Patrizia PECILE LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA A.O.CAREGGI FIRENZE LE EMOCOLTURE.

Patrizia PECILE

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA

A.O.CAREGGI FIRENZE

LE EMOCOLTURE

EMOCOLTURA

N° richieste < reale importanza diagnostica

sepsi alta mortalità

aumentata incidenza sepsi

DISTRIBUZIONE (%) DEI LAB. PER N° DI DISTRIBUZIONE (%) DEI LAB. PER N° DI EMOCOLTURE ESAMINATE IN GRANDI EMOCOLTURE ESAMINATE IN GRANDI

OSPEDALI (> 400 POSTI LETTO)OSPEDALI (> 400 POSTI LETTO)

* Goglio e al., Microbiologia Medica, 1992

N° < 1500 1501- 3501- > 8.000 3500 8000

Italia (1988) *(49 Osp.) 69% 14% 10% 6%

Italia (2001)(99 Osp.) 39% 23% 22% 15%USA *(98 Osp.) 8% 40% 52%

Indagine AMCLI APSI

EMOCOLTURA

Dipende in modo inusuale dal Dipende in modo inusuale dal comportamento del medico curante comportamento del medico curante (tecniche (tecniche sterili, scelta del n°, vol., frequenza)sterili, scelta del n°, vol., frequenza)

Dipende in modo inusuale dal giudizio Dipende in modo inusuale dal giudizio clinico del medico curante (clinico del medico curante (stima della prob. della stima della prob. della setticemia, stima del probabile patogeno, interpretazione del setticemia, stima del probabile patogeno, interpretazione del risultato)risultato)

EMOCOLTURA

FASE PRE-ANALITICA

FASE ANALITICA

FASE POST-ANALITICA

EMOCOLTURA : risultato ottimale

momento del prelievomomento del prelievo intervallo e numero dei campioni intervallo e numero dei campioni tecniche sterilitecniche sterili volume del prelievovolume del prelievo caratteristiche del mezzo di coltura caratteristiche del mezzo di coltura evidenziazione dello sviluppo evidenziazione dello sviluppo interpretazione del risultatointerpretazione del risultato

EMOCOLTURAsuggerimenti per una corretta esecuzione: prelievosuggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo

Il prima possibile e prima della febbre (60-90 m) I successivi nel giro di 1 hun unico prelievo distribuito in 6 flaconi?In corso di terapia subito prima della stessa Intervalli molto lunghi per documentare una batteriemia continua


Un prelievo è raramente sufficiente

Due-tre prelievi batteriemiabatteriemia

intermittente

Quattro o più terapia antimicrobica pregressa terapia antimicrobica in atto

se patogeno atteso è anche un comune contaminante


Sospetta sepsi, meningite, osteomielite, polmonite…. 2/3 prelievi distanziati circa 30’prima della terapia

Febbre di origine sconosciuta 2/3 prelievi nell’arco di 1h per 3gg consecutivi


Sospetta endocardite acuta

1°accertamento : 3 prelievi a distanza di circa 30’prima dell’inizio della terapia antibiotica

Controlli successivi : 2/3 prelievi a distanza di circa 30’al 7°-14°-28° giorno


Sospetta endocardite sub-acuta o cronica

3 prelievi a distanza di circa 30’prima dell’inizio della terapia antibiotica

3 prelievi a distanza di circa 30’ dopo 24h


Pazienti con terapia antibiotica in atto2 prelievi a distanza di circa 30’subito prima della somministrazione antibiotica. Ripetere per 3 gg

Pazienti con terapia antibiotica pregressa (1-2 settimane)2 prelievi a distanza di circa 30’ per 3 gg consecutivi


Pazienti in età pediatrica

2 /3 prelievi nella giornatavolume 1-5 ml


Disinfezione (cute, gomma del flacone)

Non prelevare da cateterePrelevare da più zone


RELAZIONE DIRETTA VOLUME / POSITIVITA’

Almeno 10 ml nella maggior parte dei casiBambini 1-5 mlRapporto ottimale campione/terreno

nono sisi

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzionesuggerimenti per una corretta esecuzione

Rapporto con il clinico Istruzioni sulla formulazione della richiesta, indicazioni

principali dell’esame, modalità di routine e speciali ecc.

Ottenimento delle notizie cliniche rilevanti ai fini dell’emocoltura

sospetto clinico (per es. endocardite)presenza cateterisospetto patogeno (per es.brucella)nutrizione parenteraleterapia antibiotica

EMOCOLTURAsuggerimenti per una corretta escuzionesuggerimenti per una corretta escuzione

Tempi di incubazione

Manuale almeno 7 giorni

Automatico 5-7 giorni (vari autori propongono 5 giorni)

EMOCOLTURA

Emocolture : tempo medio di positivizzazioneEmocolture : tempo medio di positivizzazione

Sistemi convenzionaliSistemi convenzionali 28% = 24 ore28% = 24 ore 77% = 48 ore77% = 48 ore

Sistemi automatizzatiSistemi automatizzati 57% = 12 ore57% = 12 ore 82% = 24 ore82% = 24 ore

Alonso C. e coll. 1996

EMOCOLTURAesigenze colturali diverse

Miceti : prolungamento icubazione, Miceti : prolungamento icubazione, flaconi specifici? flaconi specifici?

Brucella sp.: prolungamento incubazione Brucella sp.: prolungamento incubazione (28gg)(28gg)


Leptospira sp. : solo nella 1° settimana di malattia Leptospira sp. : solo nella 1° settimana di malattia prelievo eparinato (eparina od prelievo eparinato (eparina od ossalato di Na ) ossalato di Na )

semina in terreno specificosemina in terreno specifico

incubazione T°ambienteincubazione T°ambiente

lettura una volta a settimana per 6 lettura una volta a settimana per 6 settimane settimane


Borrelia sp. : Borrelia sp. : prelievo eparinato prelievo eparinato

semina in terreno specifico (Kelly)semina in terreno specifico (Kelly)

incubare a 35° per 6 settimane incubare a 35° per 6 settimane lettura ogni settimana lettura ogni settimana

Legionella sp. : la batteriemia non è frequenteLegionella sp. : la batteriemia non è frequente

EMOCOLTURA in caso di segni o segnali di positivitàsegni o segnali di positività

PREPARATO MICROSCOPICO (gram, acrid. (gram, acrid. orange)orange)

positivo + reperto chiaro : comunicazione (positivo + reperto chiaro : comunicazione (se il reperto non è chiaro o non ci sentiamo abbastanza sicuri meglio non fuorviare ed attendere la coltura)

semina, antibiogramma direttosemina, antibiogramma diretto


ANTIBIOGRAMMA DIRETTO

Metodi più utilizzati manualiMetodi più utilizzati manuali

Evidenziare i principali meccanismi di resistenzaEvidenziare i principali meccanismi di resistenza

(ESBL, METICILLINA…..)(ESBL, METICILLINA…..)

migliora assistenza e/o riduce i costi della degenza

Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvatiAttualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati

EMOCOLTURA antibiogramma direttoantibiogramma diretto

ANAN CCCC

AMCAMC

CTXCTXNNNN

CIPCIP SXTSXT IPMIPM GMGM

CAZCAZ PIPPIP

TCCTCCATMATM

OXOX TECTEC

AMAM

Produzione di ESBLProduzione di ESBL


IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICRORGANISMI

Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvatiAttualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati


Semina :

Flaconi Ag. Sangue in aerobiosi e anaerobiosi

Aerobi Selettivi (DEX e CNA) e miceti (microscopia)

Anaerobi Ag. Cioccolato in CO2

identificazione e antibiogramma dell’ isolatoidentificazione e antibiogramma dell’ isolatoconservazione dello stipiteconservazione dello stipite

EMOCOLTURA

Identificazione di specie secondo i metodi in uso in laboratorio allestimento prove di sensibilità secondo i metodi in uso in laboratorio

EMOCOLTURA in caso di negatività

Semine cieche durante o a fine incubazione?

Manuale: nel tradizionale flacone di brodo è raccomandata da alcuni Autori quella a 48 e 72 ore e finale per molti Autori non portano vantaggi (costo/beneficio)

Automatico: non indicate

EMOCOLTURA interpretazione risultati : falsi positivi

30 - 50% dei positivi = falsi positivi30 - 50% dei positivi = falsi positivi 50% dei pazienti sottoposti ad emocoltura sono a 50% dei pazienti sottoposti ad emocoltura sono a

basso rischio di batteriemiabasso rischio di batteriemia

> costo / laboratorio > costo / degenza> costo / laboratorio > costo / degenza

prelevare emocolture a pazienti con bassorischio di batteriemia > rischio di falsi positivi

EMOCOLTURA interpretazione risultati :come come identificare i falsi

positivi (aspetti clinici)

Decorso clinico non tipicoDecorso clinico non tipico Non riscontrata l’infezione primaria Non riscontrata l’infezione primaria

con lo stesso isolatocon lo stesso isolato Assenti i fattori di rischio per batteriemiaAssenti i fattori di rischio per batteriemia Assenza di leucocitosi o deviazione aAssenza di leucocitosi o deviazione a

sinistrasinistra

EMOCOLTURA interpretazione risultati : come come identificare i falsi

positivi (aspetti microbiologici)

Positività per flora cutaneaPositività per flora cutanea Positività per flora Positività per flora polimicrobicapolimicrobica Positività tardivaPositività tardiva

EMOCOLTURAgiudizio di positività

giorni di positività e positività multiple

1 giorno1 giorno 2 giorni2 giorni 3 giorni3 giorni 4 o più giorni4 o più giorni

Più di un flacone positivo > probabilità di vera batteriemiaPiù di un flacone positivo > probabilità di vera batteriemia

EMOCOLTURA interpretazione risultati :

falsi negativi

Terapia antimicrobicaTerapia antimicrobica Germi "difficili"Germi "difficili" Germi con esigenze colturali diverseGermi con esigenze colturali diverse

Micobatteri, Legionelle, Coxiella Micobatteri, Legionelle, Coxiella burneti, Clamidie, (Miceti), Forme L, burneti, Clamidie, (Miceti), Forme L, VirusVirus

EMOCOLTURA EMOCOLTURA patogeni più rari (possibili falsi negativi) patogeni più rari (possibili falsi negativi)

5 %5 %Gruppo HACEK

ClamidieCoxiella burneti

Borrelia burgdorferi

Legionelle

Micobatteri

Rickettsie

Erysipelothrix

Rochalimaea henselae Gemella haemolysans

Leptotrichia buccalis

NVS

EMOCOLTURA (EMOCOLTURA (endocarditeendocardite))nutritionally variant streptococcinutritionally variant streptococci

5 % dei viridanti5 % dei viridanti emocoltura positiva per emocoltura positiva per

streptococchi senza streptococchi senza successivo svilupposuccessivo sviluppo

sensibilità ad antibioticisensibilità ad antibiotici

EMOCOLTURA : : prove di sensibilità

stafilococchi

enterococchi

streptococchi viridanti

enterobatteri

non enterobatteri

anaerobi

miceti

StafilococcoStafilococco

Beta-lattamasi pos 90%Beta-lattamasi pos 90% meticillina R 60-90% meticillina R 60-90%

Fluorochinoloni,aminoglicosidi,Fluorochinoloni,aminoglicosidi,macrolidi,clindamicina macrolidi,clindamicina

Teicoplanina R Teicoplanina R ((S.haemolyticus,S.epidermidisS.haemolyticus,S.epidermidis))VancomicinaVancomicina I I

streptogramine/oxazolidinonistreptogramine/oxazolidinoni

R

EnterococcoEnterococco

E.faecium E.faecalisE.faecium E.faecalisresistenza intrinseca: resistenza intrinseca:

cefalosporinecefalosporine aminoglucosidiaminoglucosidi clindamicina, co-trimossazoloclindamicina, co-trimossazolo

resistenza acquisita:resistenza acquisita: alta R ad aminoglucosidialta R ad aminoglucosidi produzione di b-lattamasiproduzione di b-lattamasi

R Vancomicina R Vancomicina

streptograminestreptogramine R teicoplanina oxazolidinoni R teicoplanina oxazolidinoni

Enterococco ed emocolturaEnterococco ed emocoltura

Penicillina o ampicillinaPenicillina o ampicillina vancomicinavancomicina teicoplaninateicoplanina gentamicinagentamicina (alto dosaggio) (alto dosaggio) streptomicinastreptomicina (alto dosaggio)(alto dosaggio)

saggio della betalattamasiOxazolinidoni, Chinopristina- dalfopristina

S.pneumoniae ed emocolturaS.pneumoniae ed emocoltura

Penicillina o oxacillina (1mcg/ml)Penicillina o oxacillina (1mcg/ml) ceftriaxoneceftriaxone imipenemimipenem vancomicinavancomicina

S.pneumoniaeS.pneumoniae

oxacillina > 20 mmoxacillina > 20 mm SS sensibilità a penicillina sensibilità a betalattamici (am, amc, fep, ctx, cro, sensibilità a penicillina sensibilità a betalattamici (am, amc, fep, ctx, cro,

ipm, mem )ipm, mem )

oxacillina <19mm oxacillina <19mm MICMIC

P CRO-CTX

MEM

S.pneumoniaeS.pneumoniae

Ceftriaxone e cefotaximeCeftriaxone e cefotaxime

meningeimeningei non meningeinon meningei

S < 0,5 mcg/mlS < 0,5 mcg/ml S < 1 mcg/mlS < 1 mcg/ml

I 1 mcg/mlI 1 mcg/ml I 2 mcg/mlI 2 mcg/ml

R > 2 mcg/mlR > 2 mcg/ml R > 4 mcg/mlR > 4 mcg/ml

NCCLS 2002

•Per penicillina, ampicillina, oxacillina non sono forniti i break-points da NCCLS per il metodo della diffusione

•MIC metodica indicata da NCCLS

Streptococchi viridanti ed Streptococchi viridanti ed emocoltura emocoltura

Saggiare sempre penicillina o ampicillinaSaggiare sempre penicillina o ampicillina

penicillina MIC > 0.25 mcg/mlampicillina MIC > 0.5 mcg/ml

Streptococchi viridantiStreptococchi viridanti

la conoscenza della MIC è determinante la conoscenza della MIC è determinante per la scelta della terapia e della sua durataper la scelta della terapia e della sua durata

può richiedere associazione con aminoglicosidi

H.influenzae ed emocolturaH.influenzae ed emocoltura

•ampicillina ( predittiva per amoxicillina )•una cefalosporina 3°generazione•meropenem•cloramfenicolo

H.influenzaeH.influenzae

beta-lattamasibeta-lattamasi

TEMTEMse negativa riportare come se negativa riportare come

ampicillina/amoxicillina Sampicillina/amoxicillina S


PRODUZIONE BLPRODUZIONE BL

Resistenza occasionale•CAF • Tetraciclina • SXT •Rifampicina

resistenza ampicillina


BNLARBNLAR

beta-lattamasi negativabeta-lattamasi negativa

ampicillina/amoxicillina ampicillina/amoxicillina

amoxi/clavul., ampicillina/sulb., CG2, cefemiamoxi/clavul., ampicillina/sulb., CG2, cefemi

R

EnterobatteriEnterobatteri

Penicilline, cefalosporine, monobattami RPenicilline, cefalosporine, monobattami R

Carbapenemi, penicilline protetteCarbapenemi, penicilline protette

produzione di ESBL

Miceti ed emocolturaMiceti ed emocoltura

5 fluocitosina5 fluocitosina Amfotericina BAmfotericina B FluconazoloFluconazolo ItraconazoloItraconazolo ChetoconazoloChetoconazolo

NCCLS,VOL 17 n 9-1997

micetimiceti

fluconazolo <8 16-32 - >64fluconazolo <8 16-32 - >64

itraconazolo <0.125 0.25-05 - >1itraconazolo <0.125 0.25-05 - >1

fluorocitosina <4 - 8-16 >32fluorocitosina <4 - 8-16 >32

S S dose dipendente I R

NCCLS

micetimiceti

MIC in agarMIC in agar indaginositàindaginosità non approvati da NCCLSnon approvati da NCCLS No MFCNo MFC Costi elevatiCosti elevati

MIC in brodo MIC in brodo macrometodomacrometodo sistema riferimentosistema riferimento MFCMFC indaginositàindaginositàCosti elevatiCosti elevatiMIC in brodo micrometodoMIC in brodo micrometodo approvazione NCCLSapprovazione NCCLS MFCMFC facile esecuzionefacile esecuzione costi medicosti medi

micetimiceti

E testE test Approvato NCCLSApprovato NCCLS Terreni diversi per le varie Terreni diversi per le varie

molecolemolecole No MFCNo MFC Difficoltà di letturaDifficoltà di lettura Costi elevatiCosti elevati

Diffusione in agarDiffusione in agarNo MFCNo MFCDischetti a concentrazione Dischetti a concentrazione predefinitapredefinitaTerreni diversi per le varie Terreni diversi per le varie

molecolemolecoleDifficoltà di letturaDifficoltà di letturaCosti abbastanza elevatiCosti abbastanza elevati

micetimiceti

ATB fungusATB fungus Non approvato NCCLSNon approvato NCCLS Mancanza triazoliMancanza triazoli Mancanza valori di riferimento Mancanza valori di riferimento No MFCNo MFC Concentrazione elevata per Concentrazione elevata per

amfotericinaamfotericina Costi mediCosti medi

AnaerobiAnaerobi

isolati da emocolture in soggetti con endocarditeisolati da emocolture in soggetti con endocardite isolati da emocolture nelle batteriemie ricorrentiisolati da emocolture nelle batteriemie ricorrenti artriti setticheartriti settiche

NCCLS consiglia di eseguire l’antibiogramma

AnaerobiAnaerobi

Microrganismi da sottoporre ad antibiogrammaMicrorganismi da sottoporre ad antibiogramma

specie o generi con profilo di sensibilità variabilespecie o generi con profilo di sensibilità variabile( ( B.fragilisB.fragilis, il genere, il genere ClostridiumClostridium tranne tranne C.perfringensC.perfringens, alcuni Gram , alcuni Gram

negativi )negativi ) batteri molto virulentibatteri molto virulenti batteri isolati in coltura purabatteri isolati in coltura pura

AnaerobiAnaerobi

Molecole da saggiare periodicamenteMolecole da saggiare periodicamente cloramfenicolo cloramfenicolo penicillina protettapenicillina protetta imipenem imipenem metronidazolometronidazolo

Molecole da saggiare abitualmenteMolecole da saggiare abitualmente clindamicinaclindamicina penicillinapenicillina alcune cefalosporinealcune cefalosporine

Patogeni emergentiPatogeni emergenti

Microrganismi uso antibioticiMicrorganismi uso antibiotici

Diminuizione dell’intervallo di cambiamentoDiminuizione dell’intervallo di cambiamento Aumento del numero di microrganismiAumento del numero di microrganismi

Gram positivi a resistenza intrinseca a Gram positivi a resistenza intrinseca a glicopeptidiglicopeptidi

Leuconostoc sp.**Leuconostoc sp.**Erysipelothix rhusiopathiae*Erysipelothix rhusiopathiae*Gemella haemolysans Gemella haemolysans Pediococcus sp.**Pediococcus sp.**Lactococcus sp.**Lactococcus sp.**Corynebacterium jk**Corynebacterium jk**E.caselliflavus/**E.caselliflavus/**gallinarum/flavescensgallinarum/flavescensStreptococcus milleri*Streptococcus milleri*Streptococcus bovis *Streptococcus bovis *

Possibile resistenzao resistenza intrinseca a

teicoplanina e/o vancomicina

Gram positivi inusuali isolati da Gram positivi inusuali isolati da sangue nel policlinico di Careggisangue nel policlinico di Careggi

Leuconostoc sp. , Pediococcus sp Leuconostoc sp. , Pediococcus sp Habitat vegetali,terrenoHabitat vegetali,terreno Flora normale tratto GIFlora normale tratto GI Solo pz immunocompromessiSolo pz immunocompromessi Isolamento da sangueIsolamento da sangue R teico/vancomicina possono essere sensibili a IPM,CAF,GM ,ma MICs a R teico/vancomicina possono essere sensibili a IPM,CAF,GM ,ma MICs a

livelli di S intermedia per penicillinelivelli di S intermedia per penicilline

Lactococcus spLactococcus sp

Flora normale tratto GIFlora normale tratto GI Solo pz immunocompromessiSolo pz immunocompromessi Isolamento da sangueIsolamento da sangue Vanco S,penicilline MSVanco S,penicilline MS

Gram positivi inusuali isolati da Gram positivi inusuali isolati da sangue nel policlinico di Careggisangue nel policlinico di Careggi

Corynebacterium jkCorynebacterium jk Setticemia,endocardit,infezioni tessuti molliSetticemia,endocardit,infezioni tessuti molli Habitat pelle,mucose trattoGIHabitat pelle,mucose trattoGI Pazienti immunocompromessiPazienti immunocompromessi R intrinseca a betalattami,aminoglucosidi,R intrinseca a betalattami,aminoglucosidi, teicoplaninateicoplanina

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