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Elettroforesiproteine ed acidi

nucleici

Flavia FrabettiTecnici di laboratorio2010/2011

ELETTORFORESI

• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico

matrice di gelcella elettroforeticaalimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante)tamponi salini

si possono studiare sia gliacidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine

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Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consentela separazione

può essere fatto di polimeriagarosio o poliacrilamide

Gel di agarosio: pesare l’agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita

Gel di acrilamide:miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*

Come si forma il gel?

Gel di acrilamide

• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine• di solito in sistemi verticali, poiché se ne fanno “lastre” di 0,2-0,4 mmi cui pozzetti non sarebbero “caricabili” in un sistema orizzontale• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri

taglia molecolare del peptideconcentrazione di acrilamideconformazione della molecola (denaturata o meno)voltaggio

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pozzetticon i campioni

campione

anodo

catodo

supportodiplastica

tampone

tampone

PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteineè di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistemaverticaleSDS = detergente(sodio-dodecil-solfato)carico

-

Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE

well= pozzettolane= corsia

SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico)BME = β- mercaptoetanolo (riducente)

proteina tetramerica proteina monomerica

bollitura

bollitura

peptidi connessi daponti disolfuro

peptidi separati

DENATURAZIONE DELLE PROTEINE: preparazione del campione (sample) con proteine denaturate

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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi

(in kilodalton)

8 200 - 25

10 100 - 15

12.5 70 - 10

15 60 - 6

20 40 - 4

Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine

Dal Chieffiriquadro 2.2 pag:44-48

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALESU GEL o ISOELECTROFOCUSINGpunto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica nettadi una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, quiLa proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica

pH acido

pH basicoI fase:

separazionepercarica

II fase: separazione dimensionale

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Rivelazione della separazione elettroforetica:

• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela(es. con comassie blue o silver-stain)

• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici di nitrocellulosa attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche

1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi

consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare ilturn-over proteico (esperimenti di pulse-chaise)

l’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S (emivita di 87gg)

metionina

cisteina

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2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

consente di riconoscere una specifica proteina di interesse

consta di diverse fasi schematizzabili in:a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosab) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)

a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa

trasferimentodelle proteine

proteina di interesse

carta imbevutadi tampone

carta imbevutadi tampone

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b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) -fasi procedurali

anticorpi Ilegano l’antigene

anticorpi IIlegano gli anticorpi I

la membrana viene saturata daproteine inerti

sviluppo della colorazione enzimatica

Verifica qualitativa e quantitativaacidi nucleici

SpettrofotometroAnalisi a λ= 260 nmSi misura la ssorbanza odensità ottica O.D.1 O.D. ≈ 50 µg DNA1 O.D. ≈ 40 µg RNA1 O.D. ≈ 30 µg oligonucleotidiλ= 280 nm proteine260/280 > 1,8 (≈2) è abbastanza puro

Nanodrop ®

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Gel di agarosio

• utili per la separazione e caratterizzazione di acidi nucleici• di solito in sistemi orizzontali• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel di agarosiodipende principalmente da 4 parametri

taglia molecolare del DNA o RNAconcentrazione di agarosioconformazione della molecolavoltaggio

Allestimento della tecnicaelettroforetica su gel orizzontalidi agarosio (schema)

preparazione gel

caricamento campioni(Ø 5mm/well)

connessione edaccensione

rilevazione

Campione (sample)viene diluito in untampone di caricamento (loadingbuffer) che contiene 2 coloranti pertracciare la corsa:

Blu di bromofenolo (Bb) 300 bp

Xilene cianolo (Xc) 4.000 bp

ed anche glicerolo per appesantire ilcampione

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Corsa e rilevazione su gel orizzontalidi agarosio - procedure

Riempire la vaschetta con il buffer

Caricare i campioni sul gel Accendere l’alimentatore (parte la corsa del gel)

Fine della corsa

Analisi del gel al transilluminatore

Risultato

Bande luminose per via del bromuro di etidio (intercalante del DNA) che “fluoresce” ai raggi UV e si vede banda giallo-arancioLimite di sensibilità 1-5 ng di DNA

Le molecole più grandi hannoV minore, per > attrito e perchévengono intrappolate di più nellemaglie del gel

std molecolari o markers a dimensione nota

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Taglia molecolare del DNA o RNA e migrazione

Agarosio (%) Intervallo di separazione di DNA lineare (in Kb)

0.3 60 - 5

0.6 20 - 1

0.7 10 - 0.8

0.9 7 - 0.5

1.2 6 - 0.4

1.5 4 - 0.2

2.0 3 - 0.1

Di norma si applica un voltaggio di 5 Volt /cm di lunghezzadella vaschetta

Il voltaggio (V) tende a variare durante la corsa in rapporto allavariazione nella distribuzione delle cariche e del pHDurante la corsa la resistenza (R) aumenta V= i x Rper avere una migrazione costante deve aumentare anche V

Uniformità di calore e pH:le corsie periferiche sono più fredde (effetto smile) di norma evitatocon tubicini che collegano parte negativa e positiva

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I gel di poliacrilamide per separare acidi nucleici sono usati se:• si devono separare piccoli oligonucleotidi < 100 basi, si possono risolvere anche oligo diversi anche per 1 nucleotide• sono di solito a basse concentrazioni di acrilamide (<=6%) e contengono Urea (6M)

Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota(questo vale anche per le proteine)

Il DNA è una molecola che ha un rapporto “carica/massa” costantee dunque uniformità nella separazione

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Gel controllo DNA

pozzetti

markersa dimensionenota

La quantità di DNA attesa è di 7 pg per cellula umana diploideEs. globuli bianchi 6.000/µl ovvero 6.000.000/ml6.000.000 x 7 pg= 42.000.000 pg = 42.000 ng= 42 µg

frammentidi DNA genomico (50-100Kb)

GEL DNA APOPTOSIladder (scala) apoptotico

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Gel controllo RNA

28S (5000 basi)18S (2000 basi)

5S+tRNA(100 basi)

L’80-85% di RNA cellulare e costituito da rRNA, circa il 10% da tRNAE tra 1-5 % da decine di migliaia di mRNA diversi

Gel degradazione RNA,contaminazione DNA

effetto SMEAR striscia