Doutoranda Fernanda A. Castro

Pereira

Melhoramento Genético de Plantas

Prof. Dr. Natal A. Vello

Melhoramento genético

convencional

Genética Quantitativa

Genética Mendeliana

Estatística

Biotecnologia

Biotecnologia

Biologia molecular Técnicas moleculares

• Marcadores moleculares

• Transformação genética

• Etc...

As bases fundamentais da biotecnologia agrícola consideram a biologia

molecular e as técnicas relacionadas como os eventos mais importantes da

história da biotecnologia.

• cultivo in vitro

• micropropagação

• técnicas moleculares

• biologia molecular

• Biologia molecular:

Análise dos indivíduos com base no seu DNA

Tipos de marcadores

• Marcadores fenotípicos Características do organismo - Ex.: cor da flor de soja

• Marcadores bioquímicos Presença ou ausência de compostos – Ex.: isoenzimas,

proteínas ou polissacarídeos específicos.

• Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA -

Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas

Marcadores Moleculares

Marcadores Moleculares

Conceito: Marcadores de DNA são derivados de

pequenas regiões do DNA que apresentam polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie.

Marcadores genéticos, quando

associados a características de interesse (QTLs),

aumentam a eficiência de seleção p.ex.: Marcadores “flaqueando”

um gene/QTL importante

CONCEITOS

PCR – Polimerase Chain Reaction

(Reação em cadeia da polimerase)

• Amplificação de um fragmento de DNA sem o uso de um organismo vivo.

• O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro

TERMOCICLADOR

94 a 96 °C - separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra

das pontes de hidrogênio).

50 a 60 °C - Anelamento dos primers com a fita molde de DNA

72 °C - Extensão da nova molécula - Taq Polimerase

Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2n

• O resultado é analisado por meio de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida

O DNA pode ser visualizado usando-se o brometo de etídio, que, quando intercalado no DNA, fica fluorescente sob a luz ultravioleta.

http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf

Considerando: O marcador associado ao gene de resistência R, é possível observar que esse marcador consegue amplificar o gene R. No indivíduo suscetível, onde não existe o gene R, não houve amplificação, portanto ausência de marca.

Padrão de banda polimórfica

S R

DNA da planta resistente

DNA da planta suscetível

PCR em tempo real

• Método atual de aferir o nível de expressão dos genes;

• Técnica quantitativa: consegue quantificar o n° de moléculas produzidas ciclo a ciclo.

n ciclos 2 n quantidade de DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

MICROSSATÉLITES – SSR Simple Sequence Repeats

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

SNP marcadores derivados de sequencias expressas

Tipos de Marcadores

Exemplos Estudo de diversidade genética Acessos de melão

Ritschel et al. BMC Plant Biology 2004 4:9 doi:10.1186/1471-2229-4-9

Amplificação do DNA com primers SSR

• (1) - limão ‘Cravo’ (Citrus limonia Osbeck)

• (2) - laranja ‘Caipira’ (Citrus sinensis (L.) Osbeck)

LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.1, p. 231-241, 2001

(3, 6, 7, 8 e 9) - híbridos

Seleção de plantas zigóticas na população

Escolha dos Genitores

• Caracterização de linhagens de milho em grupos heteróticos

CELSO GONÇALVES DE AGUIAR - Tese (DETERMINAÇÃO DE GRUPOS HETERÓTICOS EM MILHO

UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES E CRUZAMENTOS TESTE ) MARINGÁ PARANÁ - 2007

Seleção assitida por marcadores (SAM)

• Inoculação do patógeno

• Seleção de indivíduos resistentes e suscetíveis

▫ Bulk R e Bulk S

• Seleção de marcadores polimórficos

▫ ligado a região do genoma que participa no processo de defesa da planta contra a doença.

Summa Phytopathol, Botucatu, v. 34, n. 3, p. 253-255, 2008

Ferrugem em eucalipto

Transformação de Plantas

1 °Métodos de inserção do DNA

recombinante INDIRETO

• Via Agrobacterium

DIRETO

• Biobalística

• Eletroporação

3 etapas

Transformação por Agrobacterium

• Agrobacterium tumefaciens – galha da coroa

• Bactérias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta

Construção plasmidial contendo o

gene de interesse

• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, transferindo parte do seu DNA para as células da planta

Transformação por Biobalística • Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas

com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta

Transformação por eletroporação • Consiste em submeter os protoplastos e DNA a

um campo elétrico de intensidade controlada

• Choque elétrico - formação de poros reversíveis na membrana plasmática permitindo a entrada do DNA.

Alta voltagem

2°Regeneração (Cultura de tecidos)

Totipotência - é a capacidade de regenerar um indivíduo completo a partir de uma única célula. Essa propriedade não é constatada nas células animais.

3°Análises Moleculares de

Plantas Transgenicas • O gene de interesse é transferido juntamente

com o gene marcador de seleção

• Southern blot – detectar fragmentos de DNA específicos.

• PCR – alta sensibilidade, o que leva a resultados de falso positivo.

Os Transgênicos

Tipos de Transgênicos 1ª Geração • Características de produção

• –redução do custo de produção

2ª Geração • –resistência a herbicida, doenças e insetos

• –tolerância ao estresse ambiental

3ª Geração • Características de consumo

• –agregar valor ao produto final

• –melhoria nutricional

• –melhor conservação pós-colheita

“Os campos vão se transformar em

fábricas de proteínas e

medicamentos” BASF

Soja transgênica - 1ª Geração • Roundup Ready - soja tolerante ao herbicida

glifosato

• Glifosato bloqueia a atividade da enzima EPSPS

• Gene CP4 EPSPS (transgene)

• Aprovada pela CTNBio em 2005

• Atualmente:

• Cultivance® e é o primeiro material geneticamente modificado, desenvolvido no Brasil, desde o laboratório até a comercialização.

• Soja resistente ao herbicida de amplo espectro da BASF + EMBRAPA.

• Aprovado pela CTNBio em 2009

• Produtividade

• Lagarta-da-soja, Lagarta-da-maçã, Falsa-Medideira e Broca-das-axilas.

• Tolerância à aplicação de glifosato

RR X Intacta sem inseticida

Soja transgênica - 2ª Geração

Transgênicos (Soja e Milho) - 3ª

Geração

em fase de desenvolvimento • Soja com mais ácido oleico

• Soja com alto conteúdo de isoflavonóides

• Soja com ácido linolênico conjugado

• Soja com teor elevado de ômega 3

• Plantas de milho que sintetizam genes do

hormônio do crescimento humano.

Embrapa Alface transgênica 3ª geração: 30% a mais de ácido fólico

Últimas notícias

• 05/2016 Academia de Ciências dos EUA afirma que alimentos transgênicos são seguros

• 04/2016 Brasil apresenta crescimento da adoção de transgênicos

http://cib.org.br/

Desafios da Biotecnologia no

Melhoramento de Plantas

▫ Natureza poligênica das características de importância econômica

▫ Interação do genótipo com o ambiente (F = G + A)

Novas tecnologias desenvolvidas com a biotecnologia

Biblioteca Central – ESALQ/USP

OBRIGADA fepereira@usp.br