Elementi di Virologia

VIRUS e VIRIONI – caratteri generali

Semplici unità acellulari (1), formate da una o più molecole di

DNA o RNA (2) racchiuse in involucro proteico (talvolta

ulteriormente avvolte da involucro membranoso contenete anche lipidi e

carboidrati).

La riproduzione avviene solo all’interno di cellule viventi: sono

parassiti endocellulari obbligati (3).


Semplici unità acellulari (1), formate da una o più molecole di

DNA o RNA (2) racchiuse in involucro proteico (talvolta

ulteriormente avvolte da involucro membranoso contenete anche lipidi e

carboidrati).

La riproduzione avviene solo all’interno di cellule viventi: sono

parassiti endocellulari obbligati (3).

Ma:

loro semplicità non deve ingannare!

malattie, tante e molte difficili da curare!

molteplicità di studi genetici e molecolari!


In tutti i virus abbiamo nucleocapside costituito da un acido

nucleico avvolto da/in un capside proteico di struttura icosaedrica,

elicoidale o complessa. I capsidi si (auto)assemblano formando tra

le unità costituenti (protomeri) legami non covalenti

I genomi virali sono più differenziati ed eterogenei di quelli

procariotici ed eucariotici e possono consistere in un filamento

singolo o doppio di DNA o di RNA.

I filamenti di acidi nucleici possono essere in forma lineare,

circolare o possono assumere entrambe le forme


VIRIONE: particella virale metabolicamente inerte, non esplica né

respirazione né biosintesi. E’ la struttura attraverso la quale il

genoma virale è trasportato dalla cellula che lo ha prodotto ad

altra dove l’acido nucleico verrà nuovamente introdotto dando

inizio allo stato intracellulare

VIRUS: forma, stadio del ciclo intracellulare, ove avviene

replicazione, prima di nuove copie del genoma e poi delle

componenti di rivestimento

Il virus riprogramma le funzioni metaboliche e biosintetiche

dell’ospite, finalizzandole alla sua moltiplicazione

VIRUS – dimensioni

Numero di studi e di evidenze in esplosione

- importanza

- facilità di studio

- tecniche

Dimensioni:

da 10 a 300-400nm

es: poliovirus 28nm

poxvirus 250nm

A parte quelli di più grandi dimensioni, è sempre necessario

microscopio elettronico per visualizzarli

VIRUS – dimensioni

Virus di grandi dimensioni (circa 1 micron e forma a goccia che li

fa rassomigliare ad alcuni tipi di batteri), il cui genoma è anche di

grandi dimensioni (circa 2 Megabasi):

- Mimivirus (2003)

- Megavirus (2011)

- Pandoravirus (2013)

- Pithovirus (2014)

Raffronto fra le dimensioni dei cenomi di virus, eucarioti, batteri e archea. (E. Pennisi/Science/AAAS)

VIRUS: ACIDI NUCLEICI

Eccezionale flessibilità, e molta diversità dimensionale (da 1x106

Dalton 3-4 proteine a 1x108 Dalton più di 100 proteine)

DNA ss

ds (maggior parte di virus batterici)

RNA ss* filamento + (es TMV, polio, sarcoma Rous)

filamento – (es rabbia, morbillo, influenza)

ds*maggior parte di piante, e in generale > parte di RNA virus

VIRUS – origine

Mistero…

Due le ipotesi più accreditate, più una che segue la scoperta dei

megavirus

1) originati, almeno i virus più complessi (poxvirus, herpesvirus) da

cellule di ridotte dimensioni, probabilmente procarioti parassiti

andati incontro a fenomeni successivi di semplificazione

strutturale e fisiologica e sempre più dipendenti da ospite

(evoluzione retrograda)

Ma: molto diversi da procarioti!

assenza di forme intermedie

VIRUS – origine

2) Acidi nucleici svincolatisi parzialmente dalle cellule e diventati

particolarmente indipendenti ma anche infettanti (contengono

infatti sequenze simili a plasmidi e trasposoni). Attorno a questo

acidi nucleici le proteine si sarebbero spontaneamente

assemblate con modalità e strutture particolarmente rispondenti

a criteri di economia e robustezza.

Questa ipotesi prevede più eventi indipendenti che darebbero

ragione di varietà sia di forme che di ospiti infettati

Inoltre, si sta di recente ipotizzando loro ruolo centrale nella

transizione da mondo a RNA a mondo a DNA sono loro che hanno

evoluto DNA per proteggerlo da ribonucleasi

3) la maggior parte dei geni dei

Pandoravirus non compare in alcun

database ipotesi che i virus abbiano

avuto origine da una stirpe cellulare

primitiva totalmente diversa da

Archea, Bacteria e Eukarya nome

per questo nuovo raggruppamento:

“Truc”, acronimo di:

Things Resisting Uncomplete

Classification

VIRUS – origine

VIRUS – struttura

NUCLEOCAPSIDE: costituente ultimo, sempre presente

Costituito da un acido nucleico + involucro proteico che lo

racchiude (CAPSIDE).

Eventualmente può essere presente un pericapside o involucro

In principio si riteneva fosse tutto qua, niente enzimi, ma non è

così, se ne riscontrano spesso, associati a capside o involucro,

quando presente

Maggior parte coinvolti nel processo di replicazione dell’acido

nucleico (trascrittasi inverse, ecc), ma anche di supporto

nell’infezione (neuraminidasi, lisozima)

VIRUS – struttura

Divisione rispetto ai capsidi (in generale, a struttura):

1) Icosaedrici

2) Elicoidali

3) Con pericapside (anche definiti pleomorfi)

4) Complessi (spesso possiedono porzioni caudali, o pareti

complesse e stratificate)

VIRUS – struttura

VIRUS – struttura

I capsidi sono formati da uno o più tipi di subunità proteiche

protomeri, che una volta formati ed esposti a condizioni

appropriate possono interagire ed aggregarsi, organizzandosi

in capsomeri autoassemblaggio (nessuna necessità

esterna). Questo è vero in particolare per capsidi icosaedrici ed

elicoidali massima economia di sequenze geniche

I capsidi di virus complessi necessitano invece del supporto di

fattori proteici specifici per l’assemblaggio

VIRUS a struttura icosaedrica

Una delle forme che natura predilige (insieme a elica), modo

estremamente efficiente di racchiudere uno spazio con

struttura regolare

In generale, si associano protomeri

pentamerici ai vertici di icosaedro

esamerici formano lati e facce dei triangoli

VIRUS a struttura elicoidale

Struttura molto simile a quella di altri tubi costituiti da pareti

proteiche (es flagelli). Sembra che lunghezza sia determinata

da lunghezza dell’acido nucleico

TMV: protomeri di un solo tipo,

si aggregano con andamento

elicoidale tubo rigido.

Materiale genetico si avvolge

a spirale all’interno della

cavità che rimane

VIRUS (a struttura elicoidale) con pericapside

Virus influenzali: strutture elicoidali ma flessibili ripiegate in

pericapside

VIRUS con pericapside

Solitamente virus animali; traggono origine da membrane di

cellula ospite per quanto riguarda frazione lipidica e carboidrati

Proteine del pericapside sono invece

codificate dal genoma virale,

disposte spesso con proiezione

esterna (es virus influenzali),

definite spicole o peplomeri.

Sono elemento di classificazione

e possono partecipare a

processo di adesione

VIRUS con pericapside

Virus dell’influenza:

1) enzima neuroaminidasi (NA)

agevola virus nella penetrazione

dei tessuti, in particolare lo

strato mucoso dell’epitelio

respiratorio

2) Emoagglutinine (HA)

consentono legame a membrane

di eritrociti emoagglutinazione

VIRUS complessi I

poxvirus:

i più grandi, visibili a microscopio ottico.

Struttura interna molto complessa ed esterna a forma ovoidale, o di

mattone

VIRUS complessi II

Fagi (es pari che infettano E. coli)

Testa: icosaedro allungato,

contenente acido nucleico

(quasi sempre DNAds)

Colletto

Stilo (cavo) rivestito da

Guaina

Piastra basale con o senza

Spine caudali

Fibre caudali, si dipartono da ogni

angolo della piastra

VIRUS complessi II

Fagi lambda e maggior parte di dispari: no guaina e piastra, fibre

caudali rudimentali

VIRUS – purificazione

Quattro metodi

1. Centrifugazione differenziale e/o in gradiente di densità

VIRUS – purificazione

Quattro metodi

1. Centrifugazione differenziale e/o in gradiente di densità

2. Precipitazione con solfato d’ammonio concentrato (o PEG)

3. Denaturazione dei contaminanti (virus solitam più stabili)

Temperatura o pH; solventi organici (es cloroformio)

4. Digestione enzimatica (virus solitam più resistenti)

tripsina e ribonucleasi

VIRUS – metodi di conta/carica virale

Generalmente il n totale di virioni è 1-2 milioni di volte il n delle

unità infettanti (almeno nei virus animali)

Conta diretta al microscopio elettronico con aggiunta sferette latex

VIRUS – metodi di conta/carica virale

Metodi indiretti

saggio delle placche PFU

saggio emoagglutinazione (per alcuni virus), permette di

calcolare quantità relative

LA REPLICAZIONE VIRALE

Delbruck e Ellis, 1939 curva di crescita a ciclo unico o “one

step”, poiché il rilascio delle particelle avviene nella

maggior parte dei casi simultaneamente

LA REPLICAZIONE VIRALE

PERIODO DI LATENZA = intervallo minimo di tempo necessario

per riproduzione e liberazione dei virus

All’interno del periodo di latenza distinguiamo

ECLISSI: fase in cui l’acido nucleico è “nudo” entro l’ospite. Se la

cellula ospite viene distrutta in questo momento il virione

non esiste più come entità infettiva

MATURAZIONE: sintesi ed impacchettamento; il numero di

particelle virali mature aumenta notevolmente ma nessuna

viene rilasciata*

*n° di virioni rilasciati è spesso indicato come dimensione dello

scoppio

LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi

1. Attacco (o adsorbimento) del virione alla cellula ospite

2. Penetrazione (o iniezione) del virione o del suo acido nucleico

3. Sintesi

4. Assemblaggio

5. Rilascio lisi

gemmazione

esocrescita

LA REPLICAZIONE VIRALE – fasi

LA REPLICAZIONE VIRALE – difese dell’ospite

In generale, gli animali possiedono sistema immunitario che

spesso evita direttamente l’attacco, ma questo non è possibile

per i microrganismi

Tutti possono invece avere sistemi per distruzione del genoma

virale, e soprattutto i batteri endonucleasi di restrizione e

modificazione (ospite però difende suo DNA con modificazioni

specifiche nei siti di taglio soprattutto per enzimi su DNAds)

I virus però a loro volta spesso si proteggono

proteine che inibiscono enzimi

glicosilazioni

metilazioni (solitamente dopo replicazione)


3. Sintesi di acidi nucleici e proteine:

il virus deve, a prescindere dalla natura del suo genoma:

fare mRNA che servono per proteine specifiche virali

replicare genoma nella forma specifica

Baltimore (1975 Nobel per retrovirus e trascrittasi inversa):

sistema di classificazione basato su relazione del genoma virale

con suo mRNA (con polarità positiva) divisione in 7 classi


3. Sintesi di acidi nucleici:

Classificazione di Baltimore




Classe I DNA ds: segue leggi di ospite

Classe II DNA ss+: prima si forma

filam complementare perché RNA

pol possa lavorare e per sintesi

nuovi genomi, poi filamento -

viene scartato

Classe VII DNA ds ma si replica

attraverso intermedio a RNA

trascrittasi inversa, mentre per

fare mRNA usano meccanismo

classico




Tutti i virus a RNA necessitano di

RNA pol RNA dipendenti virus specifiche

Classe IV RNA ss+: direttamente

mRNA, codificante anche per

RNA replicasi filamento – che

usa come stampo per nuovi

mRNA e per genomi

Classe III e V RNA ss- e ds:

portano RNA pol RNA dipendente

già in forma proteica, introdotta

in ospite con RNA

Classe VI RETROVIRUS – RNA ds:

virus animali a RNA che si

replicano con intermedio a DNA

LA REPLICAZIONE VIRALE – i retrovirus

Tutto catalogato? NO!

Ci sono virus a RNAss con mezzo filamento + e

mezzo - AMBIVIRUS!


3. Sintesi di acidi nucleici e proteine:

Proteine virali possono essere suddivise in:

1. Precoci: tipicamente enzimi, sintetizzati in piccole quantità.

Alcune sono deputate ad arrestare trascrizione e traduzione

dell’ospite

2. Tardive: generalmente componenti strutturali del virione,

prodotte in grande quantità


Conseguenze di infezioni da virus animali:

Infezioni citocide:

1. Inibizione sintesi acidi nucleici e proteine (herpes e

adenovirus)

2. Danno a lisosomi

3. Alterazioni profonde a membrane plasmatiche (es morbillo)

4. Accumulo tossico proteine virali

5. Corpi inclusi

6. Distruzione cromosomi (es herpesvirus)

7. Trasformazione in cellule tumorali


Conseguenze di infezioni da virus animali:

Infezioni croniche:

Es: epatite B, herpes simplex, varicella zooster, citomegalovirus

Si manifestano subito, poi sintomi spariscono perché virus cessa

riproduzione e rimane latente, ma possono ricominciare a

manifestarsi

Infezioni da virus lenti:

Segni e sintomi clinici possono impiegare anni per manifestarsi,

ma poi lo fanno in maniera estremamente invalidante

Es: forme di morbillo non manifeste 5-10 anni

panencefalopatite sclerosante subacuta

LA REPLICAZIONE VIRALE –virus implicati in insorgenza di tumori umani

Epstein-Barr virus linfoma di Burkitt

carcinoma nasofaringico

Hepatitis B virus cancro del fegato

Hepatitis C virus cancro del fegato

Human herpesvirus 8

HIV

sarcoma di Kaposi

human papillomavirus cancro della cervice

HTLV-1 and HTLV-2 leucemia

165-180 e 250-265 dC: Impero Romano epidemia di morbillo e

vaiolo ( Nuovo Mondo nel 1500!); non potevano averli neppure

lontanamente visti, ma immaginati sì!

inizi 1700, Lady Wortley Montagu cerca di portare, con scarso

successo, tecnica empirica di immunizzazione praticata in Turchia da

donne che facevano contrarre ai figli forma lieve di vaiolo

1798: pubblicazione di Jenner, con 23 vaccinazioni di successo

contro vaiolo effettuate con estratti da lesioni provocate dalla forma

bovina. Causa o agenti ancora non chiari, ma tecnica ha successo (?

tutti gli agenti patogeni vengono indicati come virus, anche

Pasteur lo fa!)

VIRUS e VIRIONI – excursus storico

1884 Chamberland contribuisce a scoperta dei virus con

l’invenzione dei filtri di porcellana (porosa) per batteri

1892 Ivanowskij per primo descrive malattia indotta anche dopo

filtrazione di estratti malattia del mosaico del tabacco; definisce

“tossina” l’agente eziologico

1898-1900: stessa identificazione da parte di Beijerinck, che

meglio definisce l’agente come “entità non batterica in grado di

moltiplicarsi solo in cellule vegetali viventi, ma in grado di

sopravvivere per tempi prolungati a stato di disidratazione”. Da

questo momento nuove evidenze

afta epizootica

febbre gialla


~1910 Ellerman e Bang (Copenhagen): leucemia aviaria

Rous (New York): sarcoma maligno dei polli

alcuni tumori possono essere provocati da virus!

1915 Twort: anche i batteri possono essere infettati dai virus

Dimostrato definitivamente da d’Herelle: Shigella dyssenteriae su

piastra + sospensione virale aree circolari chiare contenenti virus

e cellule lisate saggio delle placche

concetto e termine di batteriofagi

1935: Stanley riesce a definire struttura cristallografica del TMV e

quindi a determinarne la natura chimica


1940: Bawden e Pirie riescono a scindere particelle in frazione

proteica e acido nucleico

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