Aspetti molecolari di Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi

Alessandra Carattoli Istituto Superiore di Sanità, Roma

in breve

1. Meccanismo d’azione beta-lattamici

2. Meccanismi di resistenza ai carbapenemi

3. Tipizzazione molecolare dei ceppi

4. Le carbapenemasi di successo

a) VIM-1

b) OXA-48

c) KPC

d) NDM-1

Meccanismo d’azione dei beta-lattamici interazione con proteine della sintesi del peptidoglicano

(transpeptidasi, endopeptidasi e carbossipeptidasi) “penicillin binding proteins”

Spazio Periplasmico

PBP

GRAM +

PORINA

GRAM -

LPS

MEM

+

-

Hodge Test

Resistenza ai carbapenemi in Klebsiella pneumoniae

1- Produzione di beta-lattamasi e ridotta permeabilità al farmaco

Ceppi ESBL ERT IMP MEM

ERT-R POS R ≥ 8 R ≥ 8 R ≥ 8

ERT-R POS R ≥ 8 S ≤ 1 S = 1

ERT- S POS S ≤ 0.5 S ≤ 1 S ≤ 0.5 19-

26-

37-

49- 64-

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-porina

MW

ETP R MEM R IMP I ETP R WT

Produzione di beta-lattamasi e ridotta permeabilità al farmaco

Outer membrane proteins (OMPs) porine

MEM

+

-

Hodge Test

2- Produzione di carbapenemasi

Resistenza ai carbapenemi in Klebsiella pneumoniae

b-lactamasi

Penicillins Early

generation

cephalosporins

Second and

third

generation

cephalosporins

b-lactam/

b-lactamase

inhibitor

combinations

Carbapenems

ESBL

Cephalosporinasi, o AmpC

Oxacillinase

Metallo-beta Lattamasi

SHV, TEM, CTX-M KPC, GES

IMP, VIM, NDM

CMY, FOX, MOX, LAT

OXA48

OXA58

OXA23

OXA1

Primer Sequence, 5′ → 3′ Gene Product size, bp

IMP-F GGAATAGAGTGGCTTAAYTC blaIMP 232

IMP-R TCGGTTTAAYAAAACAACCACC

VIM-F GATGGTGTTTGGTCGCATA blaVIM 390

VIM-R CGAATGCGCAGCACCAG

OXA-48-F GCGTGGTTAAGGATGAACAC blaOXA-48 438

OXA-48-R CATCAAGTTCAACCCAACCG

NDM-F GGTTTGGCGATCTGGTTTTC blaNDM 621

NDM-R CGGAATGGCTCATCACGATC

KPC-Fm CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG blaKPC 798

KPC-Rm CTTGTCATCCTTGTTAGGCG

a) Identificazione geni delle carbapenemasi.- PCR- sequenza

Plasmidi : Molecole di DNA circolari extracromosomali che replicano autonomamente dal cromosoma batterico Non portano geni essenziali per la vita del batterio, ma geni accessori (resistenze) di cui promuovono il trasferimento orizzontale

VIM-1: Epidemia di un plasmide IncN

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(Miriagou et al 2010, Carattoli et al. 2010)

Nordmann et al. EID 17, 2011

Elementi mobili

Altri geni di resistenza

Replicazione VIM-1

Geni plasmidici

pOXA-48a

Klebsiella pneumoniae,

61,881 bp

JN626286

HIJK priLMNOPQRUWXY

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Oxa-48: Epidemia di un plasmide IncL/M

Nordmann et al. EID 17, 2011

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20

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40

50

60

70

Giugno 2008 -

Dicembre 2009

Ottobre 2010 - Maggio

2011

Ceppi ES-Kp

Ceppi ER-Kp

Ceppi KPC-3-Kp

K. pneumoniae KPC-positive 2010-2011

Tipizzazione dei ceppi

FINGERPRINTING

TYPING

MLST: Basato sulle sequenze 7 Geni housekeeping Potere discriminante moderato

AFLP, PFGE: Basato sulle bande Genoma intero Potere discriminante alto

Brisse et al. PlosOne 2009

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

gap infB mdh pgi phoE rpoB tonB ST

2 9 2 1 13 1 16 37

54 3 1 1 1 1 79 512

3 3 1 1 1 1 79 258

Multi Locus Sequence Typing (MLST) PCR e sequenza di 7 geni conservati

Tipizzazione dei ceppi

MK

ST37

ST512/ST258

Multiplex Real-Time PCR for Detection of an Epidemic KPC-Producing Klebsiella pneumoniaeST258 Clone Chen et al. Antimicrob. Agents Chemother.June 2012 vol. 56 no. 6 3444-3447

KPC- in un trasposone

P9-KPC-2

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IS2

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Plasmidi di K. pneumoniae ST258 Garcia-Fernandez et al. 2012 AAC 56(4):2143-5

Iron (3) uptake, ABC transporter trimethoprim, sulfonamidi, streptomicina, cloramphenicolo

macrolidi rame e argento

aminoglicosidi

arsenico

pKpQIL, Israel, 113637 bp, NC_014016

ALEKBPV WU N FQ HGSTDIX MJY ALEKBPV WU N FQ HGSTDIX

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KPC-3 mercurio

Leavitt, et al. 2010. Antimicrob.

Agents Chemother. 54: 4493-4496.

Elementi mobili

Altri geni di resistenza

Replicazione KPC Geni virulenza

Geni plasmidici

KP e New Delhi Metallo Beta Lactamase

Epidemia di un gene: NDM-1 Elementi mobili diversi

Giske C G et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2012;56:2735-2738

Epidemia di un gene: NDM-1 Cloni diversi

I plasmidi più diffusi con NDM-1

IncA/C pNDM-1_Dok01, Escherichia coli , Japan, 195560 bp, AP012208, Sekizuka et al. 2011

DN

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IncA/C pNDM-KN, Klebsiella pneumoniae, Kenya, 162746 bp, JN157804, Carattoli et al. 2011

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IncA/C pNDM10505, Escherichia coli , Canada, 166744 bp, JF503991, Boyd et al. 2011

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sulfonamidi, aminoglicosidi, cloramphenicolo, eritromicina, rifampina

sulfonamidi, aminoglicosidi

CMY 16S rRNA methylase RmtC

ArmA

RmtC

Elementi mobili

Altri geni di resistenza

Replicazione NDM-1 Metilasi, restrizione

Geni plasmidici

Conclusioni

•Clone dominante ST37 con difetto di porine e produzione ESBL fino alla comparsa del primo ceppo di K. pneumoniae positivo per KPC-3

•Produttori di carbapenemasi hanno sopraffatto quelli ESBL-porine mutanti

•Espansione di un clone di successo: epidemia KPC-3::ST258

•Tipizzazione molecolare necessaria ma in caso di ceppo clonale insufficiente

•Diffusione orizzontale dei geni delle carbapenemasi mediata da plasmidi

•L’associazione fisica di geni che conferiscono resistenza a classi diverse di antibiotici sui plasmidi viene positivamente selezionata da ognuno dei singoli antibiotici codificati

•Epidemia di geni (NDM-1), di plasmidi (VIM-1, OXA-48), di cloni (KPC-3::ST258)