Elettroforesi

Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,

Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.

Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.

Forza elettrica : Fel = q · E

Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )

Quando le forze si bilanciano:

q ·E = f ·v

q

→ v = — · E f

v qmobilità elettroforetica : = — = —

E f

Principio:

Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:

V = R I

W = R I2

→ Operare a I costante

→ Dissipare l’eccesso di calore

Acidi nucleici

ELETTROFORESI SU SUPPORTO

su carta su gel

Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale

Formazione di un gel di poliacrilammide

CH2

• Acrilamide, bisacrilamide → monomeri

• Ione perossodisolfato → iniziatore

• TEMED → catalizzatore

• L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

• La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a

quella che ci si aspettera

• Effetto setaccio del supporto di

separazione

• Grafico di Ferguson:

– Mobilità elettroforetica in funzione della

concentrazione del gel

Effetto “setaccio” in un gel uniforme

MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”

Se q L, in

assenza di gel e’

pressoché

indipendente dalle

dimensioni

molecolari

Migrazione

di proteine

e DNA in

gel di varia

porosita’

Visualizzazione del DNA: etidio bromuro

luce UV

Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità

proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo

migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi

molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso

molecolare del campione ignoto

pozzetti

distanza in cm dai pozzetti

-20-10-7.0

x

1

2

3

4

5

6

7

8

Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire

una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono

costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso

molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logaritmico, si

dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal

pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare

approssimativo

0 1 2 3 4 5 6

1.30

1.00

0.80

0.69

0.60

0.47

0.30

0.20

0.00

-0.15

-0.3

X

Distanza in cm dal pozzetto

X=log10 0,54

100,54= Kb 3,4620

10

7

5

4

3

2

1,6

1

0.7

0,5

Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo

che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle

catene polipeptidiche.

Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil

Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si

ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS.

In media, ogni due amminoacidi sarà presente una molecola di SDS.

Poiché ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH

adoperati per l’elettroforesi, la carica netta delle catene polipeptidiche

rivestite sarà molto più negativa di quella delle catene non rivestite.

Inoltre il rapporto carica/massa sarà essenzialmente identico per

proteine diverse, dal momento che il rivestimento di SDS domina la

carica.

La separazione delle catene polipeptidiche

denaturate e rivestite di detergente

si baserà quasi esclusivamente

sulle dimensioni delle molecole proteiche

proteina

Sodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

❖ Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è

essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

❖ La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è

versata direttamente al di sopra del resolving gel

❖ Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle

proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel

❖ In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving

gel in maniera efficace e riproducibile

❖ Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di

acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare un’alta porosità, ed è

tamponato con tampone Tris-HCl a pH 6,8

❖ Il resolving gel contiene invece una percentuale più alta di

acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a pH 8,8

❖ Il tampone di corsa contiene Tris a pH 8,3 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stacking gel a pH 6,8 sarà

principalmente nella sua forma zwitterionica neutra, con una piccola frazione (1%)

in forma di ione glicinato carico negativamente

Ciò impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni Cl- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 6,8 e migrano

rapidamente verso l’anodo

Durante questa elettroforesi nello stacking gel, la concentrazione degli ioni Cl-

scende drasticamente all’estremità catodica del gel, formando un gradiente

crescente di concentrazione verso l’anodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante, i quali hanno rapporti

carica/massa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl-, devono

adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl- e davanti alla

glicina

A mano a mano che procede l’elettroforesi, le molecole proteiche che

raggiungono il resolving gel sono ritardate notevolmente, consentendo alle

molecole proteiche che le seguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine “presentato” al gel di risoluzione sarà molto più piccolo

del volume caricato inizialmente sullo stacking gel

Quando viene applicata la corrente, tutte le specie ioniche presenti devono

migrare alla stessa velocità altrimenti si verifica una interruzione nel circuito

elettrico.

Perché ciò avvenga è necessario che gli ioni glicinato, più lenti, siano soggetti

ad un campo elettrico più intenso rispetto agli ioni Cl- più veloci.

Il campo elettrico è inversamente proporzionale alla conduttività, la quale a

sua volta è proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente.

Il risultato è che le tre specie ioniche tendono a variare la propria

concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano più concentrati dei complessi SDS-

proteina, i quali, a loro volta, siano più concentrati del glicinato.

Dal momento che la quantità di complessi SDS-proteina è molto inferiore alla

quantità di ioni glicinato, questi complessi tendono a concentrarsi in una

banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-.

• Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del pH più alto

(6,8 nello stacking gel e 8,8 nel resolving gel), diviene completamente ionizzato

e quindi aumenta la propria mobilità

• Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl- migrano più

velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina, i quali migrano in maniera

inversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

• La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di

setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel

• Le proteine più piccole passano più facilmente all’interno dei pori del gel, mentre

le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

SDS-PAGE

(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

SDS-PAGE : elettroforesi discontinua

Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] >

[proteina-SDS] > [glicinato].

Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra

in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.

Colorazione con Coomassie

Colorazione con nitrato di Ag

Si possono effettuare valutazioni

quantitative delle bande proteiche

col densitometro: misurazione della

luce trasmessa quando un raggio luminoso

è fatto passare attraverso il gel colorato.

Si hanno picchi di assorbimento di cui si può

calcolare l’area che è proporzionale

alla quantità di proteina

COLORANTI ASPECIFICI

Applicazioni della SDS-PAGE

• Purezza del campione

• Determinazione del PM

• Western blot

• Purificazione della proteina

Applicazioni dell’SDS-PAGE

Determinazione del PM

Western blotting

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Tecniche di analisi ElettroforesiElettroforesi capillare

Altissimo potere risolutivo.

Capillare di silice riempito con elettrolita.

Si usano campi elettrici elevati perché il capillare disperde bene il calore.

Si usa soprattutto in Biochimica clinica per dosare le proteine del siero e le emoglobine patologiche.

Tecniche di analisi Elettroforesi

Elettroforesi di proteine

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Tecniche di analisi Elettroforesi

Il colore del fondo si forma solo in presenza di superossido, dove c’è l’enzima la colorazione non si forma

Zimogramma

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Tecniche di analisi Elettroforesi

Densitometria

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Densitometria: relativa or assolutaTecniche di analisi Elettroforesi

Tecniche di analisi Elettroforesi

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Tecniche di analisi Elettroforesi

Tecnica molto usata in diagnostica molecolare per discriminare varianti proteiche prodotte da geni mutati.

Tecniche di analisi Elettroforesi

Proteomic AnalysisTecniche di analisi

Juang RH (2005) BCbasics

Proteolytic

digestion

GCG

Proteolytic fragmentsPure protein2D electrophoresisSample

MALDI-TOF

CapillaryElectrophoresis

HPLC

N-

Amino acid sequencing

Mass spectrum

Databasesearching

LC/MS/MS

Tecniche di analisi

MALDI-TOF

Protease digestion

Compare peptides and identify the unknown protein

m/z

P1 P2 P3 P4

MW4 MW2 MW3 MW1

Unknown protein

Search Database

Candidate protein

Digestion Simulation

MW4 MW2 MW3 MW1

Calculate Mol wt

Juang RH (2004) BCbasics

Tecniche di analisi

LC

ESI-Mass/Mass

Protease digestion

P1 P2 P3 P4

Unknown protein

P4

GK

GS

WV

R

-GKGSWVR Direct sequencing

P1 P2 P3

ESI-Mass/Mass

P4

PLC

P4

P

● Phosphorylation site

Protease digestion

Phosphorylated protein

Juang RH (2004) BCbasics

Tecniche di analisi

Elettroforesi delle proteine plasmatiche