Riassunti Russo

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REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Cominciamo con un poco di numeri: 2% del genoma codifica per proteine 30% comprende sequenze in cis(che stanno cioè sul DNA) che regolano la trascrizione 10% elementi in trans(proteine sintetizzate che poi agiscono sul DNA) che regolano la trascrizione. La maggior parte di questi lega il DNA in maniera sequenza specifica. Ogni gene viene finemente regolato sia nel suo stato ON/OFF che nell’intensità dell’espressione del gene stesso. I fattori trascrizionali sono sicuramente uno degli attori di questo complicato sistema, quello a cui siamo maggiormente abituati, ma non sono gli unici infatti essi utilizzano: Co-regolatori(attivatori e repressori) Fattori di rimodellamento della cromatina ATP- dipendenti(ex SWI) Enzimi che modificano gli istoni (HAT ed HMT) Enzimi che modificano i F.trascrizionali ecc. Il modo con cui viene regolata la trascrizione negli eucarioti è differente dai procarioti. Questi per accelerare i tempi di replicazione hanno dovuto rinunciare ad alcun cose, ed hanno rinunciato ad una fine regolazione della trascrizione. La trascrizione viene regolata ma i fattori che intervengono sono minori. Alcuni cenni sulla trascrizione. In Biologia molecolare, la trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA. La trascrizione presenta un meccanismo di controllo della fedeltà (o proofreading), ma esso è molto meno efficace di quelli legati alla replicazione del DNA.Lo stesso meccanismo di sintesi dell'RNA, nel quale l'enzima RNA polimerasi ha un ruolo centrale, comporta un numero di errori decisamente maggiore. La trascrizione consta essenzialmente di tre fasi: l' iniziazione, l'allungamento e la terminazione. Dato l'elevato numero di geni presenti in un organismo eucariote, la trascrizione è un meccanismo molto complesso perché necessita di un sistema di regolazione complicato che agisca su più livelli. La complessità del genoma eucariocito è tale da giustificare la presenza di 3 RNA Polimerasi e dei sistemi di regolazione che regolano , appunto, la funzionalità di questi enzimi. Prima fase: legame con la TBP Il riconoscimento del promotore da parte della proteinaTBP. Tutto ciò vale solo nei geni con l'elemento TATA(infatti TBP sta per TATA binding protein). La TBP ha la funzione di produrre due forti piegature al DNA (o kink) a livello della sequenza TATA che inducono in questo punto un angolo di circa 90°. Questo forte angolo non sarà la causa dell’apertura del promotore ma ha la funzione di allargare i solchi maggiori al fine di favorire una migliore interazioni delle altre proteine del complesso di attivazione basale. Seconda fase: assemblaggio del complesso DAB La TBP intercetta la sequenza TATA spesso legata ad altri fattori chiamati TAF's, e in questa forma viene chiamata TFIID (“TBP+TAF's” = TFIID)per formare il complesso di inizio preliminare. A questo punto la topologia del DNA è tale da poter reclutare altri fattori di trascrizione ovvero il TFIIA e il TFIIB. Tale complesso trimerico TBP TFIIA TFIIB e chiamato anche DAB. Il complesso DAB così assemblato è capace di legare un quarto fattore di trascrizione che porta con se
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    07-Jun-2015
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REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Cominciamo con un poco di numeri: 2% del genoma codifica per proteine 30% comprende sequenze in cis(che stanno cio sul DNA) che regolano la trascrizione 10% elementi in trans(proteine sintetizzate che poi agiscono sul DNA) che regolano la trascrizione. La maggior parte di questi lega il DNA in maniera sequenza specifica. Ogni gene viene finemente regolato sia nel suo stato ON/OFF che nellintensit dellespressione del gene stesso. I fattori trascrizionali sono sicuramente uno degli attori di questo complicato sistema, quello a cui siamo maggiormente abituati, ma non sono gli unici infatti essi utilizzano: Co-regolatori(attivatori e repressori) Fattori di rimodellamento della cromatina ATP- dipendenti(ex SWI) Enzimi che modificano gli istoni (HAT ed HMT) Enzimi che modificano i F.trascrizionali ecc. Il modo con cui viene regolata la trascrizione negli eucarioti differente dai procarioti. Questi per accelerare i tempi di replicazione hanno dovuto rinunciare ad alcun cose, ed hanno rinunciato ad una fine regolazione della trascrizione. La trascrizione viene regolata ma i fattori che intervengono sono minori. Alcuni cenni sulla trascrizione. In Biologia molecolare, la trascrizione il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA. La trascrizione presenta un meccanismo di controllo della fedelt (o proofreading), ma esso molto meno efficace di quelli legati alla replicazione del DNA.Lo stesso meccanismo di sintesi dell'RNA, nel quale l'enzima RNA polimerasi ha un ruolo centrale, comporta un numero di errori decisamente maggiore. La trascrizione consta essenzialmente di tre fasi: l'iniziazione, l'allungamento e la terminazione. Dato l'elevato numero di geni presenti in un organismo eucariote, la trascrizione un meccanismo molto complesso perch necessita di un sistema di regolazione complicato che agisca su pi livelli. La complessit del genoma eucariocito tale da giustificare la presenza di 3 RNA Polimerasi e dei sistemi di regolazione che regolano , appunto, la funzionalit di questi enzimi. Prima fase: legame con la TBP Il riconoscimento del promotore da parte della proteinaTBP. Tutto ci vale solo nei geni con l'elemento TATA(infatti TBP sta per TATA binding protein). La TBP ha la funzione di produrre due forti piegature al DNA (o kink) a livello della sequenza TATA che inducono in questo punto un angolo di circa 90. Questo forte angolo non sar la causa dellapertura del promotore ma ha la funzione di allargare i solchi maggiori al fine di favorire una migliore interazioni delle altre proteine del complesso di attivazione basale. Seconda fase: assemblaggio del complesso DAB La TBP intercetta la sequenza TATA spesso legata ad altri fattori chiamati TAF's, e in questa forma viene chiamata TFIID (TBP+TAF's = TFIID)per formare il complesso di inizio preliminare. A questo punto la topologia del DNA tale da poter reclutare altri fattori di trascrizione ovvero il TFIIA e il TFIIB. Tale complesso trimerico TBP TFIIA TFIIB e chiamato anche DAB. Il complesso DAB cos assemblato capace di legare un quarto fattore di trascrizione che porta con se

la RNA Polimerasi II che TFIIF. La funzione di TFIIF quella di permettere il riconoscimento del promotore alla RNA Polimerasi II. Terza fase: superamento dello stallo Quando TFIIF porta la RNA Polimerasi II sul promotore essa interagisce con la coda carbossi terminale alla TBP. Tale interazione richiama sulla TBP altri 2 fattori di trascrizione la TFIIE e TFIIH, la prima ha attivit elicasica mentre la seconda attivit chinasica sulla RNA Polimerasi II, queste reazioni causano rispettivamente unallargamento della bolla di trascrizione e un cambiamento conformazionale alla RNA Polimerasi II che se opportunamente fosforilata nella regione C-Terminale supera la fase di stallo e inizia a diventare processiva. Quarta fase: pulizia del promotore e allungamento Nelle prime fasi la velocit di trascrizione non pu essere elevata a causa delle forti interazioni con tutti gli altri fattori ancora legati alla RNA Polimerasi II. La fase di pulizia del promotore avviene grazie al rilascio del DAB e di TFIIF che avevano inizialmente il solo ruolo di stabilizzare il complesso di inizio. Tale rilascio avviene grazie a opportune fosforilazioni/defosforilazioni della RNA Polimerasi II a livello del dominio C-Terminale che potremmo definire una sorta di pannello di controllo su cui accedono molti altri regolatori della trascrizioni sia in fasi precoci che tardive. Quinta fase: terminazione.

Procarioti

Eucarioti

Dalla figura abbastanza chiaro di come il processo di trascrizione e di regolazione della trascrizione sia estremamente semplice nei procarioti. Le poche regioni regolative superstiti servono per la sopravvivenza.

Fatto questo accenno alla trascrizione negli eucatioti possiamo dire che il processo di assemblaggio di questo macchinario pu avvenire in 3 modi: COSTITUTIVAMENTE: per geni che in ogni tempo ed in ogni condizioni devono essere trascritti; REGOLATA: per geni che devono essere trascritti solo in determinate condizioni; MAI: geni che sono spenti e quindi mai trascritti. Sono presenti molti elementi di regolazione sia a valle che a monte del promotore, siti di legame per proteine che funzionano come repressori, attivatori o repressori/attivatori della trascrizione. Ma un momento fondamentale, senza il quale tutto ci non potrebbe mai verificarsi, il rimodellamento della cromatina. Se ci concentriamo maggiormente sui fattori trascrzionali ci rendiamo conto che essi sono degli oggetti che non hanno cognizione di quello che fanno, la loro funzione dettata dalla loro forma e dalla capacit di cambiare forma, chi detta questi cambiamenti conformazionali sono le interazioni covalenti e non che queste proteine stabiliscono con altre molecole vicine. La regolazione trascrizionale viene definita di tipo combinatoriale per cui la regolazione della espressione di un gene viene fatta da pi proteine. I F.trascrizionali dimerizzano ed agiscono in maniera sincrona con elementi in CIS sul DNA. Raramente in F.trascrizionali che legano il DNA in maniera sequenza specifica hanno una attivit enzimatica in s, nella maggior parte dei casi questi fattori reclutano proteine che non interagiscono direttamente con il DNA ma sono dotate della attivit regolatoria vera e propria. Per cui oltre che combinatoriale la regolazione della trascrizione anche modulare . Ma i F.trascrizionali possono fare ben poco se il DNA riluttante nellinteragire con loro, se condensanto al max. Quindi un altro meccanismo, il principale, di attivazione e repressione della trascrizione si basa sul grado di accessibilit della cromatina. Il DNA si addensa in livelli maggiori fino ad arrivare ad uno stato di condensazione tale da non vederlo bene nemmeno al microscopio. Questa struttura non casuale , dobbiamo pensare che il DNA estremamente delicato quindi lo stato di ipercondensazione lo protegge da eventuali danni meccancici. Il DNA , data la sua delicatezza deve essere esposto solo in casi strettamente necessari, per la replicazione, per la trascrizione e per riparare eventuali danni al DNA. La cromatina costituita da nucelosomi(istoni attorno a cui sono avvolti un giro e un poco di DNA. Il giro e un poco di DNA attorno allistone circa 140bp).

Bene tutto questo casinotto per arrivare a parlare degli ISTONI . Gli istoni sono delle proteine terminalmente evolute, hanno portato a termine il loro processo evolutivo per cui se guardiamo gli istoni di lievito questi sono uguali ai nostri. Inoltre gli istoni svolgono in tutti gli esseri la stessa funzione e sono identici ,quindi uguale anche il DNA , dato che la loro unica funzione quella di legare il DNA. Sono delle proteine globulari dalla struttura estremamente semplice. Si tratta di una catena ad elica lunga collegata a 2 eliche pi piccole. Questa struttura fondamentale viene definita Histon Fold(la struttura molto simile ad una Z) ed presente in tutti gli istoni. Le eliche sono importanti per formare dimeri, tetrametri ed ottametri. H2A ed H2B formano un dimero, lo stesso fanno anche H3 ed H4. i due dimeri insieme formano un tetrametro e i due tetrametri un ottametro. Tutti i legami sono di tipo non covalente. Attorno allottamero gira il DNA. Porzione molto importante degli istoni la coda N-terminale, una struttura molto flessiile ed la parte pi carica positivamente della proteina, infatti interagisce con il DNA che risaputamente carico negativamente. Linterazione DNA coda N-terminale dellistone crea una interazione molto stabile basata su legami di tipo non covalente. Infatti tra il DNA e gli istoni si creano interazioni tipo legame a H , e tra il DNA e la coda N-terminale si creano dei ponti salini. La sequenza di Dna che lega listone differente dalla sequenza di DNA che lega i vari nucleosomi tra di loro. La sequenza di legame agli istoni pi ricca di coppie AT-TA anzich GC-CG perch le basi A e T consentono una maggiore flessibilit e quindi il DNA pu pi facilmente ripiegarsi ed assumere la struttura elicoidale. Non a caso la coda N-terminale ricca in Lys Argi- Gly SerTreo che sono aa che agevolano i movimenti ed infatti la Gly a ingombro sterico pari a zero. Le cariche positive dellArg e della Lys vengono coperte dal gruppo acetile che fa da tappo, ser e tro non sono carichi positivamente ma accettano gruppi fosfato che sono negativi e quindi repellono il legame con il DNA. Gli istoni H3 ed H4 sono quelli maggiormente studiati oltre ad essere quelli pi complessi ed apparentemente sembrano coloro che dettano il legame al DNA. Le modificazioni post-traduzionali possono interessare sia la coda N-terminale che lHiston fold e possono essere:

Mutilazione, per attivazione o repressione della trascrizione pu essere mono-di e tri metilazione(MeK4 repressione, MeK9 attivazione trascrizione). La lisina pu essere mono-di e tri mutilata la Argina pu esere modo e di mutilata con i metili tutti dallo stesso lato o su lati opposti; Acetilazione; Mono-ubiquitinazione: non ha alcun legame con la degradazione una modificazione che serve a reprimere o stimolare la trascrizione; ADP ribosilazione; Deiminazione(arginina diventa citrullina); Isomerizzazione della prolina:. La prolina ha un ruolo importante, non scelto perch ha poco ingombro, anzi, in corrispondenza della prolina si crea un ginocchio e se la prolina passa dalla posizione cis a quella trans cambia tutta la struttura dellistone; Fosforilazione di serina e treonina; Sumoilazione. Gli enzimi che svolgono tutte queste funzioni sono tantissimi perch sono tessuto-specifici , agiscono in base alla posizione del residuo da modificare (per la lys in posizione 1 per esempio agisce un enzima differente da quello che agisce sulla lys 2 e cos via) oppure sono regolati da differenti segnali per cui in base ad ogni segnale viene attivato un differente enzima. Gli attori sono molti e le spiegazioni anche. Tra tutto questo pullulare di enzimi possiamo cmq fare una selezione di quelli maggiormente attivi, almeno nellambito della Acetilazione. Gli enzimi HAT pi famosi fanno parte di tre famiglie: GNAT di cui ricordiamo PCAF; MYST di cui ricordiamo TIP60; P300/CBP che comprende appunto P300e CBP. GNAT

MYST

Lapparteenza ad una stessa famiglia dipende dal fatto che anche gli enzimi che modificano gli istoni sono molto conservati ed hanno una struttura molto conservata. Domini molto importanti e conservati sono il Br dominio ed il Cr dominio. Questi enzimi vengono usati molto spessi come co-attivatori di HAT , ma questo non esclude che questi stessi enzimi possano essere coinvolti anche nella soppressione della trascrizione. Studi in vitro utilizzando enzimi ricombinanti , si potuto vedere quali sono gli istoni favoriti nellattivit dellenzima in questione. Questo banale esperimento ci ha consentito di capire che gli enzimi della famiglia GNAT preferiscono generalmente listone H3 mentre quelli della famiglia MYST preferiscono maggiormente H4. Un ruolo importante anche quello svolto dalle HDA oltre a quello delle HAT, ma mentre di questultimi si sa molto, delle HDA si sa molto meno. Si sa che ci sono tre gruppi : I,II e IV che sono zinco/dipendenti e strappano il gruppo Acetile ed un gruppo, il III , che non strappa lAcetile

ma viene trasferito al NAD che diventa NICOTINAMMIDE ed un altro composto caratterizzato da due adenosine legate da fosfati.

E intuitivo capire che se c molto NAD ossidato , gli enzimi del gruppo III lavorano meglio. Se una cellula in intensa attivit metabolica, produce molto ATP, avr molto NADH e poco NAD e quindi questi enzimi saranno meno attivi e quindi anche la trascrizione genica sar maggiore. Quindi: + NADH+ metabolismo+trascrizione genica+ benessere+ radicali prodottiinvecchiamento. Questo schemino per dire che questi enzimi ci liberano un poco dei radicali liberi, ma per invecchiare il pi lentamente possibile dovremmo praticamente poltrire tutto il giorno(bello ma difficile)per cmq ci evita di andare sempre al max altrimenti saremmo morti a 20 anni.. Si sono creati inibitori delle HDA e se ne stanno cercando altri migliori perch possono essere usati per la cura del cancro. E chiaro che una cromatina pi rilassata maggiormente sensibile ai danni sa radiazioni quindi se inibiamo le HDA favoriamo la condizione rilassata della cromatina. Se potessimo creare un inibitore specifico per la cellula trasformata sarebbe lidela. Ma come hanno fatto a studiare tutte queste, come si visto che esistono tutte queste modificazioni post-traduzionali. Come si studia la cromatina? Gli studi sulla cromatina sono cambiati , si sono evoluti nel tempo perch sono state introdotte tecnologie sempre pi allavanguardia. Inizialmente gli studi si facevano utilizzando lenzima NUCLEASI MICROBICA. Si tratta di un enzima enorme che raglia il DNA ma per farlo ha bisogno di molto spazio per posizionarsi. Lesperimento era molto semplice bastava estrarre la cromatina da cellule e/o tessuti e metterla a contatto con questo enzima per un determinato tempo(deciso da noi). Lenzima ovviamente lavorer tagliando il DNA nei soli punti dove questo non supercondensato e gli unici punti accessibili sono quelli in corrispondenza del DNA linker(il frammento di DNA che intercorre tra un nucleosoma e laltro). Avremo quindi dei frammenti di circa 140bp (la lunghezza del giro e mezzo che circonda listone).

A secondo del tempo di azione dellenzima possiamo pi o meno LADDER frammenti di circa 140bp o multipli di 140bp oppure , se lenzima agisce per poco tempo possiamo avere pochissimo ladder e una sola banda che rappresenta la cromatina non processata assolutamente. La grandezza dei frammenti dipende ovviamente dallaccesssibilit della cromatina, se la cromatina pi acetilata avremo maggiore digestione e quindi frammenti di grandezza inferiore ai 140bp. Con questo esperimento possiamo vedere quale lo stato di condensazione della cromatina di cellule differenti o di un stessa cellula in condizioni differenti. Questa tecnica chiaramente molto grossolana, per migliorarla e renderla pi precisa e pi informativa possibile dovremmo avere Ab che riconoscono precisamente un istone in una determinata condizione di metilazione o acetilazione (.Ex lAb che riconosce precisamente llH3 metilato in posizione 14 ). Ci sono Ab che riconoscono una sola modificazione pot-traduzionale ed enzimi che riconoscono gruppi di modificazioni a carico di uno stesso istone. Una tecnica pi avanzata e che ricorre proprio allutilizzo di questi Ab la tecnica CHIP. Questa tecnica prevede una serie di passaggi che possiamo riassumente cos : Sonicazione random della cromatina prelevata da cellule o tessuti. Si cerca di ottenere frammenti di max 1000bp per ridurre il numero di nucleosomi che ci possiamo ritrovare dentro. In un frammento di 1000bp ce ne sono circa 7 quindi se i frammenti sono pi piccol anche meglio; Incubazione della cromatina con Ab che riconoscono e legano la cromatina con una determinata modificazione post-traduzionale, selezioneremo tutti i frammenti che sono rimasti adesi alla matrice; I frammenti selezionati vengono eluiti dalla matrice e vengono sottoposti a PCR con una coppia di oligo che amplifichino la regione gnomica che comprende il gene di cui volgiamo conoscere lo stato di acetilazione degli istoni. Se abbiamo amplificazione vuol dire che il gene sta in quella batteria di frammenti selezionati in base a quella modificazione ed anceh acetilato poich si ha la amplificazione, il sistema accessibile se non abbiamo amplificazione vuol dire che il nostro gene non sta in quella batteria di frammenti ma sta tra i frammenti sonicati e non positivi allAb e quindi non ha quella modificazione. E ovvio che se i frammenti sono grandi possimoa vere un gran numero di nucelosomi di cui solo alcuni con quella modificazione e per questo positivi allAb , ma altri no ,per questo si cerca di ottenere frammenti sempre piccolini o cmq si possono utilizzare olignt che amplificano una ragiona molto piccola che si pu ritrovare in pi di un frammento. Se volgiamo vedere lo stato di acetilaizone possiamo amplificare la regione vicina alla regione di inizio se vogliamo vedere lo stato di mutilazione meglio scegliere una regione a valle. La cosa migliore sarebbe quella di fare pi chip in modo da creare una mappa degli istoni.in una determinata regione del genoma. Unaltra tecnica pu essere quella di pesare i frammenti ottenuti dalla processazione di cromatina immunoprecipitata con Ab che riconoscono una determinata modificazione istonica. Questa tecnica si avvale della spettrometria di massa. Tutti le tecniche che abbiamo illustrato prevedono una selezione dei frammenti. Nel senso che dobbiamo prima isolare con Ab istoni e porzioni di cromatina, ma se volessimo analizzare la cromatina intera nelle sue condizioni fisiologiche e non? Come facciamo? E ovvio che in condizioni fisiologiche , uno stimolo che porta alla attivazioni di processi di modificazione della cromatina coinvolge parecchi geni e non uno solo. Ex il fattore trascrizionale CREB stato studiato. Se vogliamo sapere il programma di espressione genica innescato da CREB per modificare la cromatina possiamo fare una CHIP on CHIP. Si tratta di un chip sul quale sono adese porzioni di genoma come sonda. Prima facciamo limmunoprecipitazione dei frammenti di cromatina scasssati(una classica chip). Tutti i frammenti positivi a quella modificazione istonica li andiamo a posizionare sul chip dopo averli marcati in modo da avere un segnale e poterlo

individuare. Fatto questo avremo dei segnali in corrispondenza delle zone del chip in cui avvenuto il legame , in questo modo potremo vedere quali geni sono stati coinvolti da quella modificazione istonica in seguito ad attivazione di CREB. Per rendere lanalisi reale dobbiamo fare lo stesso esperimento anche in condizioni basali senza lattivazione di CREB. In seguito ad attivazione di CREB vedremo che ci sar un gran numero di geni che hanno subito delle modificazioni a carico della cromatina. Si sta cercando di creare una mappa delle varie modificazioni degli istoni in seguito a stimoli di varie molecole ma attualmente le informazioni sono ancora incomplete. Quello cjhe per venuto fuori da questi studi e che complica ulteriormente la situazione che questi enzimi che acetilano, deacetilano ecc, non sono coivolti solo in questo. C qualcosa di pi , sarebbe impensabile che tutti questi enzimi differenti tra di loro che fanno al stessa cosa possano servire solo a condensare e decondensare la cromatina , esiste un codice istonico dettato da tutte queste modificazioni un codice che fa in modo che tutto avvenga in modo ordinate. Per esempio un enzima che modifica una lisina funziona solo se riconosce unaltra modificazione in un altro punto o nella stessa posizione operata da un altro enzima. Studi su drosophila , e precisamente sul colore degli occhi del moscerino si visto che la colorazione non era uniforme ma variegata. Questa variegazione dovuta al riarrangimento genico. Continuando nello studio si sono trovati dei loci genici associati a questo fenotipo: Soppressore of variegation Su(Var) Enhancer of variegation E(Var) Questi loci se mutate possono sopprimere o aumentare il positional effect variegation. In base a tutto quello che abbiamo detto, in corrispondenza della cromatina condensata avremo geni spenti ed in corrispondenza della cromatina decondensata avremo geni accesi ed attivi. Pu capitare che un locus genico che prima si trovava in una regione eucromatica si sposta accanto ad una zona eterocromatica e diventare eterocromaic a sua volta e quindi i geni di quel locus si spengono. Ma come lo spieghiamo tutto questo? Questo modello rappresenta il sistema sperimentale ideale per studiare le basi molecolari del fenomeno. Studiando il fenotipo ci si chiesti quali fossero i geni coinvolti e sono stati trovati alcuni geni Su (Var) ed altri E(Var): Su(Var): HDAC, PTPase, SAM-sintetasi E(Var) componenti del complesso SWI/SNF(sistema di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente) Per Su(Var) di intendono tutti gli elementi che stimolano la condensazione della cromatina, vediamo e HDA e anche la SAM che donatore del gruppo CH3 spesso essenziale per la condensazione della cromatina. Ovviamente tutti i geni E(Var) fanno leffetto contrario.

La eucromatina presenta maggiorea cetilazione degli istoni mentre la eterocromatina silente meno acetilata , pi mutilata (mutilazioni pi frequenti son su H3K9,H3K27,H4K20). La eucromatina pu essere presente in due differenti stati: Eucromatina in attiva trascrizione e ci sono alti livelli di acetilazione e trimetilazione a carico di H3K4, H3K36 e H3K79 Standby: per geni che possono essere trascritti , ci sono bassi livelli di mutilazione, acetilazionee fosforilazione. Ci sono poi anche dei domini bivalenti dove sono presenti modificazioni che possono sia attivare che sopprimere la trascrizione ex la metilazione di H3K27 e contemporaneamente metilazione di H3K4. Una cellula staminale ha questa bivalenza, perch ancora non stato determinato il suo destino. Una domanda che ci poniamo : ma ragionevole che anche modificazioni differenti a volte presenti sullo stesso nucleosoma abbiamo come effetto la sola condensazione e decondensazione della cromatina? In realt la risp facile nel senso che non tutto viene lasciato al caso, si fa anche una differenza tra trascrizione e riparazione del danno al DNA. Quando abbiamo un danno al DNA, questo deve diventare accessibile al macchinario del riparo e quindi la cromatina deve rilassarsi. Se per ogni volta che ripariamo un danno, decondensando la cromatina abbiamo il rischio di trascrivere una miriade di geni che non dovrebbero essere trascritti saremmo rovinati. Per questo una cosa sono le modificazioni della cromatina quando ci deve essere trascrizione ed una cosa sono le modificazioni in caso di riparo. Dobbiamo s rilassare la cromatina ma dobbiamo cmq sfavorire la trascrizione. Per questo esiste il codice istonico, segni che consentono alle molecole di comunicare tra loro. Le molecole comunicano tra di loro cos come anche le modificazioni comunicano tra di loro: Modificazioni incompatibili tra loro. Se un residuo metilato per far avvenire la acetilaione dobbiamo prima demetilare e poi acetilare, se non demetiliamo abbiamo voglia di aggiungere HAT non avremo mai acetilaizone; Una modificazione pu ostacolare il legame di una proteina ad unaltra molecola. Ex MeH3K19 la modificazione che consente il legame di una proteina, se abbiamo contemporaneamente PH3K10 la proteina non si lega. Quindi lo stato di un istone detta lo stato di un altro istone; Una modificazione pu ostacolare lattivit di un enzima modificatore oppure pu favorire la modificazione di un altro residuo. Le proteine comunicano tra loro toccandosi, come abbiamogi detto, e i domini di interazione tra proteina e proteina sono i Br ed i Cr domini, che legano proteine e riconoscono proteine in

corrispondenza di determinate modificazioni post-traduzionali. Ex i Cr-domini riconoscono Me-K, mentre i Br-domini riconoscono Ac-K. Un esempio di proteine che contengono Br-domini sono PCAF ,P300 che sono delle HAT e legano le proteine in porzioni acetiate riconosciute grazie al Br-dominio ed agiscono come acetilasi . le Var funzionano cos, leggendo le informazioni scritte sugli istoni riscrivono anche zone che si trovano in una condizione differente quindi se una zona eucromatina si sposta vicino ad una eterocromatica , le HAT che si legano alla cromatina in base al codice scritto, acetilano tutto uguale cosa se abbiamo interazioni di HDA quando una zona eterocromatica trasloca accanto ad una eucromatica. Ora possiamo porci una domanda, date tutte le spiegazioni avute e tutte le nuove cose imparate. Ammettendo che la eterocromatina non nasca tale perch altrimenti non avrebbe motivo di esistere proprio, che ci conserviamo a fare geni che non sono mai stati trascritti e che non saranno mai trascrittti? Se pensiamo questo concludiamo che eterocromatina si diventa e non si nasce. Quindi ora analizziamo il silenziamento della eterocromatina e della eucromatina. SILENZIAMENTO ETEROCROMATINA Sui domini bivalenti intervengono delle HDA che deacetilano le sequenze istoniche; Intervengono poi delle HMT che mutilano la lisina 9 di H3

Hp1 lega MeK9 H3 e polimerizza favorendo la condensazione della cromatina. SILENZIAMENTO DELLA EUCROMATINA

Quando dobbiamo spegnere determinati geni dobbiamo stare attenti che i geni vicini che devono rimanere accesi non siano coinvolti. E2F, una proteina coinvolta nel ciclo cellulare sta normalmente lavorando nelle cellule. Ipotizziamo che si verifichi un danno al DNA che deve essere riparato e prima di tutto di deve bloccare il ciclo cellulare. La proteina retinoblastoma(Rb) sta tranquilla nel suo stato inattivo , ma non appena c il segnale di danno Rb-P viene defosforilata e si dirige nel nucleo portandosi con se SUV( una HMT) ed HP1. nel nucleo Rb trova E2F seduta sui geni di cui stimola lespressione, e vi si lega sfruttando la presenza di E2F su quei geni per spegnerli. Rb legato ad E2F porta con s SUV edHP1 che lavorano su quei geni. SUV metila ed HP1 si lega alla MeK9-H3 e condensa la cromatina in quel punto, bloccando i geni che intervengono nel ciclo cellulare in modo che questo non proceda. Nel frattempo la cellula ripara il danno e la fase S del ciclo cellulare pu ripartire, Rb viene fosforilato e se ne va lasciando E2F libera di agire. Rimane per la metilazione sulla lisina ) che sar poi tolta da una HDM. Abbiamo parlato dei danni al Dna e di come Rb insieme a SUV e HP1 evitino la trascrizione di geni che consentono di avanzare nel ciclo cellulare ma non abbiamo parlato di cosa succede sul luogo del danno al Dna. Al Break point si lega una proteina nota come TRRAP. Questa proteina un cofattore delle HAT ed insieme TRRAP/HAT acetilano tutti gli H per consentire il rilassamento della cromatina e riparare il danno. Una volta riparato il danno la situazione ritorna perfettamente alla normalit, ma ci sono ipotesi secondo le quali il processo di mutilazioni delle regioni riparate non sia lo stesso in seguito al riapro del danno. A livello del punto di rottura si crea una cicatrice per cui sarebbe possibile individuare quali regioni hanno subito dei danni che per sono stati correttamente riparati ma che meglio trattare con maggiore delicatezza. Si parlato di TRAPP ed stata indicata come specifica proteina che lega il break point, ma noi sappiamo che non sar di certo la sola ma perch tutto questo interesse su TRRAP? Per una serie di esperimenti che facilmente illustreremo. I ESPERIMENTO Si sono create cellule KO per TRRAP e si sono studiate e si visto che le cellule TRRAP nulle sono pi sensibili al danno al DNA. Sono stati questi risultati che hanno acceso linteresse verso TRRAP. Allora partiamo per gradi. Prima si sono dovuti creare i KO e si possono ottenere in due modi: Generare un topo KO da cui prendere le cellule. Questo metodo stato abbandonato perch i topi omozigoti morivano; Generare un KO eterozigote, epoi far diventare le cellule KO omozigoti. Le cellule KO eterozigoti hanno su un allele il gene codificante per TRRAP sostituito con una sequenza qualunque che non crea danni laltro allele invece stato modificato in modo da avere la regione genica di TRRAp fiancheggiata da due siti LoxP. Quindi le cellule saranno KO eterozigoti per TRRAP e KI per i sii LoxP. I siti LoxP vengono riconosciuti e tagliati da un enzima di E.coli noto come CRE ricombinasi che appunto taglia a livello dei siti e ricombina le due estremit. La tecnica utilizzata ovviamente la seconda dato che la prima non ci dava niente per anche le cellule KO-/- non sopravvivevano allora si fatto in modo da far esprimere la CRE solo transientemente quindi transiente era lo stato di KO-/-. Si partiti da questo punto per avere cellule che esperimessere transientemente la CRE , poi si passati alla CRE inducibile. Una CRE presente nelle cellule ma non attiva , viene attivata solo quando alle nostre cellule diamo linduttore. In seguito allinduzione la CRE agisce ed avremo quando vogliamo il nostro KO -/-. Per alcune ore, dipende anche dal tournover della cellula, avremo un certo numero di cellule KO -/-.

Una volta ottenute le cellule come noi le desideriamo le confrontiamo con le cellule eterozigoti e facciamo tutti i nostri studi. 1. il primo studio che si fatto stato il COMET ASSAY. Il saggio prevede linduzione del danno alle cellule, sia le KO -/- che le KO-/+. Una volta indotto il danno le cellule vengono inserite in un gel dagarosio e vengono sottoposte ad elettroforesi.. Dopo la corsa elettroforetica il gel viene sottoposto ad un processo di colorazione per evidenziare la migrazione e viene analizzato al microscopio analizziamo tutto quello che successo. Quello che si vede una cometa, c il nucleo tutto colorato pieno di DNA e poi abbiamo una coda in direzione della corsa elettroforetica. La grandezza della coda e lintensit di luminosit una misura indiretta dellentit del danno riportato. Il programma in grado anche di calcolare, direttamente il TALE moment. 2. tutte le cellule sia eterozigoti che omozigoti vengono irradiate. Tutte riportano danno al dna ma dopo 6 ore le cellule eterozigoti hanno riparato mentre quelle omozigoti, che tra laltro riportavano un danno maggiore, non avevano ancora riparato niente. FIGURA 1

FIGURA 2

Nella figura 1 abbiamo cellule eterozigoti ed omozigoti non irradiate e vediamo che quando non viene indotto il danno le cellule omozigoti sono perfettamente normali. Nella figura 2 vediamo le stesse cellule per sottoposte a radiazioni e facciamo un time corse a varie ore dopo lirradiazione. La cosa che notiamo che a 3 ore e 6 ore il danno nelle cellule omozigoti leggermente diminuito e allora che significa? Le cellule omozigoti non sono in grado di riparare il danno. Questo possiamo spiegarlo in due modi almeno: 1. i sistema sperimentale caratterizzato da popolazioni cellulari miste che hanno subito lazione della CRE ed altre no e il saggio considera tutte le cellule. 2. quando facciamo il KO di TRRAP avremo, fino a quando tutta la proteina endogena viene eliminata, una certa quota di proteina che continuer a funzionare e funziona ancora a 6 ore perch lemivita della proteina di circa 3 ore quindi dopo 6 ore avremo ancora il 25 % dellattivit proteica e per questo abbiamo un minimo riparo del danno.

II ESPERIMENTO Abbiamo bisogno di una tecnica che ci consenta di misurare il fenomeno di ricombinazione omologa che sta alla base della maggior parte dei meccanismi di riparo del DNA. Lesperimento che illustro essenzialmente si basa sullutilizzo di un enzima di restrizione (SceI) che non h nemmeno un sito di riconoscimento nel genoma umano e murino. Quindi trasfettiamo le nostre cellule con un costrutto contenete la sequenza di riconoscimento per SceI che avr solo quel sito di taglio e vediamo che succede.

Questo il costrutto che abbiamo sintetizzato. Andando dal 5 al 3 vediamo che c la sequenza che codifica per lenzima SceI che faremo esprimere alle cellule, seguita dalla sequenza che codifica per la GFP, si tratta di una sequenza mutata che porta ad una proteina tronca non funzionante, all interno della GFP abbiamo la sequenza riconosciuta e tagliata da SceI. A valle di questa zona abbiamo una GFP tronca che manca del pezzo al 5 e quindi non pu funzionare cos. Inserendo questo costrutto nelle nostre cellule oi potremo valutare il fenomeno di ricombinazione omologa semplicemente guardando le cellule al microscopio. Una volta inserito questo costrutto nelle cellule avremo espressione di tutto quello che contiene, dellenzima SceI e delle due GFP che non funzionano. Lenzima SceI andr a tagliare la sequenza presente nel costrutto, che noi abbiamo inserito perch il genoma di topo normalmente non la contiene.

SceI taglia la sequenza che riconosce. Il taglio operato deve essere ricucito e quindi il frammento che rimane appeso dopo il taglio dovr cercare qualcuno con cui legarsi per ricostruire la sequenza. Ma la GFP noi normalmente non la esprimiamo quindi potr, per ricombinazione omologa e complementariet, solo legare la sequenza di GFP che avevamo messo a valle e che era mancante della parte iniziale. Dopo la ricombinazione avremo una sequenza fatta della parte iniziale della prima GFP e la parte finale della seconda GFP. Questa GFP funzionante e quindi le cellule si coloreranno di verde.

Alla fine dellesperimento andremo a leggere al FACS tutte le cellule verdi che indicheranno il numero di cellule in cui la ricombinazione avvenuta correttamente. Ovviamente il costrutto che abbiamo inserito nelle cellule stato messo in un posto in cui non d fastidio.

Risultato della lettura. La percentuale di cellule TRRAP -/+ che hanno riparato il danno sono il doppio rispetto a quelle TRRAP -/- . III ESPERIMENTO E un esperimento altrettanto semplice. Si basa sempre sul costrutto precedente. Le cellule contenenti questo costrutto vengono sottoposte ad immunoprecipitazione della cromatina con Ab che riconoscono H4Ac oppure H3Ac. I frammenti selezionati vengono amplificati per PCR con oligo vicici alla regione in cui SceI taglia. Cellule che non hanno subito il taglio di SceI hanno bande della stessa intensit sia se sono eterozigoti per TTRAP che KO. Quando il taglio di SceI avviene abbiamo che le cellule TRRAP-/+ aumentano i livelli di acetilazione e quindi avremo pi amplificato mentre le cellule TRRAP -/- non acetilano(questo utilizzando sempre oligo che amplifichino la regione di rottura). Se usiamo oligo lontani non avremo amplificazione perch quella regione essendo troppo lontana dal danno non subir acetilazione e quindi non immunoprecipiter.

In queste acetilazioni TRRAP centra qualche cosa dato che cofattore di alcune HAT tra cui Tip60. IV ESPERIMENTO

Vengono utilizzate cellule KO -/+ e KO-/- trattate con la SceI e si vede se e quando Tip60 iene reclutata sul luogo del taglio. A 36 le Tip60 corre sul sito del taglio, nelle cellule KO -/+ ma non in quelle -/-.

Come possiamo chiaramente vedere dalla foto, nelle cellule KO -/- non viene reclutato n Tip60 n TRRAP. V ESPERIMENTO Entrano in gioco altri attori. La proteina 53Bp1 lega i siti di rottura sul DNA e segnale P53 del danno in corso. Lesperimento organizzato cos: Irradiamo le cellule e con Ab contro 53BP1 andiamo a vedere se questa si accumula in corrispondenza del danno. Al microscopio confocale vediamo la formazione di foci nelle cellule TRRAP-/+ irradiate mente non li vediamo nelle cellule TRRAP-/-. Questa stessa analisi la facciamo anche per BRCA1 e RAD51, il risultato lo stesso foci nelle TRRAp-/+ e niente foci nelle TRRAP-/-. Questo primo step gi ci aiuta a capire un poco di cose, il fatto che TRRAP sia implicato nella acetilazione e pi precisamente ne riparo perch quando non c TRRAO si riduce la acetilazione e quindi le proteine del riparo non possono accedere al DNA. Questo risultato lo possiamo interpretare e cercare di spiegare almeno in due modi differenti. 1. lassenza di TRRAP determina una interruzione della via di segnalazione alle proteine del riparo 2. il segnale non intaccato ma una questione di riduzione del rimodellamento della cromatina per cui le cellule non hanno spazio da occupare. Quindi il problema una interruzione del codice istonico. La via di segnalazione non ha problemi, infatti ATM, una proteina coinvolta nella segnalazione non subisce riduzioni di attivazione nelle cellule TRRAP-/-. Lo stesso risultato si ottiene anche considerando altre proteine. Per quanto riguarda il codice isotnco il problema legato al fatto che non si come sia fatto e come studiarlo. E stato fatto un esperimento in cui vengono inibite le HDA, utilizzando Sodio Butirrato. In seguito al trattamento abbiamo un aumento dei foci nucleari di alcune proteine e si vede anche una

riduzione della acetilaizone dellH4 da parte di Tip 60 indice di un riparo del danno non completamente corretto. Ma chio dice a Tip60 e TRRAP di andare sul sito del danno? E come viene attivata la via di segnalazione? Queste proteine sono gi presenti nelle cellule anche prima del danno tanto vero che un topo che sovra- esprime C-Myc viene messo in un background con poco Tip60 ll sviluppo neoplastico accelerato. CELLULE STAMINALI Le cellule sraminali sono cellule dotate di due caratteristiche: Self-renewal. Dividersi generando cellule in tutto e per tutto uguale a s stesse; Differenziare in tipi cellulari differenti da cui origineranno tessuti differenti. Ci sono SC sia nelladulto, e si tratta di cellule con limitata capacit differenziativa, differenziano solo in alcuni o pochi tipi cellulari, ma mantengo il self-renewal . e SC embrionali (ESC) che son in grado di generare un individuo intero. Le SC rappresentano il futuro sia nella medicina farmacologica che in quella sostitutiva. La divisione di una SC viene definita di tipo ineguale perch dividendosi in grado di dare origine ad una cellula uguale a s stessa e ad una cellula COMMITTED verso un determinato differenziamento. Si parla di cellule TOTIPOTENTI, come le ESC che generano tutti i tipi cellulari in teoria perch in realt la cellula staminale totipotente d origine ai progenitori di una determinata linea cellulare, ceh sono cellule PLURIPOTENTI che daranno origine ad un pi ridotto numero di tipi cellulari che vengono definite cellule MULTPOTENTI che danno origine ad uno o pochissimi tipi cellulari. Quello che a noi interessa maggiormente , noi intesi come comunit scientifica al cellula totipotente , la ESC. Tale concetto di totipotenza si concentra nello zigote che rappresenta la cellula uovo fecondata da uno spermatozoo. Il concetto di totipotenza permane fino al momento in cui lo zigote non diventa embrione che si impianta nellutero. Lo zigote(cellula uovo appena fecondata) dopo 3-4 divisioni cellulari diventa MORULA(mucchietto di cellule senza nessuna polarit e non ancora impiantate nellutero). La Morula, dopo alcune divisioni cellulari diventa BLASTOCISTI in cui le cellule sono strutturalmente organizzate. C uno strato di cellule esterne che avvolge una cavit piena di liquido e al centro di questa cavit(pi o meno al centro) c lINNER CELL MASS (ICM). Saranno le cellule dellICM a dare origine allindividuo completo mentre le cellule esterne formeranno i tessuti extra- embrionali.

Da questo punto in poi avremo il differenziamento: DallICM si origina prima l endoderma primitivo da cui si originer il cordone ombelicale e tutte le strutture che mettono in connessione la madre con il bambino; Impianto della blastocisti nellutero e formazione dei vari tessuti;

Formazione dellectoderma primitivo da cui si genereranno i tre foglietti embrionali(ectoderma, mesoderma ed endoderma) e le cellule della linea germinale. Le cellule che possiamo prelevare e che conservano ancora completamente la totipotenza sono le cellule della ICM della blastocisti. Ci sono anche delle cellule di carcinoma embrionale che sono molto simili alle ES ma che ES non sono. Come dimostrare la totipotenza delle ES? 1. Piastrando le ES raccolte dalla blastociste , propagarle i coltura e poi sollecitarne il differenziamento; 2. iniettandole sotto cute ad un topo e analizzare leventuale formazione di teratomi che sono formati da una serie di abbozzi tissutali; 3. possiamo prendere due topini di colore differente tipo neri e bianchi per facilitare lanalisi. Prendiamo le ES dalla blastocisti della topine nera e le impiantiamo nella blastocisti di una topina bianca e la blastocisti la mettiamo in una topina bianca pseudo-gravida(FOSTER). Al parto avremo dei topini che hanno parte del corpo bianca e parte de corpo nera qualora le cellule delle topina nera siano andate a colonizzare le cellule del bulbo pilifero, se le cellule della topolina nera sono andate a colonizzare la linea germinale avremo che tutta la progenie di quel topino tutto bianco o mezzo bianco mezzo nero saranno tutti neri. Le ES in coltura possono diventare progenitrici dellendoderma, mesoderma, ectoderma e trofoblasto. Per quanto riguarda la line germinale ci sono dei dubbi, c chi dice che derivi anchessa dallES c chi dice che derivi da momenti differenziativi successivi do uno dei tre foglietti embrionali. Ricordiamo che i progenitori delle ES sono cellule pluripotenti e non totipotenti. E le cellule pluripotenti noi le possiamo tranquillamente trovare anche nelladulto e queste SC sono spesso causa di sviluppo tumorale. E ovvio che una cellula differenziata nonpu dare origine ad un tumore per il semplice fatto che no in grado di proliferare e crescere. Inoltre ci sono SC nelladulto di cui non capiamo la presenza, ex i neuroni , infatti quando un neurone muore non si pu fare niente allora a che servono le NSC. Detto questo focalizziamo maggiormente il punto di interesse. Ma quali sono le basi molecolari della staminalit? Capire la basi molecolari estremamente importane, ma voi riuscite ad immaginare a quello che potrebbe succedere se fossimo in grado di generare ESC ? potremmo rigenerare tessuti, potremmo sostituire cellule malate ecc. Dopo studi estenuanti si sono trovati i protagonisti, si tratta di 3 fattori trascrizionali senza i quali non vi staminalit. OCT4, NANOG e Sox2. Un esempio rapido che ci dimostra limportanza di queste proteine nella staminalit il seguente esperimento. Semplicemente le cellule sono state private di uno di questi fattori e cosa succede? Se togliamo OCT4 lo sviluppo embrionale si ferma a morula, tutto diventa essenzialmente trofoblasto, non si forma la ICM e nientaltro. Se togliamo NANOG lo sviluppo embrionale si ferma poco dopo al livello della bastocisti precoce senza formazione della ICM. Si perde la staminalit e i ha differenziamento sempre il trofoblasto. Se togliamo Sox 2 abbiamo un esito molto simile a quello ottenuto togliendo OCT4 infatto OCT4 forma un dimero con Sox2. c per una differenza, mentre OCT4 pu funzionare anche da solo, Sox 2 no. Dai risultati ottenuti possiamo generalizzare dicendo che OCT4e Sox 2 bloccano il differenziamento verso trofoblasto mentre Nanog blocca il differenziamento in endoderma primitivo. Questi fattori bloccano il differenziamento e consentono di mantenere la staminalit quindi sono sia dei repressori che degli attivatori perch per ottenete questo risultato bisogna attivare qualcosa ma reprimere altre cose. Il sistema formato da questi fattori si automantiene. Il promotore di Nanog

presenta siti di legame per il dimero Sox2-OCT4 oltre ad avere anche un sito per Nanog. Quidi per spegnere questo circuito ci vuole una decisione forte eche sembra essere irreversibile. A livello molecolare possiamo fare un altro passettino in avanti indicando quali sono i pathway che regolano lattivazione o meno di questi fattori. Per quanto riguarda OCT4 e Sox 2 questi sono controllati dal pathway di Wnt. Per quanto riguarda Nanog non si sa ancora bene ma si pensa possa essere coinvolto il recettore per il LIF. Questo pathway porta allattivazione della proteina STAT3 che ah una funzione simile a Nanog. In merito al LIF possiamo dire qualcosa in pi, infatti le cellule in coltura devono essere mantenute sempre con il LIF altrimenti differenziano immediatamente. Bene questo non succede in vivo infatti il topo KO per STAT3 ha il blocco molto a valle. Non si sa bene come la necessit del LIF si comincia a sentire intorno a 8.5 giorni(la gravidanza del topo dura circa 18 giorni)e cmq il topo senza LIF nasce, vero che nasce morto ma con tutti i tessuti perfettamente formati. Ci sono inoltre delle evidenze che indicano un ruolo da parte di questo sistema nel regolare STAT3. Ma ora la questione differente perch in un certo senso ci siamo fermati. Conosciamo pi meno quali sono i pathway, conosciamo quali sono i protagonisti principali ma non sappiamo su chi questi protagonisti agiscono. Potrebbero essere fattori trascrizionali a loro volta e potremmo andare avanti cos per ore o giorni. Possiamo fare unanalisi combinata di espressione genica ed accoppiare questo risultato con un esperimento che ci consente di vedere su quali geni si siede per esempio OCT4 ma potrebbe essere Nanog o altri, basta immunoprecipitare con lAb diretto contro OCT4 o Nanog ed in base al profilo di espressione valutare se i geni su cui seduto OCT4 sono espressi e come. Per esempio se quando togliamo OCT4 vediamo che si accendono 1000 geni andiamo a vedere quali di quei geni hanno OCT4 seduto sopra. Una tecnica molto costosa secondo il mio modesto punto di vista quella basta sul sequenziamento. Il primo passaggio prevede limmunoprecipitazione della cromatina con un Ab(facciamo lesempio con OCT4) diretto contro OCT4 , quindi tireremo gi tutti i pezzi che contengono OCT4 da qualche parte. Allimmunoprecipitazione segue il clonaggio.in modo da isolare dei tag di Dna pi piccoli. Alle de estremit dellinserto ci sono le sequenze di riconoscimento per enzimi di restrizione che tagliano a 17 nt di distanza, allinterno del nostro inserto, dal sito di riconoscimento. Dopo il taglio le due estremit vengono ligate e quindi avremo un inserto fatto da 17+17 nt, quelli ottenuti dal taglio. Questi 34nt sono sufficienti per identificare una regione di DNA. Se un frammeto di 17+17 noi lo vediamo una sola volta non gli diamo importanza se invec uno lo r