Microrganismi positivi

Microrganismi negativi

+ +Microrganismi

*autoctoni *inerti

*alteranti * indici di contaminazione

Qualità Salubrità

? ?

Qualità microrganismi positivi

Sono protagonisti del processo produttivo

Contribuiscono alla tipicità dell’alimento

BATTERI LATTICI: Lactobacillus helveticus, L. bulgaricus, Lactococcus lactis, L. cremoris, Streptococcus thermophilus

LIEVITI: Saccharomyces cerevisiae

MUFFE: Penicillium roqueforti, P. camemberti

Indicatori della qualità tecnologica

non dannosi, presenti nelle materie prime, dove non contribuiscono all’ottenimento e/o conservazione del prodotto finito

non dannosi ma in grado di causare, se presenti in alto numero, alterazioni organolettiche, incidendo sulla conservabilità del prodotto (Pseudomonadaceae, micrococchi, lieviti, muffe)

non patogeni, ma ma con lo stesso habitat e caratteristiche dei patogeni (più numerosi e più facilmente rilevabili: stafilococchi, coliformi fecali Escherichia coli)

autoctoni

alteranti

indici di contaminazione

Salubrità microrganismi negativi

patogeni

Salmonella spp.Shigella spp.Listeria monocytogenesE. coli enteropatogenoVibrio cholereae

Staphylococcus aureusBacillus cereusClostridium botyulinum

Presenza nell’alimento o nell’organismo

(carica e suscettibilità dell’ospite)

Produzione di tossine

nell’alimento o nell’organismo

(carica)

Identificazione dei microrganismi

Isolamento da matrici complesse

*Terreno complesso*Terreno selettivo*Terreno di arricchimento

*Condizioni colturali

Mantenimento in coltura coltura pura

*Conta totale

*Conta selettiva

*Riconoscimento

Studio

Analisi microbiologiche di matrici alimentari

Campionamento

Determinazione della carica microbica

1. Scelta del metodo di conta

2. Scelta e preparazione del diluente

3. Scelta e preparazione dei terreni nutritivi

4. Preparazione del campione

5. Analisi

Matrice liquida

Matrice solida Prelievi in punti diversi (superficie, interno, centro, etc.)

Diluizioni successive e piastramento in terreno solido

Soluzione fisiologica sterile : 9 g/l NaCl; sterilizzazione 1/2x1/2

Prelievo di una aliquota da matrice liquida: 1 ml (t.q.)

Prelievo di una aliquota da matrice solida: in sacchetti sterili per Stomaker, determinazione del peso, aggiunta di 10 vol. di diluente, omogenizzazione, prelievo di aliquota: 1 ml (10-1)

Impiego di terreni complessi per la carica totale (sterilizzazione ¾ x 20):PCA per conta batterica (30 °C, 3 gg, aerobiosi/anaerobiosi)YGC per conta di eumiceti (30 °C 3-7 gg, aerobiosi)Impiego di terreni selettivi per la ricerca di gruppi microbici: ad esempioMRS per conta lattobacilli (30 °C, 3 gg, anaerobiosi)M17 per conta cocchi lattici (30 °C, 3 gg, anaerobiosi)

Diluizioni successive , piastramento per inglobamento, incubazione, rilevazione risultati, espressione della carica in UFC/gr o ml)

Isolamento in coltura pura

Prelievo dalle piastre di conta di colonie rappresentative mediante ansa; risospensione di ciascuna colonia selezionata in soluzione fisiologica sterile; diluizioni e piastramento; selezione di una colonia; determinazione delle caratteristiche macromorfologiche; prelievo e trasferimento in terreno di mantenimento (solido: striscio su slant per aerobi, infissione per anaerobi)

Preservazione della coltura pura

Trapianto settimanale in terreno fresco per colture che devono essere utilizzate ; conservazione delle colture per lungo tempo mediante liofilizzazione o preparazione di brodocolture glicerinate a – 20 °C

Coltura pura = ceppo microbico

IDENTIFICAZIONE A LIVELLO DI SPECIE

La specie batterica è l’unità tassonomica di base. E’ costituita da un insieme di ceppi che possiedono:Un FENOTIPO simileUn GENOTIPO simileUna storia FILOGENETICA correlabile

Fenotipo simile = caratteristiche comuni alla specie + caratteristiche secondarie legate all’adattamento dei singoli ceppiGenotipo simile = 70 % omologia genetica >DNA/DNAStoria filogenetica correlabile = omologia di sequenza del gene codificante per l’rRNA 16 S > 97-98%

Criteri di identificazione innovativa

Fenotipo

GenotipoOmologia DNA/DNA

MacromorfologiaMicromorfologiaReazione di GramMetabolismo energeticoEsigenze nutrizionaliEsigenze colturaliPattern enzimaticoCaratteristiche strutturali

Impiego di tecniche di indagine genetica, basate sulla possibilità

di amplificare in breve tempo, regioni specifiche del cromosoma

batterico

PCR (Polymerase chain reaction)

Studi filogenetici e genetici

Appartenenza alla specie in tempi ridotti ed in modo specifico, anche per un

numero elevato di isolati da identificare

Le caratteristiche fenotipiche vengono studiate in un secondo tempo, solo sugli isolati di interesse, per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo

Criteri di identificazione tradizionale

Il codice genetico

64 possibili triplette

Codone AA Codone

AA

UUU Fenilalanina

ACU Treonina

UUC Fenilalanina

ACC Treonina

UCU Serina ACG Treonina

UCC Serina ACA Treonina

UCG Serina GGU GlicinaUCA Serina GGC GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCC Prolina GGA GlicinaCCG Prolina CAU IstidinaCCA Prolina CAC Istidina

Alcuni AA sono specificati da più di un codone

DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni

STOP TAA TAG TGA

Promotore della trascrizione

INIZIO ATG GTG TTG CTG

GENEOPERONE

Un gene è una sequenza di nucleotidi delimitata da una tripletta di inizio e di fine, che codifica per un prodotto. La sua trascrizione e regolazione avviene ad opera di una regione promotrice e regolatrice , situata a monte della sequenza genica.Ogni gene possiede un proprio sito promotore e regolatore.

Un operone è un insieme di geni, ognuno codificante un diverso prodotto, ma regolati e trascritti da un unico promotore e regolatore, a monte del primo gene dell’operone. In questo modo la cellula risparmia…in un operone sono raggruppati geni che codificano per prodotti di cui la cellula ha bisogno nello stesso momento

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

Raccolta e lavaggio delle celluleRisospensione in tampone + saccarosio (6%)Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min)Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilicoCentrifugazione e raccolta del surnatante

Fase acquosa contenente il DNA Interfase

SolventeUlteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatanteTrattamenti enzimatici con RNAsi e ProteinasiPrecipitazione del DNA con 2 vol. di EtOHScioglimento del DNA in tampone

una molecola carica posta all’interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta

in un gel costituito da un polimero organico molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel

È così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all’interno di un supporto solido (gel) e colorandolo opportunamente

Visualizzazione per via elettroforetica

I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:Tampone : crea continuità nella vaschettaAGAROSIO: polimero che costituisce il gelIndicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gelBROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’

LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI:

1) ALIMENTATORE:crea la differenza di potenziale

2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA:vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico

Il caricamento del gel

VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)

POLO -

POLO +

] bande di DNA

frammenti di lunghezza maggiore

frammenti di lunghezza minore

IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA

La replicazione in vivo

20

INTERVENGONO PER LA FORMAZIONE DELLA FORCELLA = DENATURAZIONE

SINTETIZZANO I PRIMERS

La replicazione in vitro: Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosomaPCR Polymerase chain reaction

DNA totale estratto dalle cellule = DNA stampo o templato (in opportuno tampone di reazione

5’3’

3’5’

Separazione dei filamenti mediante DENATURAZIONE (95°C 3-5 min)

5’

3’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

FASE DI APPAIAMENTO = T di appaiamento per 30-60 ‘’ T app. =Tm (primer) – 3°CTm = 4 x (G+C) + 2 x (A+T)

Oligonucleotidi (INIZIATORI o PRIMERS) di 15-20bp

+

=DNA polimerasi termostabile = dNTP

+ +

3’

5’

5’

3’

FASE DI ALLUNGAMENTO = T di AZIONE DELL’E = 72-75°c per 30-60 ‘’

Fase di denaturazioneFase di appaiamentoFase di allungamento

1 ciclo

25-30 cicli = 106-107 copie

3’

5’

5’

3’

Verifica dell’avvenuta amplificazione:

•gel elettroforesi•Controllo negativo

Costruzione dei primers

5’ TAATACTTTTT------------------------GAGATGTT 3’

1° FORWARD 5’ TAATACTTTTT 3’

2° REVERSE 5’GAGATGTT3’

3’CTCTACAA5’ 5’ AACATCTC3’

APPAIAMENTO

5’ TAATACTTTTT--------------GAGATGTT3’3’CTCTACAAA5’

5’ TAATACTTTTT3’3’ ATTATGAAAAA---------------CTCTACAA5’

Se una specie batterica possiede nel suo cromosoma un gene o una regione specifici, allora posso costruire una

•Devo conoscere la sequenza nucleotidica agli estremi del gene o regione specifica•Devo costruire i primers idonei•Devo estrarre il DNA batterico totale dal campione in cui devo ricercare la presenza di quella determinata specie•Devo condurre una amplificazione specie-specifica•Devo conoscere il PM dell’amplificato che mi aspetto e l’eventuale numero di copie presenti lungo il cromosoma

Lactococcus lactis (933 bp) e cremoris (933 + “n” 59)

lactis

Lactococcus garvieae (1100 bp)

Gene his

16S rDNA

lacZ

reg. conserv.

Gene ddl (Ala-Ala ligasi)

Streptococcus thermophilus (950 bp)

Enterococcus faecium (650 bp)Enterococcus faecalis (940 bp)

Se non conosco la sequenza, e non ho indicazioni sull’appartenenza a una determinata specie:.

devo avvalermi di primers UNIVERSALI

Geni conservati in tutti i procarioti

Gene 16S rRNA

il sequenziamento del gene 16SrDNA

Il sequenziamento viene generalmente condotto da tecnici specializzati e fornito sotto forma di cromatogramma. Una sequenza parziale delle prime 500 bp del gene, può essere sufficiente per determinare la specie di appartenenza del ceppo allo studio, tramite comparazione in banca dati con le sequenze note riportate.Ricordiamo che due ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una % omologia 16S rDNA >97-98%

Il gene 16S rRNA si trova all’interno dell’OPERONE RIBOSOMALE

P16S 23S

T

Regione spaziatrice

Posso usare sempre Primers Universali

La RS è la parte più variabile dell’operone ribosomale posso distinguere generi e specie diverse in funzione del numero e del peso molecolare degli amplificati ottenuti

Ci possono essere sul cromosoma più operoni ribosomali

La lunghezza della RS può essere differente sia nell’ambito dello stesso ceppo che tra ceppi diversi

Enterococcus sp.E. faecalis

E. duransE. faecium

E. sulfureus

E. avium

E. gallinarum

nell’ambito lattiero-caseario:1 380 bp L. lactis2 410 bp L. garvieae3 350 bp S. thermophilus4 500 bp ??5 a) b) c) d) 2 amplificati

300-500 bp Enterococcus spp.

1 2 3 4 5a 5b 5c 5d MRSA

I risultati vanno verificati con sonde specie-specifiche o con riassociazione

molecolare DNA/DNA o con il sequenziamento del gene 16S rRNA.