Lecco, 15 dic 2005Francesco Ronzon 1 Statistica applicata allanalisi microbiologica.

Lecco, 15 dic 2005 Francesco Ronzon1

Statistica

applicata all’analisi

microbiologica

Lecco, 15 dic 2005Francesco Ronzon2

Licenza

Tu sei libero:• di riprodurre, distribuire, comunicare al pubblico, esporre in pubblico, rappresentare, eseguire o recitare quest’opera• di creare opere derivate

alle condizioni citate in:http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/

per informazioni contatta Francesco Ronzon

e.mail:

Questa presentazione è parte del progetto:

http://www.iperserver.it/mediawiki/

Obiettivo

“presentare statistica applicata all’analisi microbiologica con approccio pragmatico”

“chiarire aspetti relativi al corretto utilizzo di alcune tecniche statistiche e loro significato interpretativo”

Quadro generale

Perché la statistica? difficoltà intrinseche all’analisi microbiologica (fattori della variabilità)

alta variabilità = bassa qualità Con la Statistica voglio:

– Tenere sotto controllo variabilità– Valutare metodi– Avere una misura dell’errore delle mie affermazioni

(valutazione quantitativa dell’incertezza) Quale parte della statistica si applica nel laboratorio di

microbiologia?

vedremo

Argomenti affrontati

Statistica descrittiva e inferenziale Concetti di base Distribuzioni statistiche Stime, Intervalli di confidenza, Test La variabilità nel campione microbiologico Test specifici del laboratorio microbiologico Esercizi pratici

Iniziamo…

S ta tis t ica d esc rit t iva S ta tis t ica in fe ren z ia le

S ta tis t ica

Quando entra in gioco la probabilità?

S ta tis t ica d esc rit t iva S ta tis t ica in fe ren z ia le

S ta tis t ica

Conosco tutto Conosco parte (campione)! Certezza Incertezza ?

Quadro argomenti

in d ic i d ip os iz ion e

(e s . m e d ia )

in d ic i d id isp ers ion e

(e s . va ria n za )

In d ic i G ra fic i

S ta tis t ica d esc ritt iva

S tim aP u n tu a le

In te rva lli d icon fid en za(e s . 9 5 % )

S tim a interva llare

S tim e

Tes t S p ec ific id i m ic ro b io lo g ia

Tes t d i s ig n ifica tività(e s . 5 % )

S ta tis t ica in fe ren z ia le

S ta tis t ica

Statistica descrittiva - Grafici

2001 2002 2003 2004

2001 2002 2003

Istogramma

Es. Confronto conteggio tra operatori

Capsula I Capsula II Capsula III

UFC Operatore A

Operatore B

Resp. Sez.

Grafico a torta

% Conteggi accettabili operatore x

Conteggi risultati accettabili

Conteggi risultati non accettabili

Grafici da evitare

Istogramma 3D

Grafici da evitare

Linee 3D

Grafici da evitare

Torte 3D

Conteggi risultati accettabili Conteggi risultati non accettabili

Statistica descrittiva - Indici

In d ic i d i p os iz ion e(o te n d e n za ce n tra le )

In d ic i d i d isp ers ion e(va ria b ilità )

S ta tis t ica d esc ritt ivaIndici

Statistica descrittiva - Indici

Indici di Posizione(ordine di grandezza)

Media– Aritmetica– Quadratica

Quartili, percentili Moda Mediana

Indici di Dispersione(variabilità)

Valore max, min Campo di variazione Varianza Deviazione Standard Coefficiente di

variazione (CV)

Indici di posizione(misure di tendenza centrale)

Media: è il valore “medio” dei miei datiMediana: è il valore centrale dei miei dati

(dopo che li ho ordinati, dal più piccolo al più grande)

Moda: è la caratteristica o valore che si presenta più frequentemente

Indici di posizione

Media aritmetica

In Excel: MEDIA(dati)

Indici di posizione

Media quadratica

Esempio:

la ripetibilità di conteggio totale del laboratorio è la media quadratica delle ripetibilità dei singoli operatori.

21 ...

Indici di posizione

Mediana

È il valore “x” che mi permette di dire che il 50% dei valori sono maggiori di “x” ed il 50% sono più minori.

1, 3, 5, 7, 18

3, 5, 7, 9

Mediana = 5

Mediana = 6In Excel: MEDIANA(dati)

Quartili e percentili

Una volta ordinati i dati: Con la mediana li divide in due gruppi: 50% e 50% Con i quartili li divido in 4 gruppi (da 25%) Con i percentili li divido in 100 gruppi (da 1%)

– Il 25° percentile viene chiamato primo quartile,– il 50° coincide con il secondo quartile ovvero con la mediana– il 75° percentile viene detto terzo quartile.

Indici di posizione

È il valore + frequente(il punto più alto nei grafici di frequenze)Utile per descrivere dati in categorie

Es. (8,3,8,9,2,4,3,8,8,4,2,8,5,2,8,8,2,6,8)

Moda=8 (Mediana=6, Media=5,58)

In Excel: MODA(dati)

Media, moda e mediana - esempio

Media, moda e mediana

Mediana

ma… la “posizione” non basta

distribuzioni con stessa media e “variabilità” diverse

Indici di dispersione(misure di variabilità)

Valore max, min Campo di variazione = max–min (ingl. Range) Deviazione Standard Varianza Coefficiente di variazione (CV)

Deviazione standard (popolazione)

In Excel: DEV.ST.POP(dati)

Deviazione standard (popolazione)

È espressa nella stessa unità di misura dei dati Detta anche:

– Scarto tipo (fr. Écart type) – Scarto quadratico medio– Standard Deviation

Da non confondere con Devianza o Errore Standard:

2 Nidevianza

.2. StErrorestimaconfidenzaInterv

Deviazione Standard suoi effetti

Varianza (popolazione)

In Excel: VAR.POP(dati)

È il quadrato della deviazione standard È la “media” dei quadrati delle deviazioni dalla

Coefficiente di Variazione (popolazione)

Misura la dispersione percentuale in rapporto alla media

E’ un numero senza unità di misura, quindi consente di confrontare la variabilità di fenomeni con unità di misura diverse.

Uso tipico con numeri positivi e media non nulla detto anche Scarto tipo relativo (fr. Écart type relatif),

o Incertezza tipo relativa (e coefficient of variation).

Spesso viene espresso in percentuale: si moltiplica per cento e si aggiunge il segno di “%”

ma attenzione a non fare errori in Excel: si scrive solo DEV.ST.POP(dati)/MEDIA(dati)*100 oppure DEV.ST.POP(dati)/MEDIA(dati) e si fa clic su:

mai entrambe le operazioni!

2/4 è il 50%, …e non 5000%

Campo di variazione (ingl. Range)

Campo di Variazione = MAX – MIN

Non confondere con il CV=Coefficiente di variazione Non con con Range (ingl) con “rango” (e quindi con la

funzione RANGE(.) in Excel).

In Excel: MAX(dati)-MIN(dati)

Grafici Box-Plot

Utili per una visualizzazione grafica della posizione e dispersione, ma… non c’è definizione univoca, quindi…attenzione alla legenda!

180 Valore max.

III percentile

Mediana

I percentile

Valore min.

Riassumendo

la statistica descrittiva mi “riassume” i dati con pochi indici che mi descrivono la posizione (della curva) e dispersione (“larghezza”)

Le distribuzioni statistiche

Poisson, Normale, Chi quadrato…

modelli matematici utili a descrivere popolazioni

Distribuzioni statistiche

Alle volte l'uso di modelli matematici mi permette di riassumere tutti i miei dati in pochi parametri (es. regressione, y=a+bx).

Distribuzioni in microbiologia

Poisson Binomiale Normale Chi quadrato t di Student

Distribuzione Poisson

Famiglia di distribuzioni al variare di >0

Distribuzione Poisson

Distribuzione discreta Media=Varianza= “senza memoria” In Microbiologia descrive

bene conta UFC

Distribuzione Binomiale

Famiglia di distribuzioni al variare di n e p

Distribuzione Binomiale

Media=np Media>Varianza=np(1-p) In Microbiologia descrive

bene conta con MPN

tuttavia se n, p0 Bi (.) Poisson(.)

Distribuzione Normale

Famiglia di distribuzioni al variare di e

Media = Deviazione

Standard= indipendente da È frequente in

“natura” In microbiologia…

…(anche) in microbiologia si usa per approssimare altre distribuzioni:

Se >15 Poisson() N(, )

Se n>12 Binom(n,p) N(np,np(1-p))

Se n , p0 Binom(n,p) Poisson(=np) N(np,np)

e vale anche:Se k Chi Q. N(k,2k)Se k t di Student N(0,1)

)25.0,()( NXPoissonX

Distribuzione Normalestandardizzata

Distribuzione Chi Quadrato

Famiglia di distribuzioni al variare di k=g.d.l.

Distribuzione Chi Quadrato

Media=k Varianza=2k ed inoltre:

2 ~(0,1)~ ZNZ

Distribuzione t di Student

Famiglia di distribuzioni al variare di k=g.d.l.

Distribuzione t di Student

Media=0 Se k allora:

t di Student N(0,1)

Chi mi dà percentili delle distribuzioni?

Tavole Computer Excel InternetEs. http://faculty.vassar.edu/lowry/tabs.html

Programmi specificiEs. DistCal

Percentili Chi Quadrato con Excel

1 2 3 4 5 p= 5% 3.84 5.99 7.81 9.49 11.07 p= 1% 6.63 9.21 11.34 13.28 15.09

Percentili Chi Quadratogradi di libertà (k)

=INV.CHI(0,01;2)=9,21

=DISTRIB.CHI(9,21;2)=0,01

Percentili della t di Student in Excel

DISTRIB.T(Z;gdl;1)

Es. =DISTRIB.T(1,96;99999;1)=0,25

INV.T(p;gdl)Es. =INV.T(0,05;9999)=1,96

DISTRIB.T(Z;gdl;2)

Es. =DISTRIB.T(1,96;99999;2)=0,5

2 Code

Percentili della Normale in Excel

DISTRIB.NORM(z;;;VERO)

Es. =DISTRIB.NORM(1,96;0;1;VERO)=0,975

INV.NORM(p;;)Es. =INV.NORM(0,95;0;1)=1,96

Probabilità della Poisson in Excel

P(X=c)=POISSON(c;;FALSO)P(Xc)=POISSON(c;;VERO)

P(X>c)=1- P(Xc) P(a < X b)=P(Xb)- P(Xa)

Esercizio: P(6< X21)=POISSON(21;12;VERO)-POISSON(6;12;VERO)=0,948

(verifica intervalli confid. al 95% per conteggio su capsula Petri con n=12)

Attenzione al limite Excel (x max 150)

dove siamo arrivati?

in d ic i d ip os iz ion e

(e s . m e d ia )

in d ic i d id isp ers ion e

(e s . va ria n za )

In d ic i G ra fic i

S ta tis t ica d esc ritt iva

S tim aP u n tu a le

In te rva lli d icon fid en za(e s . 9 5 % )

S tim a interva llare

S tim e

Tes t S p ec ific id i m ic ro b io lo g ia

Tes t d i s ig n ifica tività(e s . 5 % )

S ta tis t ica in fe ren z ia le

S ta tis t ica

Statistica inferenziale

Ovvero, come descrivere la popolazione partendo da un campione

Statistica inferenziale

Quando: Non possiamo o non vogliamo misurare tutta la

popolazione Vogliamo comunque descriverla Vogliamo avere una stima degli indici visti fino

ad ora, ma entra in gioco l’Incertezza e quindi la probabilità:

Probabilità = 0 ... 1 = 0% …100%

Metodo induttivo/deduttivo

InferenzaStima di C’è sovra-

dispersione?Test Kp Test G2

Campione Microbiologico

inoculi da stessa “popolazione” non danno stesso UFC

Componenti incertezza: Distribuzione casuale (di Poisson) delle cellule microbiche

Lettura delle piastre (ripetibilità conteggio)* Volume totale inoculato (ripetibilità dosaggio) * Fattore di diluizione (ripetibilità dosaggio diluente) *

*tenuta sotto controllo con valutazione sperimentale della ripetibilità (performance operatori e laboratorio)

Stimatori degli “indici descrittivi”

Popolazione

media pop.

2 varianza pop.

Campione

media campionaria

s2 varianza campionaria

xInferenza

Indici campionari

Media campionaria Varianza campionaria Deviazione Standard campionaria CV = Coefficiente di variazione campionario

Simbologia (convenzioni)

Lettere greche per parametri popolazione– con il cappelletto le relative stime

Lettere latine MAIUSCOLE per variabili casuali Lettere latine minuscole per campione (x,u) Media campionaria con trattino sopra

nin Nxx

Media campionaria

In Excel: MEDIA(dati)

Deviazione standard campionaria

In Excel: DEV.ST(dati) DEV.ST.POP(dati)

Varianza campionaria

In Excel: VAR(dati)

Coefficiente di Variazione

In Excel: DEV.ST(dati)/MEDIA(dati)

%100% x

Lo statistico trova e dimostra che…

Stimatore della “vera” media è

Stimatore della “vera” varianza è

xxin 1

Come valuto uno stimatore: ?

Mediamente deve…“indovinarci”

Deve avere “variabilità media piccola”

Si dimostra che:22)( sE)(xE

min)( xV min)( 2 sV

min)ˆ( V

Lo stimatore mi dà un solo valore!… è sufficiente?

Se un marziano ci chiedesse quanto sono alti mediamente gli esseri umani, e noi gli rispondessimo: - «mediamente 155cm»egli potrebbe immaginare esseri umani alti 5cm ed altri alti 3 metri!.

Ci vuole un “intervallo di confidenza”!

Teorema del limite centrale

La media campionaria di un campione si distribuisce come una normale con

media pari alla media della popolazione varianza pari a varianza popolazione su n=V(X)/n

nin Nxxallora

DistribXse

Distribuzione uniformedecisamente diversa dallanormale! (grande )!

La distribuzione delle medie campionarie (distribuzione campionaria) da una distribuzione non normale dopo anche pochi campioni diventa normale con piccola dispersione!

TENDENZA VERO IL LIMITE CENTRALE

Intervallo

Teorema del limite centrale

Tlc e Intervalli di confidenza

Posso sempre costruire intervalli di confidenza sfruttando il TLC

StandardErrorex

2ˆ ˆ

Tlc e Poisson (conteggi con c>15)

Nella Poisson media=varianza, quindi sfruttando il TLC

Es. Conta singola (n=1) con c=25 Risultato = 252*5 = 2510

Es. Conta doppia con c=18,32 Risultato = 251,4*5= 257

ccnse 21

Intervalli di confidenza nella Poisson

si applica il TLC (e le tavole se a disposizione)

si guardano le tavole (ISO 7218) con intervalli di confidenza già calcolati.

ErrStc 215c

Calcolo e verifica intervalli della

Poisson in Excel

Intervalli di confidenza al 95%

Metodo statistico che mi permette di costruire, a partire dai dati sperimentali, un intervallo di valori plausibili.

Se applicato a 100 analisi diverse, 95 intervalli (circa) conterranno il “vero” valore, ma 5 no!

…insomma, ci azzecca il 95% delle volte.

Intervalli di confidenzacorretta interpretazione

L’intervallo di confidenza del n° di batteri di un alimento risultano, nel nostro laboratorio, fuori legge. Prima di provvedere al sequestro un magistrato ci chiede:

“quale è la probabilità che le analisi siano giuste?”.

“Sig. Magistrato: il mio laboratorio stima, diciamo, 10000 intervalli di confidenza all’anno; 9500 sono giusti, ma 500 completamente errati. Ora, non so dirle se questo intervallo che le ho dato è esatto oppure no”.

Poisson?

Ma…sicuri che possiamo applicare ai nostri dati il modello matematico/statistico di Poisson (o la sua approssimazione alla normale?

Sì se: i microrganismi sono distribuiti in modo

casuale (non uniforme, né a gruppi) Se non ho SOVRADISPERSIONE

Poisson?

La Poisson prevede che i micro-organismi siano distribuiti in modo casuale

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sovradispersione nella Poisson

Accade quando conteggi mostrano una varianza maggiore della media (quindi una varianza troppo grande).Se Varianza>Media SovradispersioneSe Varianza<Media SottodispersioneSe Varianza=Media OK, distribuzione casuale

Come valuto la sovradispersione?

Con un Test statistico:

Test Kp

Test G2

Si distribuiscono entrambi come una Chi-quadratoNon c’è sovradispersione se il test da “valori piccoli (rifiuto per valori grandi).

Test di verifica d’Ipotesi

Un test mi aiuta a prendere una decisione.

…un po' come un giudice in un processo. L'incertezza implica la possibilità di fare due tipi di errore:

assolve condannaè veramente innocente OK Errore Iha veramento ucciso Errore II OK

Decisione giudice

Ogni decisione su una certa ipotesi (es. colpevole o innocente) implica due tipi di errori (che spesso non riteniamo di pari gravità).

Se qualcuno ci desse una procedura per decidere che tuttavia mi consenta di conoscere la probabilità di uno solo dei due errori: quale errore sceglierei di poter tenere sotto controllo?

Definiamo allora “Errore di I tipo” quell'errore (generalmente è il + grave, ma non è detto). L'ipotesi relativa è detta: Ipotesi nulla: H0

Test di livello di significatività =5%

assolve condanna

è veramente innocente OK Errore I

ha veramento ucciso Errore II OK

Decisione giudice

Definiamo con la probabilità dell’errore di I tipo. Questo valore, detto livello di significatività di un test per H0=innocente

=P(rifiutare Ipotesi nulla: H0 quando essa è “vera”)

non si possono diminuire entrambi gli errori…

Prima di fare un test si decide il valore di =0,05 (5%), =0,01 (1%)

varia a seconda dei contesti (vedi es. casa farmaceutica)

accetto Ho rifiuto Ho

in realtà è vera Ho OK Errore I

in realtà non è vera Ho Errore II OK

Decisione giudice

Test di verifica dell’Ipotesisignificato interpretativo

Un Test accetta o rifiuta H0, non dimostra mai che è H0 vera o falsa.

H1 è corroborata (sostenuta) o meno dai dati, mai accettata o rifiutata e tanto “vera” o “falsa”

Si dice “test di significatività al 5%”, ma …ho due tipi di errore… (ma abbiamo deciso di costruire il test per Ho, che vogliamo tenere “sotto controllo”).

= 5% = P(rifiutare H0 quando H0 è vera)=P(err I° tipo)

=P(accettare H0 quando H0 non è vera)=P(err. II° tipo)

Test di verifica dell’Ipotesipraticamente…

Il test è una formula che mi danno gli statistici (+/- complessa e con +/- senza senso logico/intuitivo)

premesso che ai dati si possa applicare certi modelli matematici, gli statistici mi dicono che: se l’ipotesi H0 è vera, il test deve assumere certi

valori (regione di accettazione) con una certa prob. se H0 è falsa deve assumerne altri (regione di rifiuto).

Ergo: calcolo il test con i miei dati e …decido!.

Test G2 (per valutare sovradispersione)

Gli statistici mi dicono di calcolare l’espressione:

e mi dicono che “sotto” H0 allora: se G2 < 3,84 accetto H0

se G2 > 3,84 rifiuto H0

Con H0= ipotesi di assenza di sovradispersione

Test che misurano la bontà di adattamento: G2 Chi2 di Pearson = Kp

Sono test “goodness of fit to a distribution” che valutano quanto i dati concordano con modello

facile ed intuitivo è il

H0= il modello si adatta

Se (foss fatt) allora Chi2 0 accetto H0

Rifiuto per valori grandi

attoss

fffPearsondiTest

Test che misurano la bontà di adattamento: G2 Chi2 di Pearson = Kp

Chi2 è approssimazione di G2

H0= il modello si adatta ed entrambe

Se (foss fatt) allora G2 0 accetto H0

Rifiuto per valori grandi

Test Kp ?

Il test Kp è sempre un test di bontà di adattamento (la formula che si utilizza in laboratorio di microbiologia è Kp anziché Kp)2 che va confrontato con la Chi quadrato con 1 grado di libertà.(si rifiuta per valori alti)

)(2)(2

)()()(

babbaaba

baatteseosservate

attoss

Test di verifica dell’Ipotesi – Valore p

Quando comunico l’esito di un test ad altri: dico solo significativo/non significativo (accetto/rifiuto) o posso dire di più?

meglio riportare il:valore p= livello di significatività osservato

ovvero: il più alto valore di che mi farebbe rifiutare H0

Se p<0,01 rifiuto H0 Se 0,01<p<0,05 si tende a rifiutare p>0,05 accetto H0

E’ un indicatore della plausibilità dell’ipotesi H0

Lecco, 15 dic 2005Francesco Ronzon 1 Statistica applicata allanalisi microbiologica.

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