Elettroforesi - uniroma1.it · 2018. 11. 19. · Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. ... Il...
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Elettroforesi
Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,
Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.
Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.
Forza elettrica : Fel = q · E
Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )
Quando le forze si bilanciano:
q ·E = f ·v
q
→ v = — · E f
v qmobilità elettroforetica : = — = —
E f
Principio:
Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:
V = R I
W = R I2
→ Operare a I costante
→ Dissipare l’eccesso di calore
Acidi nucleici
ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta su gel
Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale
Formazione di un gel di poliacrilammide
CH2
• Acrilamide, bisacrilamide → monomeri
• Ione perossodisolfato → iniziatore
• TEMED → catalizzatore
• L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione
• La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a
quella che ci si aspettera
• Effetto setaccio del supporto di
separazione
• Grafico di Ferguson:
– Mobilità elettroforetica in funzione della
concentrazione del gel
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”
Se q L, in
assenza di gel e’
pressoché
indipendente dalle
dimensioni
molecolari
Migrazione
di proteine
e DNA in
gel di varia
porosita’
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV
Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità
proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo
migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi
molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso
molecolare del campione ignoto
pozzetti
distanza in cm dai pozzetti
-20-10-7.0
x
1
2
3
4
5
6
7
8
Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire
una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono
costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso
molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logaritmico, si
dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal
pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare
approssimativo
0 1 2 3 4 5 6
1.30
1.00
0.80
0.69
0.60
0.47
0.30
0.20
0.00
-0.15
-0.3
X
Distanza in cm dal pozzetto
X=log10 0,54
100,54= Kb 3,4620
10
7
5
4
3
2
1,6
1
0.7
0,5
Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo
che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle
catene polipeptidiche.
Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil
Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si
ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS.
In media, ogni due amminoacidi sarà presente una molecola di SDS.
Poiché ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH
adoperati per l’elettroforesi, la carica netta delle catene polipeptidiche
rivestite sarà molto più negativa di quella delle catene non rivestite.
Inoltre il rapporto carica/massa sarà essenzialmente identico per
proteine diverse, dal momento che il rivestimento di SDS domina la
carica.
La separazione delle catene polipeptidiche
denaturate e rivestite di detergente
si baserà quasi esclusivamente
sulle dimensioni delle molecole proteiche
proteina
Sodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3
- Na+
❖ Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è
essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli
❖ La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è
versata direttamente al di sopra del resolving gel
❖ Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle
proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel
❖ In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving
gel in maniera efficace e riproducibile
❖ Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di
acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare un’alta porosità, ed è
tamponato con tampone Tris-HCl a pH 6,8
❖ Il resolving gel contiene invece una percentuale più alta di
acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a pH 8,8
❖ Il tampone di corsa contiene Tris a pH 8,3 con glicina come controione
Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stacking gel a pH 6,8 sarà
principalmente nella sua forma zwitterionica neutra, con una piccola frazione (1%)
in forma di ione glicinato carico negativamente
Ciò impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente
Gli ioni Cl- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 6,8 e migrano
rapidamente verso l’anodo
Durante questa elettroforesi nello stacking gel, la concentrazione degli ioni Cl-
scende drasticamente all’estremità catodica del gel, formando un gradiente
crescente di concentrazione verso l’anodo
Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante, i quali hanno rapporti
carica/massa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl-, devono
adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl- e davanti alla
glicina
A mano a mano che procede l’elettroforesi, le molecole proteiche che
raggiungono il resolving gel sono ritardate notevolmente, consentendo alle
molecole proteiche che le seguono di raggiungerle
Il volume del campione di proteine “presentato” al gel di risoluzione sarà molto più piccolo
del volume caricato inizialmente sullo stacking gel
Quando viene applicata la corrente, tutte le specie ioniche presenti devono
migrare alla stessa velocità altrimenti si verifica una interruzione nel circuito
elettrico.
Perché ciò avvenga è necessario che gli ioni glicinato, più lenti, siano soggetti
ad un campo elettrico più intenso rispetto agli ioni Cl- più veloci.
Il campo elettrico è inversamente proporzionale alla conduttività, la quale a
sua volta è proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente.
Il risultato è che le tre specie ioniche tendono a variare la propria
concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano più concentrati dei complessi SDS-
proteina, i quali, a loro volta, siano più concentrati del glicinato.
Dal momento che la quantità di complessi SDS-proteina è molto inferiore alla
quantità di ioni glicinato, questi complessi tendono a concentrarsi in una
banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-.
• Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del pH più alto
(6,8 nello stacking gel e 8,8 nel resolving gel), diviene completamente ionizzato
e quindi aumenta la propria mobilità
• Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl- migrano più
velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina, i quali migrano in maniera
inversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari
• La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di
setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel
• Le proteine più piccole passano più facilmente all’interno dei pori del gel, mentre
le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali
SDS-PAGE
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
SDS-PAGE : elettroforesi discontinua
Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] >
[proteina-SDS] > [glicinato].
Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra
in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.
Colorazione con Coomassie
Colorazione con nitrato di Ag
Si possono effettuare valutazioni
quantitative delle bande proteiche
col densitometro: misurazione della
luce trasmessa quando un raggio luminoso
è fatto passare attraverso il gel colorato.
Si hanno picchi di assorbimento di cui si può
calcolare l’area che è proporzionale
alla quantità di proteina
COLORANTI ASPECIFICI
Applicazioni della SDS-PAGE
• Purezza del campione
• Determinazione del PM
• Western blot
• Purificazione della proteina
Applicazioni dell’SDS-PAGE
Determinazione del PM
Western blotting
M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
Tecniche di analisi ElettroforesiElettroforesi capillare
Altissimo potere risolutivo.
Capillare di silice riempito con elettrolita.
Si usano campi elettrici elevati perché il capillare disperde bene il calore.
Si usa soprattutto in Biochimica clinica per dosare le proteine del siero e le emoglobine patologiche.
Tecniche di analisi Elettroforesi
Elettroforesi di proteine
M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
Tecniche di analisi Elettroforesi
Il colore del fondo si forma solo in presenza di superossido, dove c’è l’enzima la colorazione non si forma
Zimogramma
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Tecniche di analisi Elettroforesi
Densitometria
M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo (a cura di) Metodologie Biochimiche Copyright 2012 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana
Densitometria: relativa or assolutaTecniche di analisi Elettroforesi
Tecniche di analisi Elettroforesi
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Tecniche di analisi Elettroforesi
Tecnica molto usata in diagnostica molecolare per discriminare varianti proteiche prodotte da geni mutati.
Tecniche di analisi Elettroforesi
Proteomic AnalysisTecniche di analisi
Juang RH (2005) BCbasics
Proteolytic
digestion
GCG
Proteolytic fragmentsPure protein2D electrophoresisSample
MALDI-TOF
CapillaryElectrophoresis
HPLC
N-
Amino acid sequencing
Mass spectrum
Databasesearching
LC/MS/MS
Tecniche di analisi
MALDI-TOF
Protease digestion
Compare peptides and identify the unknown protein
m/z
P1 P2 P3 P4
MW4 MW2 MW3 MW1
Unknown protein
Search Database
Candidate protein
Digestion Simulation
MW4 MW2 MW3 MW1
Calculate Mol wt
Juang RH (2004) BCbasics
Tecniche di analisi
LC
ESI-Mass/Mass
Protease digestion
P1 P2 P3 P4
Unknown protein
P4
GK
GS
WV
R
-GKGSWVR Direct sequencing
P1 P2 P3
ESI-Mass/Mass
P4
PLC
P4
P
● Phosphorylation site
Protease digestion
Phosphorylated protein
Juang RH (2004) BCbasics
Tecniche di analisi
Elettroforesi delle proteine plasmatiche