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La gestione delle emocolture nella
diagnosi microbiologica della sepsi
Luigi Principe Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Socio Sanitaria Territoriale di Lecco
Corso di Diagnosi, Terapia e Critical Appraisal in Nefrologia e Discipline correlate
Lecco, 7 Novembre 2017
Esame colturale che si prefigge di rilevare la presenza di
microrganismi (batteri, funghi) nel sangue fornendo loro le
migliori condizioni di replicazione.
Per emocoltura si intende la coltura di un campione di
sangue ottenuto da una singola venipuntura,
indipendentemente dal numero di flaconi in cui il campione
viene inoculato. Un set di emocoltura comprende un flacone
aerobio ed un flacone anaerobio.
Diagnostica microbiologica: l’emocoltura
Nota bene
Alcuni microrganismi non crescono nei comuni terreni di coltura
(virus, protozoi, legionelle, micoplasmi, clamidie)
L’emocoltura: procedura di prelievo
Prelievo da catetere vascolare
per verificare il sospetto clinico
di batteriemia
correlata al catetere (CRBSI)
Prelievo
• da vena periferica:
prelievo raccomandato
• da arteria:
minore frequenza di positività
• da catetere vascolare:
maggiore frequenza
di contaminazione cutanea
Eseguire allo stesso tempo due emocolture (una da CVC e una da vena periferica) prelevando per ogni sito 8-10 ml di sangue da inserire nel flacone BacT/ALERT FA Aerobio (le infezioni da catetere sono sostenute da aerobi) Le due emocolture devono essere prontamente (e contemporaneamente) consegnate in laboratorio, in modo che possano essere inserite allo stesso tempo nel sistema automatico di monitoraggio continuo
Il test è positivo se l’emocoltura da catetere vascolare si positivizza almeno 2 ore prima rispetto a quella da vena periferica: stesso microrganismo, stesso antibiotipo (batteriemia associata a infezione del catetere vascolare, CR-BSI)
La sequenza del prelievo
Prelievo da catetere vascolare (CR-BSI)
L’emocoltura: procedura di prelievo
Metodiche di disinfezione:
prima di procedere all’antisepsi della cute
accertarsi che non ci sia sporco visibile
(in tal caso procedere al lavaggio
della parte con acqua e sapone).
È preferibile l’utilizzo di clorexidina 2%
in soluzione alcolica (Neoxidina).
Prima di eseguire il prelievo,
attendere un tempo adeguato;
(nel caso della clorexidina: 30”-1’).
L’esecuzione di 2-3 venipunture per ciascun episodio settico (entro 1 ora) prima della terapia antibiotica permette:
Diagnosi in > 95% degli episodi settici
Supporto a interpretazione di contaminanti
Il volume di sangue è la variabile più importante
(ogni flacone deve contenere al massimo 10 ml di sangue)
Adulti: Carica batterica <10 CFU/mL di sangue Volume da 20 a 40 mL + 19% di positività (2° set) Volume da 40 a 60 mL + 10% di positività (3° set)
Bambini: In genere > 100 CFU/mL (spesso > 1000 CFU/mL) Prelievi di 0.5 – 1 mL sono considerati sufficienti
L’emocoltura: procedura di prelievo
Gli anaerobi rappresentano meno del 2% del totale delle BSI
La coppia flacone aerobio + flacone anaerobio individua un numero maggiore di batteri (p = 0.002), cocchi Gram-positivi (p = 0.03), Staphylococcus aureus (p = 0.05), Enterobacteriaceae (p = 0.02) ed anaerobi (p = 0.01)
Uso dei flaconi per anaerobi
Batteriemia: definizioni
Batteriemia significativa:
isolamento di un microrganismo patogeno anche da una sola emocoltura.
Stafilococchi coagulasi-negativi e Streptococchi viridanti sono
da considerare patogeni solo se ottenuti da più emocolture o
in caso di situazioni clinicamente evidenti
Pseudobatteriemia:
isolamento da una sola emocoltura di possibili contaminanti
quali: Stafilococchi coagulasi-negativi, Corynebacterium spp.
(eccetto C. jeikeium), Lactobacillus spp., Bacillus spp.
(eccetto B. anthracis), Propionibacterium spp.
Grace et al., Clin Infect Dis, 2001; 32:1651
Identificati il 46.4% dei casi
Emocolture in corso di terapia?
La presenza di batteri nel sangue è maggiore in prossimità
del picco febbrile
Nessuna differenza tra prelievi simultanei e intervallati
(il periodo di intervallo fra i prelievi non incide sulla
positività)
In conclusione
Prelevare al picco febbrile, prima della terapia
antibiotica, non meno di due emocolture (flacone
aerobio+anaerobio) da siti venosi differenti (se
necessario, prelevare le emocolture simultaneamente da
braccio dx e braccio sin)
Li et al, J Clin Microbiol, 1994; 32:2829
L’emocoltura: i tempi di prelievo
Paziente “settico”
Esecuzione dei prelievi
Invio al laboratorio
Incubazione delle bottiglie
Emocoltura positiva
Semina su terreno
Crescita su piastra
Identificazione ed antibiogramma
Risultato finale
Colorazione di Gram
Mediamente 96 h
Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72Incubation time (hrs)
% P
os
itiv
e s
am
ple
s
BACTEC 9240
BacT/Alert
EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO
Terreno di coltura liquido
Sensore
LED Fotodiodo
Luce riflessa
Sistemi a monitoraggio continuo
Una emocoltura può essere definita “negativa”
dopo 5 giorni di incubazione a 35°C in un sistema
automatico a monitoraggio continuo
Il 95% dei microrganismi cresce entro 3-4 giorni di incubazione, anche per germi tradizionalmente ritenuti difficili: Brucella, HACEK, Capnocytophaga, Campylobacter.
Non è necessario (diversamente a quanto in uso in anni precedenti) prolungare l’incubazione nel sospetto di endocardite o di brucellosi.
Sistemi a monitoraggio continuo
Esame microscopico (colorazione di Gram)
Semina in terreni solidi di arricchimento, selettivi e differenziali
CONS E. coli C. albicans
P. mirabilis S. aureus H. influenzae
Abg diretto: Staphylococcus aureus Isolato resistente alla meticillina (MRSA)
Abg diretto: Escherichia coli Isolato produttore di ESBL (CTX-M-15)
Abg diretto: Klebsiella pneumoniae Isolato produttore di carbapenemasi (KPC)
Flacone positivo
Semina su terreno
Identificazione ed antibiogramma
Risultato finale a 24 ore
Colorazione di Gram
Identificazione a 3-4 ore
(resistenze intrinseche!!)
Prelievo e incubazione dei flaconi
Giorno 1 (Terapia empirica)
Giorno 2 (T. e. ragionata)
Positivizzazione dei flaconi
ID biochimica e ABG
Giorno 3 (T. mirata)
24 h 48 h
Crescita delle colonie
Giorno 4 (T. ottimale)
72 h
Metodi tradizionali ID e ABG definitivi
Introduzione della spettrometria di massa
Prelievo e incubazione dei flaconi
Positivizzazione dei flaconi
ID MALDI-TOF da flacone positivo
Giorno 1 (Terapia empirica)
Giorno 2 (T. mirata)
Giorno 3 (T. ottimale)
24 h 48 h
ABG
Gram ABG diretto in Kirby-Bauer
ID e resistenze intrinseche
ABG definitivo
Identification by mass spectrometry and automated susceptibility testing from positive bottles: a simple,
rapid, and standardized approach to reduce the turnaround time in the management of blood cultures
BMC Infect. Dis, 2017 – In press
C. Mauri, L. Principe, S. Bracco, E. Meroni, N. Corbo, B. Pini, F. Luzzaro
Non richiede estrazione preliminare
Risultato in circa 1 ora
Rispetto ai sistemi “home made” (non certificati e spesso molto laboriosi), i metodi molecolari commercialmente disponibili presentano numerosi vantaggi quali una elevata automazione associata a semplicità d’uso, rapidi tempi di risposta, alta sensibilità e specificità.
Un limite di tutti i metodi molecolari è rappresentato dal fatto che essi identificano ciò che conoscono ed eventuali varianti possono sfuggire alla identificazione determinando pericolosi falsi negativi.
I costi, inoltre, sono in genere elevati e rendono difficile l’introduzione di queste tecniche molecolari nella pratica di routine.
Vantaggi e limiti dei metodi molecolari
Luigi Principe Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Socio Sanitaria Territoriale di Lecco
Grazie per l’attenzione