INFORME:LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALESFIRAVITOBA (BOY)SENA- CEDEAGRO2013INFORME:LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

INFORME DE LABORATORIO

ING. OMAR ARIEL CAMARGO GONZALEZ

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALESFIRAVITOBA (BOY)SENA-CEDEAGRO2013PREAMBULO

En los procedimientos de cultivo descritos hasta la dcada de los ochenta, no se hace ninguna referencia al control ambiental en el desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de las plantas formadas in vitro estn influenciadas por el ambiente fsico, qumico y gaseoso de los recipientes. El incremento de conocimientos acerca del control ambiental del cultivo de tejidos en condiciones estriles, est provocando una evolucin de las distintas tcnicas empleadas en la microopropagacion de plantas. El ambiente in vitro en recipientes con baja tasa de ventilacin presenta unas tasas bajas de flujo de materia y energa, con mnimas variaciones de temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentracin de CO2 en el interior de los recipientes. El tipo de recipiente de cultivo (tamao, forma, material y sistema de cierre) puede condicionar la evolucin de la composicin gaseosa en su interior durante el perodo de cultivo. Ante los distintos factores de estrs que tienen que soportar durante las fases de la microopropagacion las plantas producidas en recipientes con nulo o escaso intercambio gaseoso, pueden manifestar alteraciones o dficit en cuanto a su estructura anatmica, morfolgica y fisiolgica. Como consecuencia, estas plantas presentan un fenotipo incapaz de sobrevivir al transplante directo al invernadero o campo. Actualmente se pueden utilizar diferentes mtodos para controlar el ambiente en las distintas fases de la microopropagacion, ya sean cultivos hetertrofos, mixtrofos o auttrofos. La eleccin de la mejor estrategia va a depender de varios factores, destacando la especie, el nmero de transplantes requerido y la relacin calidad precio entre otros.

INTRODUCCION

El cultivo in vitro, microopropagacion o propagacin vegetal in vitro, es el cultivo de clulas, tejidos u rganos de plantas en un medio asptico que le aporta los nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones fsicas y qumicas apropiadas, las clulas tienen la habilidad de desarrollarse, desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un organismo entero" en cuyo caso, la nueva planta ser genticamente idntica a la planta madre, y su desarrollo se dar en un periodo de tiempo mucho ms corto. As pues, para lograr cualquiera de estos propsitos se debe iniciar con la utilizacin de pequeas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfeccin superficial, son transferidos aspticamente a medios nutritivos lquidos o semislidos y almacenados bajo condiciones ideales de temperatura y fotoperodicidad que garanticen un rpido desarrollo. Los medios de cultivo, lquidos o semislidos, difieren bsicamente por la presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y energa (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminocidos, suplementos orgnicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintticos conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros qumicos vegetales secretados en un determinado tejido y que actan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulacin del crecimiento en plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscsico y Etileno.

OBJETIVO GENERAL

Esta prctica busca el conocimiento e implementacin de algunas tcnicas bsicas del cultivo de tejidos vegetales.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Inducir desdiferenciacin tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos vegetales. Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con fitohormonas. Desarrollar el protocolo de tratamiento y desinfeccin de semillas. Implementar el manejo adecuado de semillas en laboratorio y vivero. Conocer la utilidad y el manejo del equipo bsico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

EXPLANTE

Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

OBJETIVO DEL CULTIVO

Si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podra esquematizarlas en aplicaciones para:

Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos, lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de contaminacin con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Ej: Lulo de la selva.

Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares.

Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintticas) el explante original deber posibilitar la induccin de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes.

Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos derivados de cruzamientos interespecficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos fecundados.

Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones en un estado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero.

Obtencin de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito quecontiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados.

Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras.

Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Los de races suelen ser muy utilizados.

Obtencin de hbridos somticos. Para esta finalidad se recurre a la fusin de protoplastos. En la mayora de los casos se aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de suspensiones celulares.

Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo plazo (croconservacin con nitrgeno lquido) y para el intercambio de material gentico.

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extrados de semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledones, races).

POSIBILIDAD DE CONTAMINACION CON MICROORGANISMOS.

De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos.

EDAD FISIOLOGICA

Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

TAMAO

En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados.

EPOCA DEL AO

Es un factor que suelen tener mucha importancia en la microopropagacion y que generalmente est asociado al grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos.

ASEPCIA

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explante medio de cultivo condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamente aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias.

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col, luego de revisar ms de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la siguiente tabla se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran:

Una fuente de carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamnicas Sustancias reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de medios semislidos)

CONDICIONES AMBIENTALES PARA LA INCUBACION

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor) y una buena y uniforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad atmosfrica debe ser elevada (80- 90%).

ACLIMATACION DE LAS PLANTAS REGENERADAS IN VITRO

Durante el perodo de incubacin, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales dismiles al ambiente externo. La atmsfera interna se caracteriza por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumnica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas hetertrofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatmicas y fisiolgicas que las plantas debern corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este perodo de adaptacin al nuevo hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo tiempo, estimular la fotosntesis con el objeto de generar un rpido crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutcula y la escasa funcionalidad del aparato estomtico que presentan las hojas de la mayora de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin.

PROCEDIMIENTO

Preparacin de los medios de cultivo: Para esta prctica se deben preparar y esterilizar bajo condiciones de calor hmedo (15 psi/ 121 C/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo: 1.Induccin de callos: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), suplementado con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por la instructora. Se sugiere relacin auxina:citoquinina (1:1 o 2:1) 2.Crecimiento: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas, gar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relacin auxina:citoquinina (1:1 o 1:2)3. Proceso de desinfeccin del material vegetal: Una vez lavado el material vegetal con agua y jabn, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de sodio (2%, 15 min.). Pasado este perodo de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estriles a los medios de cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad.

SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRCTICA

1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales y anotar los avances que estos presenten, incluyendo aparicin de callos, contaminaciones, organognesis y aumento en longitud o tamao. 2. Realizar subcultivos rutinarios y continuar el desarrollo de estos.

Manual de laboratorio de BiotecnologaNORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIN DEL ESPACIO EN PRCTICAS DE LABORATORIO

*Use bata de laboratorio para cada prctica y no utilice calzado destapado *Use guantes, tapaboca, lentes de proteccin, y mscara con filtros, cuando se requieran. *No pipetee con la boca, use un pipeteador *No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningn reactivo pues sus vapores pueden ser txicos *No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio *No use durante las prcticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares *No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que all se produce *No se admiten en el laboratorio personas que no estn matriculadas en el respectivo curso, por favor no reciba visitas *No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo.

UTILIZACIN DE REACTIVOS *Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo prepar y la fecha de preparacin *No arroje por los sumideros cidos, bases o algn otro reactivo, por favor depositelos en los recipientes de desecho *Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, as se previene que algn compaero se queme la piel o se deteriore la ropa. *No arroje al piso ningn reactivo *No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.

VENTAJAS

A partir de un individuo de alto vigor gentico se pueden obtener miles de descendientes en un mismo periodo. La propagacin se realiza independientemente de las condiciones ambientales. Es el mtodo ms eficaz para la obtencin de plantas totalmente libres de enfermedades. Producto del saneamiento y rejuvenecimiento que provoca el cultivo in vitro se aumenta el rendimiento en un 20% a un 40%. Permite en el campo ciclos productivos sincrnicos que facilitan la planificacin de las actividades de siembra y cosecha.

GLOSARIO

Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas), que producen elongacin celular, y en algunos casos divisin celular; frecuentemente inducen la aparicin de races adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vstagos). Ejemplo el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintticas), que inducen la divisin celular y frecuentemente la formacin yemas adventicias (en los vstagos). En la mayor parte de los casos inhiben el desarrollo de races adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical. Ejemplo: 6-benzilaminopurina (BA). Callo: Tejidos no organizados, formados por clulas diferenciadas y no diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en zonas daadas (por heridas), o en cultivo de tejidos.

BIBLIOGRAFIA

farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132. Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medelln. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronoma. Murashige T., Skoog F., 1962, A revised mdium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97 Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid.

ANEXOS