Genética Mendeliana Genética Estatística€¦ · Genética Quantitativa Genética Mendeliana...
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Doutoranda Fernanda A. Castro
Pereira
Melhoramento Genético de Plantas
Prof. Dr. Natal A. Vello
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Melhoramento genético
convencional
Genética Quantitativa
Genética Mendeliana
Estatística
Biotecnologia
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Biotecnologia
Biologia molecular Técnicas moleculares
• Marcadores moleculares
• Transformação genética
• Etc...
As bases fundamentais da biotecnologia agrícola consideram a biologia
molecular e as técnicas relacionadas como os eventos mais importantes da
história da biotecnologia.
• cultivo in vitro
• micropropagação
• técnicas moleculares
• biologia molecular
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• Biologia molecular:
Análise dos indivíduos com base no seu DNA
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Tipos de marcadores
• Marcadores fenotípicos Características do organismo - Ex.: cor da flor de soja
• Marcadores bioquímicos Presença ou ausência de compostos – Ex.: isoenzimas,
proteínas ou polissacarídeos específicos.
• Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA -
Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas
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Marcadores Moleculares
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Marcadores Moleculares
Conceito: Marcadores de DNA são derivados de
pequenas regiões do DNA que apresentam polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie.
Marcadores genéticos, quando
associados a características de interesse (QTLs),
aumentam a eficiência de seleção p.ex.: Marcadores “flaqueando”
um gene/QTL importante
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CONCEITOS
PCR – Polimerase Chain Reaction
(Reação em cadeia da polimerase)
• Amplificação de um fragmento de DNA sem o uso de um organismo vivo.
• O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro
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TERMOCICLADOR
94 a 96 °C - separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra
das pontes de hidrogênio).
50 a 60 °C - Anelamento dos primers com a fita molde de DNA
72 °C - Extensão da nova molécula - Taq Polimerase
Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2n
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• O resultado é analisado por meio de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida
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O DNA pode ser visualizado usando-se o brometo de etídio, que, quando intercalado no DNA, fica fluorescente sob a luz ultravioleta.
http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf
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Considerando: O marcador associado ao gene de resistência R, é possível observar que esse marcador consegue amplificar o gene R. No indivíduo suscetível, onde não existe o gene R, não houve amplificação, portanto ausência de marca.
Padrão de banda polimórfica
S R
DNA da planta resistente
DNA da planta suscetível
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PCR em tempo real
• Método atual de aferir o nível de expressão dos genes;
• Técnica quantitativa: consegue quantificar o n° de moléculas produzidas ciclo a ciclo.
n ciclos 2 n quantidade de DNA
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RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
MICROSSATÉLITES – SSR Simple Sequence Repeats
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
SNP marcadores derivados de sequencias expressas
Tipos de Marcadores
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Exemplos Estudo de diversidade genética Acessos de melão
Ritschel et al. BMC Plant Biology 2004 4:9 doi:10.1186/1471-2229-4-9
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Amplificação do DNA com primers SSR
• (1) - limão ‘Cravo’ (Citrus limonia Osbeck)
• (2) - laranja ‘Caipira’ (Citrus sinensis (L.) Osbeck)
LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.1, p. 231-241, 2001
(3, 6, 7, 8 e 9) - híbridos
Seleção de plantas zigóticas na população
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Escolha dos Genitores
• Caracterização de linhagens de milho em grupos heteróticos
CELSO GONÇALVES DE AGUIAR - Tese (DETERMINAÇÃO DE GRUPOS HETERÓTICOS EM MILHO
UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES E CRUZAMENTOS TESTE ) MARINGÁ PARANÁ - 2007
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Seleção assitida por marcadores (SAM)
• Inoculação do patógeno
• Seleção de indivíduos resistentes e suscetíveis
▫ Bulk R e Bulk S
• Seleção de marcadores polimórficos
▫ ligado a região do genoma que participa no processo de defesa da planta contra a doença.
Summa Phytopathol, Botucatu, v. 34, n. 3, p. 253-255, 2008
Ferrugem em eucalipto
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Transformação de Plantas
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1 °Métodos de inserção do DNA
recombinante INDIRETO
• Via Agrobacterium
DIRETO
• Biobalística
• Eletroporação
3 etapas
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Transformação por Agrobacterium
• Agrobacterium tumefaciens – galha da coroa
• Bactérias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta
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Construção plasmidial contendo o
gene de interesse
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• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, transferindo parte do seu DNA para as células da planta
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Transformação por Biobalística • Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas
com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta
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Transformação por eletroporação • Consiste em submeter os protoplastos e DNA a
um campo elétrico de intensidade controlada
• Choque elétrico - formação de poros reversíveis na membrana plasmática permitindo a entrada do DNA.
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Alta voltagem
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2°Regeneração (Cultura de tecidos)
Totipotência - é a capacidade de regenerar um indivíduo completo a partir de uma única célula. Essa propriedade não é constatada nas células animais.
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3°Análises Moleculares de
Plantas Transgenicas • O gene de interesse é transferido juntamente
com o gene marcador de seleção
• Southern blot – detectar fragmentos de DNA específicos.
• PCR – alta sensibilidade, o que leva a resultados de falso positivo.
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Os Transgênicos
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Tipos de Transgênicos 1ª Geração • Características de produção
• –redução do custo de produção
2ª Geração • –resistência a herbicida, doenças e insetos
• –tolerância ao estresse ambiental
3ª Geração • Características de consumo
• –agregar valor ao produto final
• –melhoria nutricional
• –melhor conservação pós-colheita
“Os campos vão se transformar em
fábricas de proteínas e
medicamentos” BASF
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Soja transgênica - 1ª Geração • Roundup Ready - soja tolerante ao herbicida
glifosato
• Glifosato bloqueia a atividade da enzima EPSPS
• Gene CP4 EPSPS (transgene)
• Aprovada pela CTNBio em 2005
• Atualmente:
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• Cultivance® e é o primeiro material geneticamente modificado, desenvolvido no Brasil, desde o laboratório até a comercialização.
• Soja resistente ao herbicida de amplo espectro da BASF + EMBRAPA.
• Aprovado pela CTNBio em 2009
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• Produtividade
• Lagarta-da-soja, Lagarta-da-maçã, Falsa-Medideira e Broca-das-axilas.
• Tolerância à aplicação de glifosato
RR X Intacta sem inseticida
Soja transgênica - 2ª Geração
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Transgênicos (Soja e Milho) - 3ª
Geração
em fase de desenvolvimento • Soja com mais ácido oleico
• Soja com alto conteúdo de isoflavonóides
• Soja com ácido linolênico conjugado
• Soja com teor elevado de ômega 3
• Plantas de milho que sintetizam genes do
hormônio do crescimento humano.
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Embrapa Alface transgênica 3ª geração: 30% a mais de ácido fólico
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Últimas notícias
• 05/2016 Academia de Ciências dos EUA afirma que alimentos transgênicos são seguros
• 04/2016 Brasil apresenta crescimento da adoção de transgênicos
http://cib.org.br/
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Desafios da Biotecnologia no
Melhoramento de Plantas
▫ Natureza poligênica das características de importância econômica
▫ Interação do genótipo com o ambiente (F = G + A)
Novas tecnologias desenvolvidas com a biotecnologia
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Biblioteca Central – ESALQ/USP
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OBRIGADA [email protected]