia; 2Dipartimento di Scienze dei

Materiali, Università di Milano-Bicocca, Milano, Italia; 3Istituto per le Tecnologie Biomediche CNR, Padova, Italia, 4Sezione Biochimica –Dipartimento di Scienze e

Tecnologie Biomediche – Università di Udine. La terapia fotodinamica è attualmente applicata su vasta scala per il trattamento di numerosi

tipi di tumore solido. I limiti dimostrati da fotosensibilizzatori “di prima generazione”

(porfirine), quali un basso coefficiente di estinzione molare nella regione 600-700 nm o

l’induzione di fotosensibilità cutanea persistente in seguito a esposizione alla luce, hanno

portato a sintetizzare e sperimentare fotosensibilizzatori “di seconda generazione”. In tale

direzione si inserisce questo progetto che ha lo scopo di testare una classe di molecole, le

squaraine, come fotosensibilizzatori nella terapia antitumorale. Le squaraine derivano dalla

condensazione di acido squarico e molecole elettrofile (es. anilina, pirroli) e sono attualmente

studiate come possibili componenti attivi in numerose applicazioni tecnologiche tra le quali

elettrofotografia, memorie ottiche e celle solari. La loro caratteristica principale è quella di

possedere bande di assorbimento elettronico molto strette localizzate nella regione del vicino

infrarosso con coefficienti di estinzione molare estremamente elevati.

Studi preliminari hanno evidenziato la possibilità di incorporare questi composti in liposomi

di dioleilfosfatidilcolina (DOPC) che consentono la loro veicolazione in modelli tumorali

dopo somministrazione sistemica. Su queste basi sono stati condotti in topi C57BL/6 portatori

di melanoma amelanotico studi di farmacocinetica e fototerapia sperimentale.

39

EVALUATION OF PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF PHOTOSYNTETIC PIGMENT/CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES BY MEANS OF PRIMARY ACCEPTORS

B.M. Cellamare1, P. Cosma1,2, P. Fini2, A. Ventrella1, A. Agostiano1,2

1 Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, I-70126 Bari, Italy, 2Istituto per i Processi Chimico Fisici - CNR, Bari, Via Orabona 4, I-70126 Bari, Italy.

In order to treat certain types of malignant tumours and hyperproliferative diseases often

photodynamic therapy (PDT) is used. It is based on the use of photosensitizer (PS), herein the

chlorophyll a (Chl a), and a light having appropriate wavelength. The PS interacts with the

light producing ROS, reactive oxygen species, a powerful oxidizing agents that cause critical

damage to the tissue. It is necessary that the chlorophyll molecule is in a monomeric form.

Then in order to solubilise it in aqueous solution, we have used cyclodextrins, carriers which

are able to interact with the pigment and form the inclusion complex. The aim of this work is

to examine which type of ROS are formed in the system using specific molecules, named

primary acceptor, that react selectively with the reactive species. In fact the changes of the

absorption and the emission spectra of this molecules after the illumination of the PS provide

information on the specific ROS formation. The most effective ROS in the oxidative damage

is the singlet oxygen (1O2). Uric acid, 9,10-diphenilanthracene and singlet oxygen sensor

green (SOSG) were used as primary acceptors in order to verify the formation of the 1O2.

Moreover 2,7-dichlorofluorescin and ferricytochrome c were used to observe the presence of

the hydrogen peroxide (H2O2) and the formation of superoxide radical anion (O2·-) that

reduces Fe3+ of the ferricythcrome to Fe2+ respectively.

40

THE EFFECT OF PHOTODYNAMIC TREATMENT COMBINED WITANTIBIOTIC ACTION OR HOSTDEFENCE MECHANISMS ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS BIOFILMS

A. Di Poto1,2, M.S. Sbarra1,2, L. Visai1,2, P. Speziale1

1University of Pavia, Department of Biochemistry, Viale Taramelli 3/b, 27100 Pavia, Italy; 2University of Pavia, Center for Tissue Engineering, Via Ferrata 1, 27100 Pavia, Italy

Introduction

Staphylococcus aureus is one of the most important etiological agents of infections associated

with medical devices. This is in part due to the ability of the organism to form biofilm, which

provides a microenvironment that protects from attack by the host’s immune system and by

antibiotics. In this study we examined the structure of polysaccharide intercellular adhesin

(PIA)-dependent or protein-based S. aureus biofilms. We defined new strategies aimed at

treatment of mature established biofilms using photodynamic treatment (PDT) combined with

chemotherapy or phagocytosis.

Materials and Methods

Bacterials strains: S. aureus BH1CC, S. aureus SA113 and S.aureus V329 were routinely

grown overnight in tryptic soy broth (TSB) (S. aureus SA113 and S.aureus V329) and in

brain heart infusion (BHI) (S. aureus BH1CC) under aerobic conditions at 37°C.

Materials: A stock solution of 1 mM TMP was prepared in PBS. TMP-treated biofilms were

irradiated at different light doses by means of white light (400–800 nm) isolated from the

emission of a tungsten lamp.

Methods: PDT, MIC assays, phagocytic assay, confocal analysis CLSM (model TCS SPII;

Leica, Heidelberg, Germany); SEM (model EVO 50 EP; Zeiss-Leica, Cambridge, UK).

Results and Discussions

Significant inactivation of bacteria was observed when structurally distinct biofilms were

exposed to the cationic porphyrin, tetra-substituted N- methyl-pyridyl-porphine (TMP), and

simultaneously to visible light.

Moreover, PDT-treated biofilms exposed to vancomycin or subjected to the phagocytic action

of whole blood resulted in their almost complete eradication. The drastic reduction in

staphylococcal survival and the disruption of biofilms were confirmed by confocal laser

scanning microscopy and scanning electron microscopy. The results suggest that PDT

combined with vancomycin and the host defences may be a useful approach for the

inactivation of staphylococcal biofilms adhering to medical implant surfaces.

Indice degli Autori

A Agostiano 9; 17; 25; 26; 34; 39 Altamura 23 Asztalos 2

B Baeri 33 Barcellona 33 Barone 16 Bassi 15 Beccarisi 18 Benvenuti 27 Bertucco 29 Beverina 38 Bianchini 37 Bizzarri 37 Blasi 14 Bonaventura 33 Bottalico 20

C Caffieri 24 Calzavara-Pinton 5; 28 Camerin 38 Carrieri 9 Cataldo 18 Catucci 17; 25; 26 Ceci 19; 34 Cellamare 39 Checcucci 37 Chiaviello 30 Cialdai 27; 32 Cicchi 31 Ciriaco 20 Colombetti 37 Compagnin 10 Comparelli 9 Corcelli 17 Corricelli 9 Corteggiani Carpinelli 29 Cosma 39 Curri 9

D D’Agostino 18 D’Andrea 11 Dall’Acqua F. 4 Dall’Acqua S. 24 De Leo F. 34 De Leo V. 17 De Stefano 12 Depalo 9 Di Paolo 19 Di Poto 40 Diaspro 37

F Fabris 6 Facchetti 28 Fini 39 Foltran 8 Foresti 8 Frascati 20 Fusi 27; 32

G Gallerani 19; 34 Gevi 14 Giacometti 15; 29 Giomini 21 Giorgetti 15 Giotta 22; 34 Giustini 21 Guasti 32

H Husu 21

I Improta 16 Italiano 19; 22; 34

J Jori 38

K Kapsokalyvas 31

L Lami 16 Lelli 8 Leoni 19 Lesci 8 Li Volti 33 Lippolis 26 Lobascio 25 Longo 29

M Mallardi 21 Mancin 10 Manetti 27 Manganoni 28 Marchetti 8 Maróti 2 Mastrogiacomo 22 Matteini 31 Mavelli 23

Mercatelli 32 Milano 17; 20; 22; 23; 34 Miolo 24 Monici 27; 32 Moret 10 Morosinotto 15; 29 Musio 36

P Pagani 38 Palazzo 21 Palumbo 30 Papini 10 Pardini 37 Pascale 26 Pavone 31 Pellegrino 3 Pierini 8 Pini 31

R Ramoino 37 Rapozzi 38 Ratto 31 Reddi 10 Ricchelli 35; 38 Rio Echevarria 10 Romano 27; 32 Rossi 31 Roveri 8

S Saga 15 Sala 28 Santillo 36 Santoro A. 28

Santoro F. 16 Sbarra 40 Segat 10 Selvestrel 10 Sforza 29 Šileikytė 35 Simionato 29 Soncin 38 Speziale 40 Striccoli 9 Stringari 31

T Tavano 10 Timperio 14; 34 Trotta 19; 20; 22; 23; 34

U Usai 37

V Valle 29 Valli 22 Ventrella 25; 39 Venturini 28 Verrone 26 Visai 40 Viscuso 33 Volpicella 19

Z Zimbone 33 Zolla 14; 34 Zulian 35

Locorotondo, 4-5 Giugno 2009

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