Terapia genica La terapia genica l'inserzione di geni nelle cellule e nei tessuti di un individui per trattare malattie genetiche, e malattie ereditarie nelle quali un allele mutato rimpiazzato con uno funzionale. Lo scopo , quindi, finalizzata alla correzione di un errore del metabolismo, aggiungere una nuova funzione (terapia additiva), eliminare un prodotto cellulare (terapia ablativa). L'introduzione del gene all'interno delle cellule avviene attraverso un vettore virale o non virale. Il vettore agisce solo su un gruppo di cellule bersaglio. E l'inserzione pu avvenire in vivo o ex vivo. Vettore ideale Le caratteristiche ideali di un vettore per terapia genica sono: Tropismo di espressione per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule. Durata di espressione per far s che la terapia duri nel tempo. Livello di espressione possibilmente regolabile. Efficacia clinica previ test funzionali su modelli animali. Scarsa tossicit. Barriere Il vettore per raggiungere il suo scopo deve superare diverse barriere cellulari ed extracellulari. Barriere cellulari per il trasferimento di dna all'interno della cellula sono ad esempio membrane citoplasmatiche e nucleari, lisosomi, endonucleasi. I vettori prima di venire espressi sostano da poche ore come gli adenovirus (48h) ad alcuni giorni come gli adeno-associati. In questo periodo rimangono esposti ovviamente a tutti gli enzimi proteolitici e nucleasici, che possono degradare il vettore e/o il suo contenuto. Barriere extracellulari per il passaggio del vettore dal punto di somministrazione alla cellula bersaglio sono la barriera ematoencefalica, il sistema immunitario e fluidi corporei. L'organismo infatti pu sviluppare una risposta immunitaria contro il vettore cos da impedire ulteriori somministrazioni, oltre a barriere fisiche come la bee. Durata della trasduzione Pu essere stabile o transiente. Espressioni stabili sono preferibili per malattie metaboliche. Espressioni transienti sono preferibili per vaccini e tumori. Bisogna tenere conto ovviamente se la cellula si replica. Infatti bisogner scegliere vettori che si integrano nel genoma se si vuole che il gene non si perda alla prima replicazione. Ma vanno bene anche vettori che non si integrano per cellule che non si replicano mai, come i neuroni. In/Ex vivo La TG in vivo prevede l'introduzione del dna che esprime il gene direttamente nell'organismo. Il vettore viene iniettato endovena e se ne pu regolare la quantit e le possibili reazioni avverse. Poi infetter solamente le cellule interessate grazie al tropismo selettivo. La TG ex vivo prevede l'espianto di cellule dal paziente, la loro infezione, e il successivo reimpianto nell'organismo. Per questa tecnica non adatta per le malattie metaboliche, in quanto non vengono curate tutte le cellule. Transgene Ne esistono vari tipi: cDNA, cassette biscistroniche, minigeni, oligoNt e rna-decoy. cDNA la sequenza complementare all'mRNA che codifica per la proteina che si vuole far produrre. Solitamente si cerca di introdurre alcuni introni per rendere la sequenza pi simile alla normalit (ha un'efficacia maggiore). Sono spesso di piccole dimensione e quindi facili da inserire in molti vettori, per sono meno stabili in quanto mancano siti di attacco alla membrana nucleare tipici delle sequenze introniche naturali. L'espressione molto condizionata dalla presenza/assenza di promotori, enhancers, segnali di polyA (anche se quest'ultimo non molto influenzante). La cassetta biscistronica particolarmente indicata quando l'attivit del transgene difficilmente monitorabile. La cassetta biscitronica praticamente una sequenza che codifica per 2 geni. Il secondo gene spesso un gene reporter il cui inizio di traduzione correlato a una IRES (internal ribosomal entry site) e la cui quantit di proteina espressa direttamente correlabile alla quantit di proteina espressa del primo gene, che quello terapeutico. Il minigene un derivato dell'intero gene, che ha alta stabilit e quindi alti livelli di espressione. Sono simili ai geni originari con la differenza che vengono escisse tutte le zone non strettamente necessarie alla funzione della proteina come ad esempio le sequenze introniche, che sono comunque conservate in parte in maniera da mantere una cerca somiglianza all'originale. Sono utilizzati nel caso in cui si voglia trasportare nel vettore

geni di grandi dimensioni come quello della distrofina. Anche se si cerca di eliminare e snellire la sequenza il minigene risulta spesso molto grande e quindi adatto solo a vettori ad alta capacit. Gli oligoNt e gli RNAdecoy sono facili da ottenere purificati e in alta quantit, purtroppo, per, la loro espressione quasi sempre transiente. Hanno funzione solamente inibitoria in quanto si legano per complementariet all'mRNA facendolo riconoscere come esogeno e degradare, oppure al DNA formando una tripla elica che impedisce la trascrizione. Geni Reporter I geni reporter sono transgeni facilmente evidenziabili tramite istochimica o metodi immunologici e sono utilizzati per monitorare l'efficienza del vettore in quanto la loro presenza strettamente correlata a quella del vettore. Esistono reporter secreti nel torrente circolatorio e quindi facilmente dosabili in da un prelievo di sangue, ideali per monitorare la durata e il livello di espressione e reporter intracellulari ideali per analisi di tropismo e tessuto specificit mediante l'analisi di reperti istologici. Esempi di geni reporter secreti sono la alfa-1-fetoproteina, la alfa-1-antitripsina e la SEAP (fosfatasi alcanina secreta). Esempi di geni reporter intracellulari sono la beta-galattosidasi (colora le cellule di blu metabolizzando un cromoforo), GFP (green fluorescence protein), CK, luciferasi. La loro presenza rilevata o tramite substrati cromofori metabolizzati da questi enzimi oppure tramite fluorescenza intrinseca a queste proteine. Analisi dell'animale da laboratorio Oltre all'analisi diretta dei tessuti, biopsie, che prevedono il sacrificio dell'animale, sono applicabili tutte le tecniche utilizzate anche sull'uomo come la micro-tc, la micro-pet. Pu anche essere analizzata la bioluminescenza sfruttando la luciferasi espressa nei tessuti infettati, che emette luce se viene somministrata luciferina all'animale. Vettori virali Sono il modo pi semplice di introdurre DNA esogeno nelle cellule, dato che nella natura dei virus. Un vettore virale non fa altro che sfruttare la struttura lipoproteica di un virus per veicolare il DNA terapeutico interessato, sostituendo semplicemente il genoma virale con il gene di nostro interesse. In questo modo il virus sar capace di infettare le cellule e far integrare il gene terapeutico nel genoma ospite, senza per creare danni o replicarsi ulteriormente. I vettori virali pi utilizzati in terapia genica sono gli adenovirus, i retrovirus, i virus adeno-associati, i lentivirus hiv-derivati e gli herpesvirus. Ognuno di questi presenta i propri pro e contro che lo rendono adatto a certi tipi di esperimenti e non altri. Adenovirus Sono membri della famiglia degli adenoviridae, che hanno un genoma virale di 36Kb di DNA a doppio filamento, sono dotati quindi di un'alta capacit. Sono capaci di infettare cellule post-mitotiche in tessuti altamente differenziati. Gli adenovirus infettano normalmente mammiferi (mastadenoviridae) o uccelli (aviadenoviridae) causando cheratocongiuntiviti o affezioni polmonari, per questo motivo molti di noi hanno Ab anti-adenovirus. La presenza di questi anticorpi pu impedire, ovviamente, che il vettore raggiunga il suo scopo, venendo fermato dal sistema immunitario non appena immesso in circolo. Sono divisi in 3 generi e 6 sottogruppi e poi ulteriormente suddivisi in sierotipi e potenziale oncogenicit. Quest'ultima dovuta al fatto che il gene integrandosi random nel genoma ospite pu rompere la normale sequenza di un gene o inserirsi al posto di promotori od enhancers. Il tipo pi sfruttato in TG l'Ad5 sottogruppo C, scelto per l'assenza di oncogenicit. Nel 1967 una classificazione, proposta da Vilmer, che teneva conto della capacit di agglutinare le emazie di Macacus rhesus e di ratto, comprendeva 28 tipi umani e 18 sierotipi di animali inferiori. Nell'ultima recente classificazione gli adenovirus vengono raggruppati in due generi (Fermer 1996): - Adenovirus dei mammiferi: MASTADENOVIRUS - Adenovirus degli uccelli: AVIADENOVIRUS. Il primo genere Mastadenovirus comprende 33 membri umani definiti e 2 probabili; 24 definiti di primati; 9 definiti di bovini; 4 definiti e 1 possibile dei suini; 5 definiti e 2 possibili degli ovini 1 definito del cavallo ecc. complessivamente 78 definiti, 4 probabili e 7 possibili. Il secondo genere degli Aviadenovirus comprende 11 definiti 7 possibili e 1 probabile. La suddivisione in sottogruppi: A, B, C, D avviene a seconda della oncogenicit, alta (A), bassa (B) o assente (C-D), basata sulla presenza di manifestazioni tumorali in criceti neonati infettati con tali virus. Il sottogruppo A causano tumori entro 2 mesi dalla inoculazione il sottogruppo B in un periodo compreso tra

i 4 ed i 18 mesi. Il patrimonio G-C correlato alla oncogenicit dei virus (Pina e Green, 1965): sembra che i virus pi oncogeni del gruppo A abbiano un contenuto G-C del 48-49%, mentre quelli meno oncogeni del gruppo B, del 50-52% ed in quelli privi di oncogenicit del gruppo C e D del 57-60% (Pina e Green, 1965; Green 1970). Negli Adenovirus di scimmia questi rapporti sono differenti, essendo stato notato, ad esempio, che il tipo SA7, fortemente oncogeno, ha un contenuto G-C di circa il 60% (Pina e Green, 1968; Goodheart, 1971). Struttura dell'adenovirus L'adenovirus non ha envelope, ma un capside organizzato in esoni e pentoni con fimbre deputate al riconoscimento recettoriale. Il capside ha forma icosaedrica, quindi con 12 vertici. Ai vertici sono posizionati i pentoni e le finbre protrudono da essi. I pentoni hanno propriet simili a una tossina e determina un effetto citopatico anche in assenza di tutte le altre componenti. Nonostante ci la fibra la componente pi tossica ed anche la prima responsabile della risposta immunitaria. Le fibre interagiscono con la proteina CAR recettore sulla cellula e poi questa interazione viene stabilizzata legando integrine di membrana con la regione RGD del pentone. La prima interazione capace di attivare il pathway della PI-3K. La seconda interazione capace di attivare le MAPK con produzione di IL8. Il DNA contenuto nel core avvolto su proteine hyston-like e altre proteine strutturali. Il genoma adenovirale ha agli estremi 2 sequenze ripetute invertite, chiamate ITR, essenziali per la replicazione. La ITR al 3' subito seguita da una sequenza "psi" che costituisce il segnale di packaging, cio la sequenza riconosciuta dalle proteine virali che vi si assemblano intorno e impacchettano il DNA. Queste 2 sequenze sono entrambe essenziali per l'assemblaggio del vettore. I geni adenovirali sono distinti in geni della fare precoce (early) e della fase tardiva (late). Alcuni locus genici sono sovrapposti su uno stesso filamento, alcuni altri su 2 filamenti in cui il 3' codifica dei geni e il 5' altri. I locus sono E1, E2, E3 ed E4 per la fase early e un unico locus L per la fase late. I geni della fase early servono ad evadere dal sistema immune e a indurre la cellula ad entrare nella fase S per consentire al virus di replicarsi. E1A stimola l'entrata in fase S E1B un fattore trascrizionale E2A DNA-binding protein E2B DNA-polimerasi E3 evasione dal sistema immune E4 coinvolto nel metabolismo virale Inizia poi la fase di replicazione. In questa fase sono necessarie le ITR ed mediata dalla polimerasi virale che capace di replicare 10000-100000 copie di genoma per cellula. La fase late comincia con la riattivazione del MLP (major late promoter), che era attenuato nella fase early. Si attua l'incapsidamento mediato dall'interazione col segnale "psi", viene permeabilizzata la membrana plasmatica e infine disintegrata la membrana cellulare per permettere la fuoriuscita delle particelle virali. Il genoma virale anche se viene introdotto all'interno del nucleo non si integra all'interno del genoma, ma resta sottoforma di episoma. Per questo gli adenovirus sono pi adatti per un'espressione transiente. Vantaggi/Svantaggi degli adenovirus infettano cellule post-mitotiche in tessuti altamente differenziati hanno alto tropismo epatico con somministrazione ev i vettori Ad possono essere preparati ad alto titolo possono veicolare cassette di espressione di grosse dimensioni non si integrano nel dna I generazione degli adenovirus Sono vettori RDA (replicant deficient adenovirus), ottenuti per delezione dei geni E1/E3. La funzione di E1 viene fornita da cellule hek293 modificate in maniera da diventare "permissive". C' rischio che si riformi il virus wild-type perch il genoma del vettore pu ricombinare con la regione codificante per E1 nelle 293. Per ridurre il rischio di ricomparsa di RCA (replicant competent adenovirus) si possono usare cellule PER.C6 al posto delle HEK293. Oltre al rischio di comparsa di vettori RCA, questi vettori presentavano bassi livelli di espressione in vivo, alta tossicit epatica e una limitata durata di espressione anche connessa alla tossicit. II generazione degli adenovirus

Vengono ottenuti facendo una delezione dei geni E1/E3 pi E2 e/o E4. In questo modo diminuisce la probabilit di ricombinazione e contaminazione da RCA. Le funzioni E2, E4 sono supplite anche in questo caso dalle HEK293, mostrano assenza di replicazione in vivo e diminuita contaminazione da RCA. Purtoppo a parte questo restano tutti gli altri svantaggi come la breve durata di espressione, bassi livelli di espressione e la stessa tossicit epatica. Vettori adenovirali helper-dependent o gapless Sono ricavati dalla delezione di tutto il genoma virale escluse se sequenze ITR e psi necessarie per il packaging. Sono vettori RDA e data la totale assenza di tutti i geni virali necessitano di virus-helper per la replicazione. In questo sistema le cellule HEK293 permissive vengono coinfettate con il dna del vettore pi il dna di virus di prima generazione. Il virus di prima generazione fornir tutte le funzioni necessarie alla replicazione del dna del vettore. Per evitare l'impacchettamento del genoma del virus di prima generazione, la sua sequenza psi fiancheggiata da 2 siti loxP. Dato che le cellule HEK293 sono state modificate in maniera da esprimere la CRE-recombinasi, quest'enzima riconoscer i siti loxP excidendo il DNA contenuto fra essi. In questo modo il virus helper fornir tutte le sue funzioni, ma non verr impacchettato poich manca della sequenza psi. I vantaggi di questi vettori helper-dependent sono l'alta capacit visto che il dna virale completamente deleto, tant' che c' spesso bisogno di sequenze di dna "stuffer" non codificante non ripetitivo e umano per far s che si raggiunga la grandezza di 36 Kb, infatti anche una corretta dimensione del filamento essenziale per il packaging. Altri vantaggi sono la ridotta tossicit per l'assenza di produzione di proteine virali, tuttavia permane la tossicit immediata dovuta al vettore in s. Questo tipo di vettore presenta un'espressione prolungata ma comunque transiente dato che non si integra nel genoma. Per questo sono necessarie somministrazioni ripetute. Permane una tossicit acuta dose dipendente. Retrovirus Sono i pi utilizzati perch si integrano nel genoma e sono molto meno tossici. Il genoma costituito da 2 molecole di RNA single strand, sono essenziali, quindi, trascrittasi inversa ed integrasi. L'integrazione permette il mantenimento di livelli di espressione molto pi stabili, ma al tempo stesso aumenta la possibilit di oncogenesi dovuta a mutagenesi inserzionale. I retrovirus hanno un envelope fosfolipidico. L'envelope formato anche fa proteine codificate dal locus env. Da queste proteine dipende il tropismo selettivo del virus. Sostituendo, poi, il locus env con quello di altri virus possibile cambiare il tropismo e ottenere quindi una pseudotipizzazione. Riassumendo sinteticamente i loro vantaggi e svantaggi possiamo dire che i retrovirus sono ottimi vettori per l'integrazione stabile e il tropismo selettivo, inoltre sono scarsamente immunogenici e hanno scarsa tossicit in vivo. Tuttavia aumentano il rischio di oncogenesi, si integrano solo in cellule in attiva replicazione, non possibili ottenerli in alto titolo e hanno una bassa capacit (8Kb). Lentivirus Presentano 6 proteine addizionali rispetto ai retrovirus tra cui Tat (fattore transattivante le LTR) e Rev (media l'esportazione dal nucleo dell'rna virale). Tra i lentivirus c' il virus HIV. I vantaggi dei lentivirus sono la possibilit di infezione di cellule non proliferanti (neuroni e macrogagi differenziati), hanno una traduzione stabile (i retrovirus mostrano un'attenuazione), tossicit bassa, tropismo selettivo e risposta immunitaria assente. Vettori non virali Sono vettori che non sfruttano una struttura virale per essere veicolati nelle cellule bersaglio. Questo metodo principalmente basato sull'utilizzo di plasmidi nudi. Plasmidi nudi Sono molecole di DNA duplex circolari, in cui vi si trova il transgene. Solitamente posto sotto un promotore virale molto forte come quello del citomegalovirus (CMV). Sono necessari bassi livelli di transgene e vengono somministrati a livello locale. La durata di espressione limitata. La loro tossicit molto ridotta. Hanno efficacia clinica solo quando sono necessarie basse quantit di transgene oppure si possono utilizzare nell'immunizzazione, infatti i principali campi di utilizzo dei plasmidi nudi sono: vaccini a DNA, espressione di molecole ad alta attivit (ormoni), terapia locale (tumori). Precipitazione con fosfato di calcio Poich il DNA nudo non viene acquisito dalle cellule, c' bisogno di metodi che gli permettano di oltrepassare la membrana citoplasmatica. Il DNA viene mescolato a una soluzione di CaCl2 e poi aggiunto ad una soluzione fisiologica contenente tampone fosfato. In questo modo precipitano sali di fosfato di calcio e DNA. Questo precipitato viene messo

a contatto con le cellule da trasfettare. L'efficienza di integrazione di circa 1%. Data l'efficienza cos bassa, per selezionare i trasfettanti stabili si usano geni di resistenza o terreni selettivi (tipo neo). Un'alternativa costituita dai tensioattivi cationici che grazie alla loro carica positiva si legano al DNA. Inoltre sono capaci di modificare le propriet della membrana permettendo la diffusione del nostro plasmide. Purtroppo non hanno impiego terapeutico data la loro elevata tossicit. Vantaggi vettori non virali impossibile generare virus patogeni riduzione del rischio di reazione immunitaria possono trasferire molecole di DNA molto grandi ma anche altri tipi di molecole possibilit di produzione di grandi quantit a basso costo Svantaggi dei vettori non virali scarsa efficienza di trasduzione ed effetti non duraturi possono integrarsi e generare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali alta efficienza di trasduzione effetti duraturi alti livelli di espressione tropismo altamente selettivo Svantaggi dei vettori virali Possibilit di generare nuovi virus patogeni Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano a caso nel genoma) Si possono introdurre solo molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati Introduzione del DNA plasmidico Metodi fisici pressione idrodinamica, elettroporazione, metodi balistici, iniezione diretta Metodi biochimici proteine associate a dna e poi endocitate (selettivit) polilisine transferrinfection Metodi chimici DNA complessato a molecole a carica positiva (liposomi, policationi come DEAE, destrano, polietilenammina, polyLys) Pressione idrodinamica Uso di volumi di iniezione molto grandi circa il totale volume di sangue dell'organismo. E' ampiamente utilizzato per il delivery epatico, inoltre vi un'alta efficienza di delivery anche in cellule muscolari e renali. Questo metodo prevede che per avere un efficiente rilascio epatico si deve iniettare in circolo in pochi secondi un volume di liquido pari al volume totale di sangue. Questo comporta una grave alterazione della funzione cardiaca e della pressione venosa, che rende impossibile applicare questo metodo nell'uomo se non solo parzialmente. Iniettando il liquido in questa maniera si formano numerosi pori di membrana attraverso i quali i plasmidi possono entrare all'interno della cellula. Microiniezione In questa tecnica il DNA viene inserito direttamente nel pronucleo maschile della cellula, superando automaticamente la membrana citoplasmatica e la degradazione lisosomiale. Ovviamente la trasduzione avviene nello zigote per ottenere animali transgenici. La cellula viene tenuta ferma da un ago aspirante a punta smussata e il dna viene inserito tramite un capillare. Metodi biochimici Uno di questi metodi sfrutta il pathway fisiologico per l'endocitosi del recettore per la transferrina. E' intuitivo che si complessa il DNA terapeutico alla transferrina, che poi viene captata dalle cellule che espongono il suo recettore e internalizzata. Insieme alla transferrina viene internalizzato il DNA. Il DNA viene legato alla Tf perch questa complessata con polylysine o polietilenammine che presentano un'alta densit di cariche positive. Poliammine Sono proteine cariche positivamente che legano il DNA. Sono coniugate con un ligando che d specificit di tropismo. La durata di espressione discreta, ma non lunga e i livelli di espressione bassi. Per la tossicit

molto bassa e si pu avere un'efficacia clinica adeguata quando sono necessarie basse quantit di transgene. Metodi Balistici Prevedono l'uso di una Gene Gun. Una vera e propria pistola che proietta una particella d'oro su cui adsorbito il DNA. Lo sparo ottenuto con un'onda supersonica di elio. Questo metodo particolarmente adatto per vaccinazioni a DNA, terapia genica suicida, immunomodulazione. Elettroporazione in vivo Le cellule bersaglio vengono permeabilizzate tramite l'applicazione di un campo elettrico, che modifica le propriet di membrana facendo formare pori. La somministrazione locale e presenta una tossicit molto bassa dovuta solo alla scarica elettrica. Si ottengono buoni risultati quando sono necessarie basse quantit di transgene o per immunizzazione. I parametri da valutare, che influenzano la somministrazione, sono il sito di rilascio, la configurazione dell'elettrodo, intensit e pulsazione della scarica. Lipidi cationici I liposomi sono composti di molecole anfipatiche contenenti DNA plasmidico. Si preparano vescicole uni o bilamellari tramite sonicazione di DOPA DOTMA o altre lipidi a carica positiva Sulla superficie viene legato il dna, oppure questo viene solubilizzato nel piccolo spazio interno alla vescicola. Hanno una tossicit molto bassa, per la durata di espressione breve e i livelli di espressione bassi. Per questo sono utili in casi in cui sono necessarie basse quantit di transgene o per somministrazioni locali. Sono efficaci nell'infettare cellule del sistema immunitario. I liposomi possono presentare problemi di stabilit per questo vengono preparati con fosfolipidi naturali come fosfaditilcolina. L'aggiunta di fosfolipidi naturali e colesterolo li rende pi facilmente permeabili ai mezzi biologici per sono anche pi facilmente riconosciuti e fagocitati dalle cellule del sistema reticolo endoteliale. La fosfaditilcolina, un lipede a catena lunga e satura, e il colesterolo servono a stabilizzare il doppio strato riducendo le possibilit di interazione con le HDL, riducendo l'adsorbimento di opsonine e riconoscimento da parte delle cellule del SRE. Infatti la presenza di carica negativa facilita la cattura da parte dei macrofagi, cos anche una grandezza >200 nm. Alternativamente si proposto di rivestire i liposomi con polimeri idrofili (per es PEG) che impediscono l'interazione con le opsonine e quindi il riconoscimento da parte del RES. I liposomi cos sono "invisibili" al sistema immune e pertanto vengono chiamati stealth o a lunga circolazione (LCL). Questa condizione indispensabile per sistemi a rilascio prolungato. Pertanto la stabilit dei liposomi in vivo dipende da composizione della fase lipidica, carica superficiale e dimensioni. Preparazione di liposomi I fosfolipidi vengono solubilizzati in un solvente molto volatile come il cloroformio. Il solvente viene fatto evaporare in un evaporatore rotante, ottenendo cos un film lipidico. Poi da questo film si possono ottenere per sonicazione ed evaporazione o altri trattamenti LUV (large unilamellar vescicules), oppure MLV (multilamellar vescicules) o SUV (small unilamellar vescicules).

Coltura cellulareUna coltura cellulare consiste nel far crescere e riprodurre in vitro cellule di un organismo, con il presupposto di riprodurre gli stessi meccanismi che si verificano all'interno dell'organismo di provenienza. Il sistema semplificato ma allo stesso tempo altamente riproducibile. E' possibile quindi l'analisi di meccanismi cellulari e molecolari del fenomeno in esame, tramite controllo ambientale e di esposizione a sostanze diverse da quelle in vivo. Tuttavia le condizioni in vitro non sono completamente sovrapponibili con quelle in vivo e le sostanze possono interagire col terreno di coltura, ma c' economicit, rapidit di risposta, e una gran disponibilit di ceppi. Sterilit E' essenziale per impedire la contaminazione della coltura da parte di microorganismi estranei, ma anche per impedire la contaminazione di s stessi o di terzi. Per questi motivi le colture cellulari devono essere mantenute in camere apposite, e bisogna tenere numerosi accorgimenti, tra cui manipolarle sempre sotto cappa sterile a flusso laminare, utilizzare camici e guanti monouso, sterilizzare il materiale. La sterilizzazione pu avvenire in diversi modi: sterilizzazione a calore rosso su fiamma

sterilizzazione a calore secco mediante forno a 160C per 2 ore. Utilizzato per la vetreria. sterilizzazione a calore umido mediante autoclave a 121C per 15 minuti. Utilizzato per liquidi o vetreria dopo l'uso.

Microambiente Deve essere estremamente regolato per mantere vitali le cellule e rassomigliare il pi possibile a quello in vivo, cos da ottenere risposte verosimili a determinati stimoli. Il pH deve essere compreso tra 7.2 e 7.5 Capacit tampone, solitamente bicarbonato + CO2 per gli acidi prodotti dal metabolismo Livello di CO2 intorno al 5% (uguale alla pCO2 nei tessuti) Osmolalit simile a quella del sangue Temperatura intorno ai 35-37C Tutte queste caratteristiche, all'interno dell'organismo, sono regolate e mantenute da differenti sistemi di controllo. Dato che le cellule si trovano isolate dal tessuto originario, ovvio che questo ambiente deve essere ricreato e mantenuto artificialmente. Il pH pu essere utilizzato anche come indicatore sensibile di contaminazione. Inserendo un indicatore di pH che vira colore in condizioni acide, possibile rilevare la presenza di batteri, visto che producono acidi dal loro metabolismo. Colture primarie e secondarie Una coltura primaria quella le cui cellule derivano direttamente dal tessuto di origine. Dato che le cellule provengono dall'organismo conservano ancora fedelmente le attivit e meccanismi che avevano in vivo. Per hanno vita limitata, quindi in progetti a lungo termine sono necessari numerosi prelievi. La loro crescita dipende dall'ancoraggio, dal siero e hanno inibizione da contatto. Una coltura secondaria detta anche coltura continua in quanto le cellule sono state immortalizzate. Le cellule amplificate clonalmente sono pi facili da coltivare e hanno risultati meno variabili rispetto alle colture primarie. Crescono come monolayer. Tuttavia non riproducono l'ambiente fisiologico fedelmente come le primarie. La loro crescita indipendente dall'ancoraggio, hanno minore dipendenza da siero e non hanno inibizione da contatto. Quindi crescono anche in "foci" (aggregati). Praticamente sono capaci di crescere "indipendentemente" dall'organismo originale da cui sono derivate. Trasformazione E' il procedimento attraverso il quale una linea cellulare viene trasformata in continua. Per l'immortalizzazione, cio la durata di vita illimitata della linea, accanto a dei vantaggi presenta svantaggi. Ci sono cambiamenti morfologici come un aspetto indifferenziato, fibroblastoide o epiteloide, aumento della velocit di crescita e un'elevata instabilit genomica che porta a eterogeneit. La trasformazione causata da alcune mutazioni. Pu essere spontanea o indotta da agenti chimici o virus. Breve e lungo termine Vengono distinte in base al numero di duplicazioni per cellula. Per quanto riguarda le colture primarie, una coltura a breve termine ha meno di 10 duplicazioni, una a lungo termine 50/60. Una linea cellulare continua, invece, supera le 150/200 duplicazioni, in un arco di tempo che supera 1 anno. Medium di coltura Non mai completo. E' composto da ioni inorganici, amminoacidi isomeri-L, vitamine. Poi deve essere arricchito dal laboratorista da altre componenti comunque essenziali per le cellule. Gli ioni inorganici (cloruro di calcio anidro, solfato di magnesi, KCl, NaCl, NaHCO3...), amminoacidi, vitamine sono componenti "di base" del mezzo, ma ogni linea cellulare ha bisogno dei suoi specifici. Il laboratorista pu, poi, aggiungere glucosio, hepes (un sys tampone), rosso fenolo (per il pH), NaPiruvato, Aa non essenziali e FBS al 5-10-20%. L'FBS (fetal bovine serum) un insieme di fattori proteici per la crescita che porta numerosi vantaggi alla coltura. Protegge le membrane cellulari, introduce fattori di crescita ed ormoni, veicola lipidi, ferro e molecole organiche, favorisce interazione col substrato e contiene inibitori della tripsina. Al tempo stesso, per, possibile tossicit agli anticorpi, varia molto da lotto a lotto, sono presenti inibitori metabolici e fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti pi che gli altri tipi cellulari. Supporti per la coltura Molte cellule, non crescono in sospensione, ma hanno bisogno di un substrato solido su cui crescere, perci

vengono messe in coltura su "piastre". Ne esistono di 3 tipi, ognuno di diverse dimensioni. Conoscere il volume della piastra essenziale per determinare poi la concentrazione delle cellule. I tipi sono le flask, o fiasche, le piastre petri, e i multiwell. Morfologia cellulare Le varie linee possono essere classificate in base all'aderenza al substrato in 3 classi: cellule aderenti, semiaderenti e in sospensione. Tra le linee cellulari aderenti fanno parte le epiteliali o epiteloidi, endoteliali o endoteloidi, fibroblastiche o fibroblastoidi, neuronali. Quelle in sospensione sono ulteriormente classificate per la crescita in maniera singola, a piccoli clumps o a grandi clumps. Le cellule aderenti per essere utilizzate e sottoposte ad analisi, devono essere staccate dal substrato. Questo viene effettuato mediante tripsina, un enzima proteolitico derivante dal pancreas, capace di scindere anche i legami che tengono adese le cellule al substrato. Camera di Burker E' uno strumento che permette di contare le cellule grazie a un microscopio ottico. E' nient'altro che un reticolo costituito da 9 quadrati delimitati da linee triple, ciascuno di questi costituito da 16 quadrati minori separati da linee doppie. Ad ogni quadrato a tripla linea corrisponde ad 0.1 mm3 e quindi 0.1 microlitri. Si contano almeno le cellule presenti in 3 quadrati e si fa una media aritmetica. La media viene moltiplicata per il fattore di diluizione che in questo caso 10000 perch 0.1 microlitri = 0.0001 ml. La conta vitale Viene effettuata grazie al Trypan Blue che un colorate in grado di colorare di blu le cellule necrotiche. Quindi si risospendono le cellule in un eguale volume di trypan blue e si ricontano le cellule nella camera di Burker. La concentrazione pari la n cellule vitali (media dei 3 quadranti) * 10000 * 2. La percentuale di vitalit data da n di cellule vitali (trasparenti) / n cell totali (trasparenti e blu) * 100. Cell Bank Una cell bank una enorme collezione di linee cellulari diverse, tenute in perfette condizioni di crescita e replicazione, incontaminate. Acquisizione L'acquisizione consiste nel recuperare la linea cellulare. Pu avvenire direttamente da un ricercatore, indirettamente da altri ricercatori e da banche di linee cellulari. Identit Consiste nella possibilit di ricondurre univocamente una cellula ad una determinata linea, grazie a caratteristiche specifiche di questa linea. L'identificazione avviene mediante il dosaggio di pi polipeptidi con identica attivit enzimatica codificati da pi loci. Gli enzimi vengono separati tramite elettroforesi. Differenti specie hanno differenti combinazioni isoenzimatiche. Il pannello di analisi pu comprendere 4-7 enzimi come AST, G6PD, LDH, MDH, MPI, NP e PEP B. Le cellule vengono identificate per l'assegnazione a una linea, ma il controllo di identit essenziale per rilevare cross-contaminazioni tra specie umane e murine, identificazione di specie non-mammifere. Il contaminante deve restare sotto il 10%. Questo tipo di controllo pu essere effettuato tramite il cariotipo, che fornisce anche la base per la caratterizzazione molecolare e funzionale. Un ulteriore metodo di analisi tramite il DNA-fingerprinting, che sfrutta l'analisi di micro-satelliti o STR, spesso tetranucleotidici. Stabilisce la derivazione della nuova linea cellulare dal campione originario. Conferma l'identit a livello di pi passaggi. Pu quantizzare l'eventuale cross-contaminazine. Caratterizzare genomicamente linee "ibride" uomo-animali. Evidenzia la perdit di eterozigosit. Caratterizzazione immunofenotipica Spesso utilizzata per la diagnosi di leucemie e tumori solidi. Consiste nell'analisi degli Ag di membrana. In genere il pattern di espressione riflette in linea generale quello della cellula originaria, ma ci sono variazioni. Variazioni intralaboratorio dovute all'espressione variabile nel tempo di molecole. E variazioni interlaboratorio dove differenti MoAb possono riconoscere lo stesso antigene con intensit di reazione differente. Espansione / Mantenimento Sono entrambi processi che portano all'aumento del numero di cellule disponibili. L'espansione prevede la perfetta conservazione delle caratteristiche bio-funzionali identificative delle cellule. Dopo l'espansione possibile archiviarle in una parte della cell bank. Esse possono poi essere fornite per studi sperimentali.

Il mantenimento finalizzato allo sfruttamento delle cellule per il gruppo di ricerca. Il processo termina con il sacrificio sperimentale e non con la re-archiviazione. Perci consentito utilizzare procedure non convenzionali (splittaggi meno frequenti, concentrazioni di siero pi basse), che potrebbero modificare le caratteristiche della linea. Conta vitale tramite MTT Le cellule vengono incubate con MTT (sale di tetrazolio) che viene metabolizzato a Formazano tramite deidrogenasi che usano NADH, solo nei mitocondri delle cellule vitali. Questo sale insolubile in acqua precipita e forma cristalli. I sali vengono solubilizzati in isopropanolo e dato che assorbono a 550 nm viene misurata l'assorbanza a quella lunghezza d'onda. Conservazione in azoto liquido Le cellule possono essere criopreservate in azoto liquido a -196C per pi di 10 anni senza cambiamenti significativi delle loro caratteristiche biologiche e possono essere recuperate in qualsiasi momento. Le cellule vengono raccolte nella fase logaritmica della loro crescita, ne viene determinato il numero e la percentuale di vitalit. Si centrifugano le cellule e si elimina il sovranatante. Si prepara il medium di congelamento formato da FBS 20% e DMSO al 10%. Si risospende il pellet nel medium e si tengono in ghiaccio poich il DMSO tossico a temperatura ambiente. Si distribuisce 1 mL nelle criovials capaci di sopportare temperature cos basse e si d inizio al congelamento. Il DMSO (dimetilsulfossido) e il glicerolo proteggono le cellule dalla formazione di cristalli di ghiaccio che perforerebbero la membrana. Il congelamento deve essere rapido perch una lunga esposizione al DMSO pu danneggiare irreversibilmente le cellule. Non necessario sterilizzare il DMSO perch puro letale per i batteri. La velocit di raffreddamento molto importante. Se troppo bassa la cellula sottoposta a disidratazione e quindi ad un'alta pressione osmotica, e ad alte concentrazioni di soluti (diminuisce il solvente) con conseguenti variazioni di pH. Se troppo alta si avr formazione di nuclei di cristallizzazione interni o esterni che distruggeranno le membrane cellulari. La velocit preferibile di circa -1C/minuto. Questa discesa viene simulata tramite freezer meccanici programmabili che per sono molto costosi. In alternativa, possono essere utilizzati contenitori di polistirolo trasferiti prima a -20 e poi -80. Oppure si possono utilizzare contenitori Criostep. Il criostep un contenitore in Nalgene, con sotto isopropanolo. Viene messo a -80 per 4 ore e poi trasferito nei vapori di azoto liquido e poi infine in fase liquida. La criopreservazione presenta numerosi vantaggi come la riduzione del rischio di contaminazione microbica e di contaminazione, la riduzione del drift genetico e morfologico dovuto all'accumulo di mutazioni puntiformi, si possono congelare cellule in qualunque passaggio e c' una notevole riduzione di costi e tempo. Per scongelare le cellule bisogna immergerle nel bagnetto a 37. Pulire l'esterno con alcool assoluto. Aprire le vials e trasferire le cellule in un falcon sterile con 3-5mL di mezzo completo. Si centrifuga e si aspira il sovranatante per eliminare il DMSO. Si risospende il pellet in terreno fresco e si semina. Master / Working Bank La master bank la banca che custodisce le linee cellulari dopo la loro acquisizione ed espansione. Queste cellule sono rigorosamente sottoposte a test di controllo per conta e vitalit, contaminazione da micoplasma, autenticazione genotipica e fenotipica. Proprio per mantenere integre queste caratteristiche l'accesso alla master bank e la manipolazione di queste cellule strettamente regolamentata. La working bank custodisce le linee cellulari che sono utilizzate dai gruppi di lavoro. E' l'immagine speculare della master bank. Devono essere disponibili almeno 20 vials per ogni linea cellulare. L'accesso e meno rigidamente regolato. Contaminazione E' il problema pi grande per quanto riguarda una coltura cellulare. Esistono 3 tipi di contaminazione: contaminazione da batteri, cross-contaminazione e contaminazione da micoplasma. Una contaminazione batterica facilmente visibile per il viraggio del pH, il mezzo che diventa torbido e basta un microscopio per osservare direttamente i batteri. Una cross-contaminazione consiste nel mescolare accidentalmente 2 linee cellulari diverse, possiamo anche non accorgercene per anni. Una contaminazione da micoplasma difficile da rilevare e soprattutto da eradicare. Tutti questi tipi di contaminazione sono sempre dovuti ad errori dello sperimentatore. Cross-contaminazione E' possibile rilevare la cross-contaminazione mediante diversi metodi: morfologia e pattern di crescita, immunofenotipo, identificazione di marcatori molecolari, DNA-fingerprinting, cariotipo e analisi

citogenetica. Praticamente sono valide tutte le procedure di identificazione delle cellule. Una linea cellulare cross-contaminata non rappresenta pi un modello di studio valido, dato che quelle cellule non sono pi rappresentative del microsistema che vogliamo riprodurre in vitro. Nel 2003 c' stato un lavoro di riclassificazione di oltre 500 linee di leucemie-linfomi. Sono state ritrovate linee identificate male o addirittura false. Contaminazione da Micoplasma Il micoplasma comunemente definito come una "minimum cell" cio una cellula costituita solo da membrana ribosomi e cromosoma. Una struttura biologica autonoma organizzata in maniera semplice. Sono caratterizzati da una membrana rigida ricca di colesterolo. Hanno dimensioni estremamente ridotte e un'alta richiesta metabolica di vitamine, precursori di acidi nucleici, lipidi, acidi grassi e Aa. Sono tutti commensali, parassiti o patogeni. Hanno la caratteristica di proliferare su agar, a differenza delle cellule eucariotiche utilizzate in laboratorio. La classe mollicutes, ordine mycoplasmatales, generi Mycoplasma, Ureaplasma e Spiroplasma sono i principali responsabili della contaminazione delle colture. Le pi comuni specie contaminanti sono M orale, fermentans e hominis tipici dell'uomo, pi altri del bovino (FBS) e maiale (siero). Quindi quelli umani sono dovuti a errori dello sperimentatore, quelli bovini e suini provengono dal siero contaminato. La contaminazione da micoplasma veramente subdola in quanto altera livelli di sintesi di proteine e ac nucleici, altera il metabolismo, induce aberrazioni cromosomiche, altera il pattern immunofenotipico e la morfologia, induce o sopprime citochine, interferisce con i saggi, influenza la trasduzione del segnale, altera crescita e vitalit. In sintesi la coltura subisce una graduale degenerazione fino alla perdita della coltura. Per identificare una contaminazione da micoplasma, bisogna prima preparare le colture (pre-detection) che si vogliono analizzare: si propagano per 1 settimana almeno, si coltivano per almeno 2 giorni senza cambiare mezzo, e non si aggiunge nessun antibiotico. Dopodich si piastra la coltura su agar e si incuba anaerobicamente per 14 giorni a 37C. In queste condizioni solo i micoplasmi riescono a crescere, e sar possibile osservarli al microscopio, se presenti, alla fine del periodo di incubazione. Per eradicare il micoplasma si possono adottare diversi metodi: fisici (calore), chimici (detergenti), immunologici (macrofagi), farmacologici (chinoloni o tetracicline). Dopo il trattamento solitamente la contaminazione viene eradicata con successo. Distribuzione La distribuzione da parte delle banche molto vantaggiosa perch ci vengono fornite cellule con diverse garanzie: sono contaminant-free, viene fornito un data-sheet, sono di facile acquisizione, il ricercatore "padre" sollevato dall'incarico di espandere la linea, la linea preservata da perdite accidentali. Quindi, solitamente, quando viene recuperata una nuova linea, questa viene venduta alle banche che si occupano della sua espansione e mantenimento. Le banche pi importanti sono la ATCC (americana), DSMZ (tedesca), ECACC (europa), JCRB (giappone). Banca del cordone E' una banca di cellule che conserva cellule staminali ematopoietiche ricavate dal sangue del cordone ombelicale. Cellule poi utilizzate per ricerca, trapianti, ecc. Cordone ombelicale E' una formazione anatomica che mette in comunicazione feto e placenta. Necessaria per far ossigenare il sangue del feto. E' costituito da 2 arterie, una vena e la gelatina di wharton. Subito dopo la nascita il cordone viene reciso e chiuso. I vasi trombizano il cordone si essica e si stacca. Ricavare il sangue cordonale E' possibile estrarlo dal cordone mentre la placenta ancora in utero, oppure subito dopo il parto dopo l'allontanamento dalla placenta del feto. Il volume della raccolta maggiore se il cordone viene chiuso rapidamente e la raccolta viene effettuata in poco tempo. Purtroppo per non sempre attuabile in sala parto, e prelevare il sangue dopo il parto aumenta il rischio di coaguli e contaminazioni batteriche. Terapia con cellule cordonali Possono essere utilizzate per il trattamento di numerose patologie. Molto spesso per LAL, LMA, LMC, neuroblastoma e anemia refrattaria con eccesso di blasti, anemia aplastica, talassemia, insomma tutte

patologie proliferative che interessano il midollo. Infatti queste vengono trattate mediante ablazione midollare e ripopolamento. Cellule staminali cordonali Confrontate con cellule del midollo adulto, vediamo che il loro numero assoluto minore. Ora ci sono 2 tipi di cell staminali: CD34+ (potenti) e CD34+CD38- (molto potenti). Nel midollo adulto la % di cellule CD34+ del 3% mentre nel sangue cordonale solo 1%. Per mentre nel midollo le CD34+CD38- sono solo l'1%, nel sangue cordonale sono ben il 4%. Donazione del cordone Informazioni sulla donazione possono essere reperite dall'adisco (associaz donne italiane sangue cordone ombelicale) e in strutture ginecologiche. Bisogna essere in buone condizioni di salute (no malattie ereditarie o infettive) e all'atto della donazione bisogna dare il consenso informato e compilare un questionario anamnestico. E' possibile donare solo dopo la 34 settimana e solo se non c' sofferenza fetale e prima di 12 ore dalla rottura delle acque (per evitare contaminazione). Unit di sangue cordonale E' di almeno 60mL in cui sono presenti circa 800 milioni ci cellule di cui l'1% CD34+ e il 4%CD34+CD38-. Se la quantit inferiore il sangue non pu essere utilizzato per trapianti ma solo a scopo di ricerca. Indagini per l'accettazione del sangue cordonale Vengono effettuate sulla madre alla nascita (entro 7 giorni) e a 6 mesi (per eventuali malattie incubate). Sono un pannello di esami di screening per malattie infettive, per essere sicuri della loro assenza. HbSAg Anti HCV Anti HIV 1 & 2 TPHA (sifilide, troponema pallidum) Anti CMV IgG e IgM Anti Toxoplasma IgG e IgM ALT HLA A B DRB1 (nel caso in cui sangue materno e fetale siano venuti a contatto) Poi si pesa la sacca per conoscere il peso lordo del sangue cordonale e poi ricavarne la capacit. Vengono eliminati i globuli rossi. Si aggiunge un volume uguali di crioconservanti (80% destrano e 20% DMSO). Il sangue viene conservato in criocyte e congelato. Analisi effettuate sul sangue cordonale ALT AST Emocromo Conta eritroblasti Conta cellule ematopoietiche Test batteriologico HLA Emocromo -> numero medio di cellule da congelare 800-500 *10^6 Conta stem cell -> per individuare le CD34+ Bact/alert un sistema dotato di un sensore colorimetrico, posto sul fondo del flacone che vira in presenza di CO2 prodotta da batteri. Cellule staminali Le cellule staminali sono cellule capaci di autorinnovarsi, cio di generare cellule in tutto e per tutto uguali a s stesse, oppure differenziarsi, cio generare cellule committed, cio indirizzate verso una via di maturazione. Le cellule staminali sono caratterizzate da alcuni Ag di membrana come CD34 e CD38. Le cellule staminali possono essere recuperate dall'embrione o dall'adulto. In italia prelevarle dall'embrione vietato, ma possono essere importate dall'estero. Le cellule staminali sono un'entit clonale in grado di riprodurre s stessa e di differenziarsi in tipi cellulari diversi. La clonalit la capacit di generare cellule identiche a s stessa. L'autoriproducibilit la capacit di self-renewal, cio capaci di affrontare molte divisioni senza andare incontro a differenziazione. Inoltre dotata di potenza.

Potenza Le cellule staminali sono dotate di "potenza" cio della capacit di differenziarsi in tessuti. A seconda delle linee cellulari che in potenza possono generare si distinguono vari tipi di cellule staminali: totipotenti (Come le ES), pluripotenti e multipotenti. Le cellule totipotenti sono quelle capaci di generare un organismo completo. Sono quelle ricavate dall'embrione fino allo stadio ad 8. Sono considerate totipotenti anche le cellule ES dell'embrione di 8-16 cellule in grado di formare un organismo ma non il trofoblasto. Le cellule pluripotenti sono quelle capaci di differenziarsi in tessuti derivanti da foglietti embrionali diversi. Le cellule multipotenti sono quelle capaci di differenziarsi in tessuti derivanti dallo stesso foglietto embrionale. Le cellule oligo e unipotenti si differenziano in pochi tipi o uno solo hanno ancora autoriproducibilit e clonalit. Embryonic Stem Cell Toti Embryonic Germ Cell Pluri Fetal Tissue Pluri/multi Cord/Placental Blood Pluri/multi Adult Stem Cell Pluri/multi Sorgenti di Stem Cells La blastocisti la fonte classica di cellule staminali. Vengono prelevate dalla inner cell mass. In seguito al prelievo viene sacrificato l'embrione e ci sono problemi etici riguardo questo fatto. Le cellule prelevate sono in grado di generare un individuo completo eccetto il trofoblasto. Anche il blastomero (embrione fino a 8 cellule) una fonte di cellule staminali. Si preleva 1 sola cellula che in grado di generare un organismo completo trofoblasto compreso, inoltre l'embrione non sacrificato. Anche questo metodo oggetto di varie discussioni in quanto la cellula prelevata ha in s la possibilit di diventare un altro intero organismo. Si possono ottenere cellule staminali tramite clonazione terapeutica, trasferendo il nucleo di una cellula adulta nel citoplasma di un oocita. In questo modo possibile ottenere cellule ES autologhe. Questo metodo stato utilizzato per la clonazione di Dolly. Si pu trasferire anche un nucleo in cui il gene cdx2 silenziato mediante interferenza a rna. L'embrione pu procedere fino allo stadio di blastocisti, ma non capace di impiantarsi in utero. Proliferazione delle SC Il mantenimento della staminalit nelle diverse divisioni sembra esser dovuto a un loop di amplificazione tra fattori di trascrizione che rinforzano la loro espressione a vicenda. La mancanza di anche 1 solo di questi fattori porta la cellula a differenziarsi. Poi il microambiente esterno porta alla differenziazione verso un tipo di tessuto piuttosto che verso un altro. Per default le SC si differenziano in neuroni. Cio in assenza di altri fattori di crescita, interleuchine, le SC diventano neuroni. I fattori di trascrizione importanti per le cellule staminali sono soprattutto Nanog, OCT4 e le Sox Proteins. Cellule Staminali umane Possono essere derivate in molti lab. In UK e Corea si pu. In Italia vietato derivare cellule da embrioni per si possono studiare quelle che gi ci sono. Il progetto va approvato dal ministero della salute. In USA oltre a ci non si possono usare fondi pubblici e la legislazione varia da stato a stato. Possono essere fatte crescere su mouse e human feeder layer, ma una volta che sono stati conosciuti i fattori di crescita (LIF e BMP4) secreti da queste cellule ora possibile farli crescere in terreni feeder-free. Sono differenti da quelle mES (ES murine) per molti markers. Esprimono integrine, OCT4, hTERT (telomerasi), Nanog, SOX2. Condizioni di coltura Presenza di human Lif (leukemia inhibitory factor). Fibroblast feeder (STO) o human feeder Controllo del cariotipo Raddoppiano ogni 15-20 ore -> cambio mezzo ogni 3 giorni DMEM, High glucose, Low-Pyr FCS 20% I passaggi devono essere tutti meccanici, cio fisici: non si possono usare mezzi chimici o biochimici, per esempio non possibile usare tripsina perch provoca anomalie cromosomiche.

Risultati attuali Oggigiorno possibile prelevare SC dall'occhio e differenziarle in cornea per il relativo trapianto. Oppure prelevare cellule staminali epidermiche per ricostruire fino all'80% del tessuto ustionato. Sono state ottenute cellule "definitive endoderm" capaci di differenziarsi in tessuti derivanti dal foglietto ectodermico embrionale. Da questo tipo di cellule sono state ottenute con successo insule pancreatiche secernenti insulina, anche se non sono completamente responsive al gluocosio. Le SC adulte sono state, inoltre, differenziate in osso, cornea e epidermide con ottimi risultati. Si riescono a generare anche neuroni, che sono il tipo di cellula pi facile da ottenere da ES. Si pensa di utilizzarli per terapia di parkinson, lesioni spinali. Ultimamente un gruppo di ricerca riuscito a rigenerare la retina in topi, e l'intero nervo ottico. Si sono riusciti ad ottenere risultati anche riguardo i precursori miocardici, per la terapia dell'infarto in maniera da rigenerare i tessuti necrotici. In realt le SC non sembrano colonizzare i tessuti, cio non sono loro a rimpiazzare le cellule necrotiche, ma sembrano fornire fattori trofici che fanno proliferare le cellule gi residenti, che riparano il tessuto. Quindi l'impiego futuro delle cellule staminali sembra essere proprio quello della medicina rigenerativa. Origine delle cellule staminali adulte. Esistono 2 teorie principali riguardo l'origine delle cellule staminali. Bisogna tenere conto di un fenomeno importantissimo nello sviluppo di un organismo: la gastrulazione. Cio la differenziazione nei 3 foglietti principali: ectoderma, mesoderma e endoderma. Dall'ectoderma origineranno neuroni e pelle, dal mesoderma midollo e sangue, muscolo e osso; dall'endoderma polmoni e fegato e pacreas, esofago e stomaco e intestino. Secondo la prima teoria, le cellule embrionali si differenziano in cellule primordiali germinali, e il resto subiscono il fenomeno della gastrulazione differenziandosi in ectoderma, mesoderma e endoderma. Una quota di cellule pluripotenti di ogni foglietto sembra mantenere la staminalit per tutta la vita dell'individuo restando come cellula staminale risiedente. La seconda teoria prevede una iniziale differenziazione di cellule che gastrulano, cellule germinali primordiali e cellule multipotenti staminali. Le cellule multipotenti staminali migrano poi un po' in tutti i tessuti diventando cellule staminali adulte. Questa seconda teoria anche se un po' bizzarra in realt sembra essere confermata dal fatto che queste cellule conservano OCT4 e Nanog, facendo pensare che derivino quindi direttamente dai primi stadi dello sviluppo embrionale, visto che una volta persi questi fattori si pensa non sia pi possibile recuperarne l'espressione. Altre notizie sulle staminali Sorgenti pi ricche tessuto adiposo Tipi sembrano molti, ma in realt le differenze tra loro sembrano essere davvero minime Mantenimento della S sembra che LIF sia molto importante Localizzazione al sito chemioattratte da fattori ancora non conosciuti secreti dal sito di rimarginazione Plasticit fenomeno fisiologico o fraintendimento di risultati? Plasticit Coltivando cellule staminali spesso si osserva che oltre al tessuto previsto, viene generato anche un certo numero di cellule diversamente differenziate. Ci sono 2 ipotesi Un sistema anterogrado per cui la cellula pu procedere il percorso differenziativo in un solo senso, cio verso la cellula matura, per quest'ultima pu transdifferenziare in un altro tessuto. Un sistema retrogrado (plasticit) per cui la cellula pu percorrere il pathway di differenziazione nei 2 sensi, quindi pu anche de-differenziarsi ritornando immatura e riprendere il cammino di differenziazione verso un altro ramo. Oppure questo fenomeno pu essere dovuto alla presenza contemporanea nella coltura di una piccola quota di cellule pluripotenti differnziabili ancora in pi tessuti inaspettati dal ricercatore, e una maggioranza di cellule differenziabili nel tessuto che ci attendiamo. Cellule staminali adulte ematopoietiche Possono essere utilzzate in ambito clinico per trapianti di midollo o rigenerazione tissutale. Possono essere autologhe o eterologhe rispetto alla persona che le riceve. Le cellule staminali autologhe sono isolate dal paziente stesso da midollo o anche da sangue periferico previa somministrazione di farmaci per lo spiazzamento midollare. Le cellule eterologhe possono provenire da familiari, solitamente germani (25%), da donatori (35%) oppure da cordone ombelicale (40%).

La possibilit di trapianto eterologo dipende dalla compatibilit dell'HLA, che per il midollo deve essere totale, cio bisogna che vi sia identita per l'intero sistema DR e i loci A, B e C. Cellule staminali adulte midollari Il midollo adulto contiene 2 tipi di cellule staminali, ematopoietiche e mesenchimali. Le cellule ematopoietiche possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule del sangue. Le cellule mesenchimali possono differenziarsi in tessuto osseo, adiposo e cartilagineo. Ematopoiesi L'ematopoiesi un processo continuo. Un unico continuum che dalla cellula staminale procede verso quella differenziata, che per comodit dividiamo in pi fasi. Il processo di differenziazione avviene in un microambiente fornito dalle cellule stesse e dallo stroma midollare. Si parte dalla self-renewing cell, poi c' la pluripotent stem cell. Questa pu differenziarsi in senso mieloide o linfoide. Il progenitore mieloide pu dar origine a CFU eritroidi, megacariocitiche, basofile, eosinofile, e granulociticemonocitiche. Il progenitore linfoide pu dar origine a linfociti B e T e NK. Da ogni CFU origina poi la cellula matura... abbiamo quindi eritrociti, piastrine, basofili, eosinofili, monociti / macrofagi, neutrofili, linfociti B, linfociti T e NK. Il pathway di differenziazione guidato da fattori di crescita e citochine e interleuchine. Ci sono molecole che spingono la maturazione verso i primi stadi, molecole che stimolano la maturazione di una linea e non di altre, ecc. Saggi funzionali per l'identificazione dei progenitori Esistono saggi a breve termine e a lungo termine. Il saggio a colonie si effettua piastrando cellule su agar o nitrocellulosa e poi aspettare che si formino colonie. Osserveremo che ogni colonia differente dalle altre per grandezza, composizione e colore. Dato che ogni colonia rappresenta la progenie di 1 sola cellula avremo che ogni colonia un continuum di progenitori lineage committed. Il saggio a breve termine e quello a lungo termine si differenziano per il tempo in cui vengono lasciate in coltura le cellule. Dato che il processo di maturazione necessita di un certo tempo a seconda che origini da un progenitore pi a monte o pi a valle, avremo che i saggi a breve termine (3-5 settimane) saranno capaci di individuare solo i progenitori pi maturi, mentre i saggi a lungo termine (>5 settimane) anche quelli pi immaturi dato che anche a questi progenitori sar dato il tempo di maturare. Colture a breve e lungo termine Per coltivare cellule staminali necessario ricreare il microambiente di cellule e fattori tipico del midollo osseo. Le colture a breve termine avvengono in un terreno semisolido che riesce a sostenere le cellule per non pi di 3 settimane, dopodich la sua efficacia decresce. La coltura a lungo termine invece prevede la presenza di un feeder layer di vere e proprie cellule che fungono da substrato e provvedono a ricreare il microambiente ematopoietico, fattori di crescita compresi. Il feeder layer pu essere composto da cellule stromali allogeniche espanse per 4 settimane e poi irradiate, oppure linee cellule continue murine derivate da midollo, che sono pi omogenee e molto pi facili da mantenere dato che sono immortalizzate, inoltre supportano bene sia la linea linfoide che quella mieloide. Le pi usate sono MS5, e poi S17, AFT024, M210B4. Distinzione delle colonie I differenti livelli di maturit sono identificati in base alla diversa sensibilit ai fattori di crescita, al tempo necessario per generare una progenie differenziata e alla grandezza e morfologia della colonia. Da queste caratteristiche nei saggi a breve termine vengono poi selezionate le CFU e le BFU. Una CFU una colony forming unit cio una colonia formante uno dei tipi di cellule del sangue. Un po' pi immatura della CFU la BFU burst forming unit. Tramite i saggi a lungo termine vengono selezionate le LTC-IC, le CAFC e le ELTC-IC. La (E)LTC-IC una (extended) long term culture initiating cell, la primitiva cellula ematopoietica capace di sostenere la produzione di tutte le linee ematopoietiche identificabili con i short-term assay. La CAFC una cobblestone area forming cell, sono aggregati di cellule appiattite otticamente dense associate a una cellula stromale come un macrofago o un adipocita. Unit ematone e nicchia

E' il contenuto dell'aspirato midollare cio stroma, cellulare ematopoietiche, cellule non-ematopoietiche (mesenchimali). Quindi la struttura funzionale che costituisce la nicchia ambientale in cui la cellula staminale ha la sua vita normale. E' indispensabile per la comprensione di meccanismi in vivo. Lo stroma composto da cellule adipocitiche, endoteliali, macrofagi e fibroblasti che producono fattori di crescita come i CSF (Colony stimulating factor) e interleuchine, e hanno funzioni di supporto mediante l'espressione di molecole di adesione come VCAM-1 ICAM-1 e VLA-4. Anche gli osteoblasti hanno funzione essenziale di supporto grazie all'ancoraggio delle stem cell in cui coinvolta l'angiopoietina-1 prodotta da essi. La nicchia il microambiente stabile per la cellula staminale nel quale mantiene la staminalit o si differenzia, essa costituita da una componente cellulare di stroma e una extracellulare di fattori che indirizzano autorinnovamento o differenziazione. p21 mantiene la staminalit, p27 stimola il differenziamento. La cellulla staminale ancorata alla membrana basale, se dopo la divisione la cellula figlia ancorata alla membrana, essa sar una cellula autorinnovata e quindi staminale anch'essa. Se una delle cellule figlie ha perso l'ancoraggio alla membrana vuol dire che si sta differenziando. Una cellula staminale ematopoietica CD34+ CD38- in divisione. Una cellula staminale ematopoietica CD34- CD38+ in quiescenza. Homing E' il processo attraverso il quale le cellule staminali ematopoietiche iniettate nel sangue periferico ritornano al midollo reiserendosi nella loro nicchia ritornando a esercitare la loro normale funzione e ripopolandolo. E' articolato in pi fasi: rolling in cui le cellule staminali rotolano sull'endotelio ancorandosi sempre pi fermamente alla parete grazie all'interazione con selectine, adesione alla parete e schiacciamento grazie a VCAM-1 espresso dalle cellule endoteliali e migrazione trans endoteliale grazie a interazioni VLA-2ICAM1. L'homing avviene con un'efficacia del 5%, pertanto necessario aumentarne l'efficienza. CD26 limita fortemente l'homing in quanto una proteina di membrana capace di clivare SDF-1 un chemioattrattore delle cellule del midollo prodotto dallo stroma midollare. SDF-1 lega il recettore CXCR4 e attrae le cellule staminale nella loro nicchia, e CD26 clivandolo bloccando la chemiotassi. Pertanto possibile aumentare l'efficienza dell'homing grazie a inibitori del CD26 come la diprotin-A. Il processo contrario all'homing lo spiazzamento midollare o mobilizzazione favorito da farmaci come AMD3100. Cellule staminali adulte mesenchimali Si possono isolare da un aspirato midollare e possono dare origine a tessuto adiposo, cartilagineo, osseo e allo stroma del midollo. Isolamento delle MSC Aspirato midollare E' il primo passo per l'isolamento. Vengono prelevate con una procedura molto dolorosa, aspirandole con una siringa dalla cresta iliaca. Il sangue midollare viene posto in una provetta con eparina. Centrifugazione su gradiente di ficoll In camera cellule, sotto cappa, si versa una certa quantit di ficoll (dipende dal sangue disponibile). E il sangue viene depositato molto lentamente su di esso. Data la densit leggermente differente dei 2 liquidi, il sangue si pogger sul ficoll (anche se pu capitare che si miscelino e si perda il campione). Si centrifuga il campione. Dopo la centrifugazione noteremo che sul fondo c' un pellet rosso di globuli rossi, polimorfonucleati, piastrine. Poi sopra c' il ficoll. All'interno del ficoll presente un sottile anello giallastro che non sono altro che le cellule nucleate, comprendenti linfociti, monociti, cellule endoteliali, adipociti e anche le nostre MSC. Dopo si possono fare tranquillamente vari lavaggi e mettere le cellule nel mezzo di coltura. FACS o immunoseparazione Serve per ottenere una separazione ancora migliore, e selezionare solo le MSC. Coltura su piastre Vengono coltivate con una concentrazione di 10000 cell/cm^2. Dato che le MSC sono 1:10000 - 1:100000, con questa concentrazione si riesce ad isolare anche 1 sola cellula per piastra. In questo modo possibile avere una popolazione molto omogenea. Rimozione delle cellule non aderenti Dato che le MSC aderiscono alla piastra, mentre il resto (cellule del sangue e ematopoietiche) no, alla fine di questo procedimento avremo conservato solo le MSC. Saggio delle unit formanti colonie fibroblastiche (CFU-F) Ogni colonia viene espansa singolarmente, indotta a differenziamento e soggetta ad analisi citofluorimetrica per caratterizzarne la progenie.

Separatore cellulare attivato a fluorescenza FACS E' un particolare cell-sorting in cui gli Ab fluorescenti hanno anche una forte carica negativa, oppure sono coniugati con una biglia metallica. La fluorescenza serve per identificare la cellula. La carica elettrica viene sfruttata per indirizzare la cellula verso un particolare tubo di scarico. Infatti immediatamente dopo la camera di lettura sono presenti degli elettrodi che per repulsione/attrazione elettronica deviano la gocciolina con la cellula marcata sospesa verso un tubo o verso un altro. In questo modo possiamo selezionare le cellule interessate. Il FACS per analizzando una singola cellula per volta alza di molto il costo e il tempo di ogni analisi. Immunoseparazione tramite colonnina La colonnina funziona in maniera molto simile a una cromatografia. Le cellule vengono fatte eluire lentamente attraverso la colonnina, che posizionata in un separatore magnetico. Le cellule marcate con gli Ab magnetici verranno trattenute molto pi a lungo rispetto alle cellule non-marcate che eluiranno rapidamente. Le cellule trattenute vengono poi staccate mediante forza fisica (stantuffo) o variazioni di pH. Selezione MSC Ovviamente pu essere sia positiva (si marcano le cellule interessate) o negativa (si marcano le cellule da eliminare). La selezione negativa consigliata quando gli antigeni "caratteristici" della selezione positiva sono condivisi anche con altri tipi cellulari. Esempi Ab di selezione negativa sono CD45 Ag panleucocitario, CD235a glicoforina per eritrociti e precursori, Lineage cell depletion (cocktail di Ab). Si capisce che possibile selezionare le cellule da depletare tramite 1 solo Ab o un cocktail di Ab, per in seguito a una immunodeplezione estensiva si nota che le cellule restanti proliferano poco, perch si elimina buona parte del microambiente del midollo, necessario alla crescrita delle MSC. Esempi Ab di selezione positiva sono Stro-1 un Ag per MSC che per esprimono alcune cellule esprimenti glicoforina (eritrociti), CD105 endoglina-recettore per TGF-beta espressa per anche su cellule endoteliali, CD117 recettore per stem cell factor espresso per anche nel 25% dei marcatori ematopoietici, SSEA-4 stage specific Ag-4 presente oltre che nelle MSC anche in cellule embrionali e del teratocarcinoma, che ovviamente non sono nel midollo, ma solo il 2-4% delle MSC lo esprime. In sintesi la selezione negativa o non separa bene o elimina troppe cellule, invece la selezione positiva finisce per conservare altre linee o eliminare buona parte delle MSC. Questo accade perch non esiste un Ag veramente specifico delle MSC, n conveniente sotto ogni aspetto depletare tutte le altre popolazioni. E' possibile per creare un pannello di Ag positivi e negativi tramite i quali possibile isolare la maggior parte delle MSC: CD45-, glicoforina-, CD14-, CD34-, CD44+,ScaI+, CD29+, integrine specifiche. Differenziamento MSC Le MSC vengono indirizzate lungo una linea, semplicemente fornendole i metaboliti necessari alla formazione delle proteine tipiche di quella linea. Per esempio viene fornito ac ascorbico per il differenziamento in osteoblasti perch un cofattore necessario per la formazione del collagene. Le MSC differenziano in cellule tipiche del midollo osseo, quindi osteoblasti e condrociti, ma anche adipociti, infatti con l'et il midollo inizialmente rosso, viene progressivamente rimpiazzato da adipociti diventando giallo. Sembra che inizialmente le MSC abbiano la capacit di differenziarsi in osso, cartilagine, stroma, adipe. E perdono sequenzialmente questa capacit, cio una cellula osteoblastica poteva diventare anche cartilagine stroma o adipe, una cellula della cartilagine poteva diventare stroma o adipe, ma non pi osso, ecc. Pertanto inizialmente la colonia isolata clonale e multipotente. Poi a causa del protocollo o col numero di divisioni perde progressivamente alcune potenzialit per conservarne solo una. D Osteoblastico I fattori forniti sono Ac ascorbico, desametasone e beta-glicerofosfato. L'acido ascorbico, vitamina C, un cofattore fondamentale per l'idrossilazione di Pro e Lys, infatti idrossiproline e idrossilisine sono tipiche della struttura del collagene. Il beta-glicerofosfato una fonte di fosfato necessaria per la mineralizzazione dell'osso. Il desametasone un agonista dei glucocorticoidi che agisce esso stesso come un fattore di trascrizione, attivante alcuni geni determinanti per lo sviluppo lungo questa linea. D adipocitico I fattori forniti sono 3-isobutil-metil-xantina, insulina e desametasone. La IBMX un inibitore non specifico delle fosfodiesterasi di cAMP e cGMP, che impedisce quindi l'attivazione della PKA.

L'insulina attiva fattori di trascrizione specifici della linea e inoltre favorisce l'accumulo di lipidi. D condrocitico I fattori forniti sono TGF-beta1, poli-lys, insulina, ac ascorbico. Inoltre bisogna mimare la condensazione cellulare che si nota in vivo nella cartilagine giovane. Quindi bisogna piastrare le cellule ad altissima densit come micro-gocce su piastra oppure farle sedimentare sul fondo conico della provetta. Il TGF-beta1 un fattore tipico per la proliferazione e il differenziamento cellulare lungo questa linea. La Poli-Lys promuove l'interazione tra cellule. Immunosoppressione delle MSC Le MSC oltre ad avere le funzioni di costituire la nicchia midollare, sono anche coinvolte nello sviluppo di molte cellule del sistema immune come linfociti T, B, NK e cellule dendritiche. Si visto che esse inducono l'arresto della divisione mitotica in G0 o G1 e inibiscono l'espressione della ciclina D2. Inoltre alterano la secrezione di citochine e inducono anergia nei linfociti T. Questi effetti possono essere dovuti a interazioni cellula-cellula e secrezione di fattori. Si pensa anche che le MSC possano essere un santuario immunologico, cio cellule che non possono essere riconosciute in alcun modo dal sistema immunitario. Si pensa che ci sia dovuto a bassi livelli di espressione di MHC-I e assenza pressocch totale di MHC-II, CD80, CD86, che sono fondamentali per la stimolazione delle cellule T. Applicazioni delle MSC Come per gli altri tipi di cellule staminali, si propone il loro impiego in ingegneria tissutale di ossa, supportandole mediante opportuni scaffold; terapia cellulare di sostituzione, come nel caso dell'osteogenesi imperfetta, dove attualmente si prelevano le MSC, che vengono infettate con un retrovirus che porta il gene funzionante del collagene I, e poi reinoculate nel paziente. Il paziente subisce una lieve chemio e radioterapia per indurre tolleranza immunologica verso le alloMSC; infine si pensa di utilizzare come pompe di fattori di crescita. Altre fonti di MSC Non solo il midollo osseo pu fornire cellule MSC, si ricercano fonti alternative facilmente accessibili anche perch l'aspirato midollare una procedura molto dolorosa. Un tessuto molto ricco di MSC il tessuto adiposo, poi sono presenti anche in sangue cordonale, placenta, sangue periferico dopo spiazzamento Modelli animali per terapia genica I sistemi sperimentali pi utilizzati in terapia genica sono in ordine di complessit: S. Cerevisae, Neuroni in coltura, C. Elegans, P. lividus (riccio di mare), D melanogaster, Danio Rerio, Xenopus Laevis, Mus musculus, ratto e coniglio. Il pi utilizzato per studiare meccanismi simili a quelli umani il topo, mus musculus. Cellule staminali adulte da epidermide La pelle una importantissima riserva di cellule staminali adulte. Sono anche quelle caratterizzate meglio, data la loro facile accessibilit. Si trovano soprattutto nello strato basale. Questo contiene 2 tipi di cheratinociti le SC indifferenziate slowlycycling ad ampia capacit di proliferazione e lento ciclo cellulare, e le transit amplifying cell (TA) a limitato potenziale proliferativo ma replicazione rapida. Altri luoghi dove possibile trovarle sono lo strato spinoso, granulare e i follicoli piliferi. E' possibile trovarle anche nel derma, in particolare le cellule qui risiedenti possono dare origine oltre che a cheratinociti, anche a cellule neuronali e glia, derivati del mesoderma e cellule ematopoietiche. Vantaggi delle ST epidermiche Il loro pregio principale che sono facilmente accessibili ed isolabili, tramite una biopsia cutanea con la quale viene prelevato un piccolo quadratino di pelle di 2cm x 1cm anche dall'inguine o dall'interno delle articolazioni (posti poco visibili). Inoltre sono presenti poche cellule immunitarie, che darebbero problemi in caso di trapianti allogenici. Caratteristiche delle SC epidermiche Le SC epidermiche esprimono integrine beta-1 massivamente sulla membrana, a differenza delle TA, pertanto possibile sfruttare questa caratteristica per selezionarle tramite cell sorting. Sembra che le SC diventino TA e indirizzate verso la differenziazione terminale in seguito all'espressione della proteina c-Myc (un oncogene collegato al pathway di proliferazione indotto da PDGF). Come per le cellule ematopoietiche, le cellule staminali epidermiche iniziano la differenziazione dopo essersi

staccate dalla membrana basale. Esse infatti perdono l'ancoraggio modificando l'espressione di E- e Pcaderine. In questa maniera possono anche migrare dagli strati inferiori a quelli superiori maturando man mano in cheratinociti. Trapianto di cellule staminali cutanee Viene impiegato nel caso di gravi ustioni (oltre il 45% della superficie corporea) o lesioni cutanee. E' possibile ricostruire l'epiderminde fino all'80% della superficie corporea, ma non possibile ricostruire gli annessi cutanei come peli, capelli e unghie. Si preleva un quadratino di 2cmx1cm di cute tramite biopsia cutanea, si adatta in coltura e lo si espande per 3 settimane. La coltura pu essere fatta su plasticheria o su polimeri di fibrina. Su quest'ultima si nota una velocit di crescita e capacit proliferativa invariata rispetto alla coltura su plastica, non induce variazione clonale, n perdita di cellule, l'attecchimento sul sito alto, inoltre viene risolto un problema fondamentale: staccare il foglietto dalla base. Alcuni limiti del trapianto sono dovuti pi che altro alle infezioni causate dalla preparazione del sito di innesto, e dall'impossibilit di ricreare gli annessi cutanei. Cellule staminali adulte da pancreas Non si sicuri dell'esistenza di SC pancreatiche. Il pancreas capace di autorigenerazione, ma non esistono sufficienti dati che dimostrino che siano presenti cellule progenitrici, e che queste siano effettivamente localizzate l. Ultimi studi fanno pensare che la rigenerazione sia dovuta a divisione di cellule gi mature, ma sono presenti anche facultative progenitors, che sembrano intervenire in momenti di stress contribuendo al mantenimento dell'equilibrio tissutale. Secondo alcuni studi queste cellule sono localizzate a livello del dotto pancreatico e in caso di insulti queste incrementano la loro replicazione pi delle altre cellule. Si sono osservate, per, cellule beta-pancreatiche anche in zone del pancreas esocrino, facendo pensare che tali cellule possano transdifferenziare. Recentemente stato possibile ottenere isolette pancreatiche di cellule beta in vitro, utilizzabili anche per trapianto terapeutico per il diabete mellito. Queste colonie sono capaci anche di differenziare in altri tipi cellulari ad esempio neuroni. Infatti tra i markers putativi dei progenitori pancreatici troviamo molecole specifiche del pancreas (PDX1, Tyridrox, orm pancreatico YY), ma anche molecole tipiche dei neuroni (nestina). Cellule staminali adulte da fegato Come per quelle pancreatiche non ci sono evidenze della loro presenza sicura nel fegato adulto, ma ce ne sono alcune per quanto riguarda il fegato fetale. Una delle ipotesi riguardo la loro localizzazione, le vede presenti nel canale di Hering. Sono state identificate come oval cell, che possono intraprendere 2 cammini differenziativi che le portano a maturare in epatociti o cellule epiteliali dei dotti biliari. Queste oval cell sono cellule eterogenee che proliferano in condizioni patologiche. Se attivate esprimono markers tipici delle linee epatiche fetali come alfa-fetoproteina tipica degli epatoblasti fetali immaturi o CK-7 tipica delle cellule epiteliali biliari. La loro nicchia costituita da cellule stellate del fegato che secernono fattori di crescita necessari per la loro sopravvivenza e proliferazione. I corpi embrioidi Un corpo embrioide viene considerato come un ammasso cellulare le cui caratteristiche e reazioni sono paragonabili entro certi limiti a quelle di un embrione. In pratica sono ammassi cellulari di diversi tipi di cellule staminali pluripotenti. Sono una formazione tipicamente ex vivo, dovuta alle differenti condizioni in cui si trovano le cellule embrionali in vivo o ex vivo. Bisogna dire che le cellule ES ex vivo, se non vengono costrette in un certo microambiente differenziativo, esse incominciano a svilupparsi quasi come un embrione in vivo, formando anche i vari foglietti, ecc. Le cellule ES ex-vivo, quindi, seguono uno sviluppo simile entro certi limiti alle cellule ES in vivo, ma mostrano un ritardo di circa 3.5 giorni. Infatti possibile paragonare le cellule ES ex vivo al giorno 0 di coltura a quelle della blastocisti che si forma nei primi 3.5 giorni. La comparsa dell'ectoderma primitivo (5-6 giorni) con cellule simil-ectodermiche al giorno 1. E in particolare alla formazione dell'epiblasto (immediatamente prima della gastrulazione) corrisponde la formazione dei corpi embrioidi. E' possibile formare corpi embriodi anche con uno statagemma, facendo aggregare cellule ES tra loro. Per farlo si depositano, su un coperchio di una piastra, tante goccioline d'acqua contententi cellule ES. Il coperchio viene capovolto, ma le gocce per coesione resteranno comunque adese. Per gravit le cellule ES si raggruppano sul fondo della goccia e si aggregano spontaneamente in un corpo embrioide. Questi corpi embrioidi vengono prelevati e messi in coltura in piastre non aderenti, quindi in sospensione. Drug discovery

L'applicazione pi ovvia dei corpi embrioidi sono gli studi di screening di possibili fattori differenzianti e test di tossicit farmacologica. Sempre basandosi sull'ipotesi che le reazioni del corpo embrioide ex-vivo sono paragonabili a quelle di un embrione di pochi giorni in-vivo. Le 2 tecniche sono praticamente uguali e consistono nell'allestire diverse piastre multiwell tutte con lo stesso tipo di corpi embrioidi. All'interno di queste cell ES stato trasfettato un gene reporter come la GFP (green fluorescence protein) sotto il promotore specifico di una determinata linea, ad esempio neuroni. Ovviamente esprimeranno la proteina solo le cellule che avranno differenziato lungo quella linea e saranno diventati neuroni. Viene immessa in ogni pozzetto una molecola-candidato diversa, si lasciano in coltura le cellule e dopo si ricercano i pozzetti con le quelle fluorescenti, che saranno quelle che hanno differenziato in neuroni. Risalendo dal pozzetto alla molecola immessa, si verifica cos che questa induce il differenziamento lungo la linea cellulare testata(neuronale). Nel caso di studi di tossicit si marcano le cellule con GFP sotto un promotore ubiquitario, per esempio l'actina. Saranno fluorescenti tutte le cellule vitali, perci dopo l'incubazione con le molecole potenzialmente tossiche, si ricercano nei pozzetti quelli senza pi fluorescenza, ovvero quelli in cui le cellule sono morte per un reale effetto tossico della molecola l presente. Si presume che se la sostanza tossica per il corpo embrioide, con alta probabilit essa tossica anche per un embrione in vivo. Modelli di topo Vengono classificati in 3 tipi: Modelli spontanei, identificati solitamente in stabulari e zoo. Sono rari, ma sono anche una buona parte di quelli esistenti. Modelli indotti per mutagenesi, grazie a radiazioni, agenti chimici (nitrossiurea ENU) e trasposoni. Modelli per mutagenesi diretta, cio animali transgenici e knock-out. Il modello topo molto vantaggioso perch la sua genetica molto conosciuta, il progetto genoma completo, ha diverse patologie in comune con l'uomo, la procedura di manipolazione delle ES stata standardizzata, le metodologie disponibili per l'analisi del fenotipo sono estremamente sofisticate, il tempo di riproduzione relativamente breve. Il gene da studiare Il gene oggetto di uno studio probabilmente un gene di cui non si conosce la funzione e quindi lo si modifica nell'animale per vedere la modificazione fenotipica che provoca quando soppresso, oppure un gene che si ritiene responsabile di una patologia umana, e quindi lo si modifica nell'animale per vedere se la modificazione causa una malattia simile nell'animale. In entrambi i casi, la manipolazione del genotipo porta alla creazione di un modello animale di malattia. Creare il modello Sono possibili varie metodiche Microiniezione di cellule transgeniche in blastocisti -> creazione di una chimera -> con un po' di fortuna le cell transgeniche si ritrovano nell cell germinali -> prox generazione transgenica. Microaggregati di cell transgeniche -> ricreazione della morula -> creazione di un organismo transgenico ( difficile) In ogni caso bisogna prima modificare le cellule che poi formeranno l'organismo geneticamente modificato. E' possibile aggiungere un gene che l'organismo non ha (transgene), oppure sostituire un gene non funzionante ad uno funzionante dell'organismo (knock-out). Inserzione di DNA esogeno nel pronucleo maschile dell'oocita fertilizzato -> transgene Inserzione di DNA esogeno nell'oocita per ricombinazione omologa -> knock-out Creazione di un modello KO Il KO prevede la sostituzione per ricombinazione omologa di un gene target con un gene non funzionante. Data la bassa frequenza della ricombinazione omologa (1x10^7), si ideato un sistema per selezionare le cellule che hanno ricombinato. Il nostro DNA esogeno ha zone di omologia col gene che vogliamo knockare. All'interno presente il gene per la resistenza alla neomicina (un antibiotico letale per le cellule eucariotiche), fuori della zona di omologia presente il gene della timidino-chinasi che rende le cellule sensibili al ganciclovir (un antivirale). Neo un gene capace di rendere le cellule insensibili alla neomicina. Quindi se si somministra neomicina, queste sopravvivono. Tk un gene che metabolizza il ganciclovir, che un analogo della timina, e lo rende trifosfato cos che viene inglobato durante la replicazione, per visto che manca del 3' rende impossibile attaccare il nucleotide successivo e la replicazione si blocca. Quindi le cellule con la Tk muoiono se gli viene somministrato il

ganciclovir. Le cellule che non avranno ricombianato non avranno n neo, n tk e quindi saranno sensibili a neomicina e ganciclovir. Le cellule che hanno ricombinato in maniera casuale avranno sia neo che tk, e quindi saranno resistenti alla neomicina, ma sensibili al ganciclovir. Le cellule che hanno ricombinato in maniera omologa, hanno neo, ma non tk, quindi saranno resistenti alla neomicina e resistenti al ganciclovir. Quindi per selezionare le cellule che ci interessano (ora sono 1/10000000), cio quelle che hanno ricombinato in maniera omologa, le cellule vengono prima incubate con neomicina in maniera da sterminare tutte le cellule che non hanno ricombinato cos che le cellule che ci interessano sono 1/100 - 1/1000, poi vengono incubate con ganciclovir cos che vengono eliminate tutte le cellule che hanno ricombinato in maniera non-omologa. Ora analizzando le cellule sar molto probabile trovare una cellula knockata ogni 10 100. Se poi il nostro dna esogeno codifica anche per la galattosidasi, diventa molto semplice individuare le cellule che hanno ricominato infatti le si pu somministrare un substrato cromoforo per cui tutte le cellule colorate saranno quelle che hanno ricombinato. Chimere e ceppi Le blastocisti sono originate solitamente dal ceppo C57BL/6 dal manto nero. Le cellule ES sono del ceppo 129/Sv dal manto agouti. La scelta di questi ceppi non casuale, anzi, ben precisa perch si visto che le cellule del ceppo 129/Sv sono molto aggressive nel colonizzare le blastocisti C57. Inoltre dato il diverso colore del manto, la chimera nascer a chiazze, e dalla percentuale di manto agouti sar possibile individuare i topi con una pi alta percentuale di cellule transgeniche. Le chimere vengono incrociate con topi 129/Sv wild type, cos che nascono eterozigoti. Da incroci tra eterozigoti nascono omozigoti. Backcrossing Dato che i 129/Sv sono un po' stupidi (inadatti a studi comportamentali) e pessimi breeders (non si accoppiano), si tenta di riportarli al ceppo C57. Si incrociano i topi con un genitore e poi tra fratello e sorella. Sono necessarie almeno 10 generazioni per riportare l'omozigosit nel ceppo al 97%, si continua per fino alla 20. I controlli wild-type sono costituiti dai fratelli dei KO. Alla fine del processo si ottiene un ceppo puro o Inbred. In un ceppo inbred ogni topo virtualmente identico ad ogni altro topo dello stesso ceppo. Dato che col tempo il ceppo accumula mutazioni spontanee, si continuano incroci fratello-sorella, per contenere la deriva genetica il pi possibile e mantere l'omogeneit. a causa di questi motivi importantissimo non cambiare mai fornitore. Sono classificati per combinazioni di lettere, di cui l'ultima indica il rivenditore. Per i transgenici Nome ceppo modo inserzione nome gene n linea fondatrice codice lab B6JL TgN(microiniezione) (Sod1-G93A) 1 Gur B6JLTgN(Sod1-G93A)1Gur Per i KO Nome ceppo gene knockato metodo nlinea codice lab C57BL6/J Rag1 Tm 1 Mom C57BL6/J-Rag1Tm1Mom Comportamento generale dei topi Mordono Barbering (assenza di peli dovute a vessazioni del topo dominante) Alimentazione (pellet di croccantini, si pu gestire la dieta) Ritmo luce/buio 12/12 Nido (creano un ambiente in cui la femmina partorisce) Temperatura (20-23C) Fertilit E' un elemento fondamentale riguardo i ceppi, dato che molto pi vantaggioso avere ceppi che si riproducono facilmente e con una prole numerosa, cos da accelerare gli incroci e di conseguenza gli studi. Ogni ceppo ha un indice di fecondit relativa che deriva da diversi fattori come la % di incroci produttivi, l'inizio della fertilit, il numero di cuccioli per ogni cucciolata e il n di cucciolate che una femmina fa mediamente in una vita.

Accoppiamento e gravidanza La maggioranza delle femmine fertile tra la 6-8 settimana, quindi la separazione M/F deve avvenire verso la 5-6 settimana, altrimenti i topi si accoppiano tra loro e diventa impossibile controllare gli incroci. Il ciclo mestruale dura 4-6 giorni. Mediamente i C57 si accoppiano ogni 4 giorni, quindi si pu far ruotare il maschio di gabbia in gabbia ogni 4 giorni, oppure far ruotare le femmine e dare 2-3 femmine per ogni maschio. L'accoppiamento avviene di notte e la mattina possibile identificare un plug che indica l'avvenuta copulazione. Gi dopo 10-12 giorni si pu palpare l'embrione, la gestazione dura 18-22 giorni e la nascita avviene tra le 00,00 e le 04,00. La presenza di un maschio estraneo nella gabbia porta la madre a una terminazione spontanea di gravidanza, questo non avviene se il maschio dello stesso ceppo del padre, per pu mangiare i neonati che non sono suoi figli. Post-natalit I topi nascono con orecchie e occhi chiusi. Il sesso lo si pu determinare dopo 8-10gg dalla distanza urogenitale. Incomincia a mangiare verso il 16 giorno, ma viene allattato fino al 21. Pu essere separato gi dal 18 giorno anche se si aspetta il 28. Il topo vive in media 1/3 anni e pesa 22-40 gr, il peso geneticamente determinato. N di topi Il n di topi impiegati nello studio deve essere il minor numero possibile per ottenere un risultato statisticamente valido, altrimenti lo studio eticamente ingiusto. Infatti pochi topi non sono un campione statistico e quindi vengono sacrificati inutilmente, mentre nel caso siano troppi, ci sono topi il cui sacrificio poteva essere evitato. L'Asl effettua controlli molto stringenti riguardo i topi, molto meno su pecore, cani, rane, ecc. Ogni progetto sottoposto ad approvazione del veterinario responsabile, del direttore dello stabulario, del ministero della salute. Non c' comitato etico. Stabulazione SPF (serum-pathogen-free) E' un tipo di stabulazione pi sterile possibile che necessaria per mantenere topi immunodepressi, ma d risultati molto vantaggiosi anche per l'assenza di influenze di agenti patogeni sui risultati e per procedure chirurghiche. Tuttavia una procedura molto costosa. La sterilit e la pulizia viene verificata con topi sentinella, che vengono sottoposti a controlli periodici, poich un patogeno tende ad infettare una stanza intera piuttosto che una gabbia. Gabbie Sono fatte di materiale non poroso, non opaco, facilmente lavabile, con un coperchio di metallo per cibo e acqua, e uno di plastica con o senza filtro. Posson contenere al massimo 5 topi. Sono cambiate da 3 giorni a 2 settimane ( la cosa pi costosa). La pulizia avviene con disinfettanti e c' un pest-control per roditori esterni. La lettiera d isolamento termico, assorbe le urine, riduce gli odori e le polveri, sterilizzabile e tutte queste cose aumentano la riproduttivit. Condizioni ambientali La temperatura tenuta tra i 22 e i 25C, l'umidit tra il 45-60%. L'aria fresca filtrata per ridurre patogeni, 10-15ricambi all'ora. Intensit luminosa superiore a 325 lux a un metro dal suolo e ritmo luce/buio 12/12. Rumore inferiore a 85Db, i rumori possono essere attenuati con rumore bianco (per es.: musica classica). Nutrizione Ad libitum tranne per casi sperimentali particolari Pellet duro per non produrre rifiuti, sterilizzabile H2O autoclavata e acidificata Mantenimento delle colonie KO Hom (-/-) genotipizzazione