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Tecnologia del DNA ricombinante Enzimi di restrizione

Marcatura sonda Elettroforesi

Concetti fondamentali

1973. Scienziati di Stanford e della UCSF inserirono un frammento di DNA derivante da un plasmide in un altro plasmide

1° molecola di DNA ricombinanate

Introdotta in cellule di E. coli

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Tecniche del DNA ricombinante 1. Metodologie per localizzare specifiche sequenze di DNA

2. Tecniche volte al taglio del DNA in punti specifici

3. Procedure per amplificare migliaia di volte una particolare sequenza di DNA generando una

quantità sufficiente per successive manipolazioni

4. Metodiche per mutare e unire i frammenti di DNA per produrre le

sequenze desiderate

5. Procedure per trasferire le sequenze di DNA all’interno delle cellule riceventi

Le nucleasi

Le nucleasi hanno ampio spettro di attività ma per la maggior parte si tratta di

esonucleasi, che rimuovono i nucleotidi dalle estremità di molecole di DNA e/o RNA,

o di endonucleasi che tagliano i legami fosfodiesterici all’interno di una catena polinucleotidica

Una endonucleasi di restrizione è un enzima che lega una molecola di DNA a livello di una sequenza specifica e taglia il doppio filamento nell’impalcatura

zucchero-fosfato

Questa proprietà è alla base del clonaggio dei geni e di tutti gli altri

aspetti della tecnologia del DNA ricombinante

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Le endonucleasi di restrizione si distinguono in tre gruppi:

Tipo II All’interno del sito di riconoscimento

Tipo III siti casuali vicini a quello di riconoscimento

Tipo I siti casuali distanti da quello di riconoscimento

Tipologia Sito di taglio

enzimi di tipo II

Le sequenze riconosciute variano di solito da 4 a 8 coppie di basi

5’ GATATC 3’ 5’-GATATC- 3’ 5’-GATATC- 3’ 3’ CTATAG 5’

si usa il termine di palindromo o sequenza di basi a simmetria binaria

(presentano la stessa sequenza se vengono lette in direzione 5’-3’

sia su un’elica che sull’altra)

Quasi tutti i i siti di restrizione sono simmetrici nel senso che la sequenza è identica su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA

ma la maggior parte riconosce sequenze di 4 o 6 coppie di basi

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L’enzima scinde l’impalcatura zucchero-fosfato delle molecole di DNA in corrispondenza delle specifiche sequenze

L’enzima può tagliare la sequenza in maniera asimmetrica lasciando delle code appiccicose

(sticky ends o cohesive ends)

L’enzima può tagliare la sequenza esattamente al centro lasciando due tronconi mozzi con le due eliche della

stessa lunghezza (blunt end o flush end)

Il frammento avrà delle code a singola elica che potranno ibridare con le code di altri frammenti generati dalla

digestione dello stesso enzima

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Per assegnare in modo chiaro ed univoco un codice ad un enzima di restrizione è stato deciso che:

Le prime 3 lettere, scritte in corsivo

sono prese dalla nomenclatura binomiale del batterio di origine

Escherichia coli Eco

Sierotipi differenti dello stesso organismo

sono identificati da una quarta lettera minuscola

Haemophilus influenzae Hinf c,d e f

Un numero romano indica l’ordine di scoperta,

qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi

Haemophilus influenzae Hinf I, Hinc II, Hind III

Due enzimi che hanno:

stesso sito di riconoscimento e

stesso sito di taglio

sono detti isoschizzomeri

Due enzimi che hanno:

stesso sito di riconoscimento ma

diverso sito di taglio

sono detti neoschizzomeri

MseI, tetracutter

5’ T T A A 3’ 3’ A A T T 5’

5’-T-3’ 5’-TAA-3’ 3’-AAT-5’ 3’-T-5’

TruI, tetracutter

5’ T T A A 3’ 3’ A A T T 5’

5’-T-3’ 5’-TAA-3’ 3’-AAT-5’ 3’-T-5’

XmaI, esacutter

5’ C C C G G G 3’ 3’ G G G C C C 5’

5’-C-3’ 5’-CCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-C-5’

SmaI, esacutter

5’ C C C G G G 3’ 3’ G G G C C C 5’

5’-CCC-3’ 5’-GGG-3’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’

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L’ utilità delle endonucleasi di restrizione viene accresciuta dalla possibilità di riunire

le molecole precedentemente tagliate e creare combinazioni di DNA inedite

(nuove!)

DNA-LIGASI scoperta nel 1967

permette di legare covalentemente molecole di DNA promuovendo

legami fosfodiestere tra gruppi 5’-fosfato e 3’-OH liberi

Osservare i frammenti di DNA

Alla fine della reazione di digestione ci si pongono domande:

Gli enzimi hanno tagliato il DNA?

Quante volte ciò è accaduto?

Mezzo utile: elettroforesi su gel

valido strumento di analisi che permette di separare molecole di diverso peso molecolare, forma, carica originariamente presenti in una miscela

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Poiché il gruppo fosfato di ciascun nucleotide porta una carica negativa

i frammenti di DNA si muovono verso il polo positivo

Durante la migrazione il gel agisce da setaccio

Le molecole di DNA passano attraverso i pori presenti tra le particelle del gel

I segmenti di dimensioni inferiori migrano più rapidamente di quelli grossi

e con il tempo si separano in base alle dimensioni

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Funzionamento elettroforesi

una volta che il gel ha “corso” per un certo periodo di tempo, molecole di dimensioni differenti saranno separate perché avranno percorso distanze diverse nel gel

Normalmente in un altro pozzetto vengono caricati frammenti di

DNA a lunghezza nota (ladder)

Confrontando la distanza di migrazione dei frammenti da analizzare con quella del ladder

è possibile stimare le dimensioni approssimative dei campioni a lunghezza ignota

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molecole di DNA possono essere visualizzate trattando il gel con coloranti fluorescenti come l’etidio bromuro

che si legano al DNA intercalandosi tra le basi impilate

Tuttavia la quantità di DNA è poca per poterne permettere la visualizzazione diretta

Si ricorre ad alcuni stratagemmi:

Ciascuna banda rivela la presenza di una popolazione di molecole di DNA di dimensioni specifiche

In alternativa è possibile visualizzare i frammenti di DNA aggiungendovi un marcatore radioattivo o chimico

la radioattività presente nel campione impressiona l’emulsione e produce un’immagine della molecola

autoradiografia

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Marcare = rendere evidenziabile

La sonda può essere marcata ai terminali 3 ’ o 5 ’ oppure in tutta la sua lunghezza

Per marcare al 5’ un filamento di DNA (o di RNA) si utilizza la polinucleotide-chinasi

α β γ γ

Si tratta del P in posizione γ, il più lontano dall’adenina

catalizza il trasferimento di un fosforo da un ATP ad un terminale 5’-OH libero (non fosforilato)

Se la molecola di ATP presenta il P in γ radioattivo allora le molecole di DNA dopo la reazione avranno acquisito l’estremità 5’ radioattiva

La reazione catalizzata dalla chinasi oltre che di ATP abbisogna anche di un’estremità 5’ defosforilata

Per questo il DNA o RNA viene prima trattato con un altro enzima la fosfatasi alcalina

che elimina il gruppo fosfato all’estremità 5’ di un acido nucleico

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Chinasi con P

Rimozione P al 5’ ad opera della fosfatasi alcalina

Fosfatasi alcalina più diffusa è la CIP (Calf Intestinal Phosphatase)

cioè estratta dall’intestino del vitello

Questo metodo introduce nella migliore delle ipotesi un atomo di fosforo 32P per filamento

Metodi per marcare un frammento in tutta la sua lunghezza

Più utilizzato nick-translation spostamento progressivo del nick (taglio sulla singola elica)

Ricalca il sistema di riparazione del DNA

RISULTATO FINALE: una specifica molecola di DNA a doppia elica resa radioattiva in un’alta percentuale dei suoi nucleotidi

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Trasferimento di DNA o DNA BLOTTING

Se si taglia con un enzima un segmento di DNA piccolo (es. plasmide o cosmide)

i pochi segmenti prodotti possono essere visualizzati su gel come bande distinte

Se si esegua la stessa operazione con il DNA genomico si ottiene un numero elevato di frammenti che si manifesta come uno smear

Di solito si è interessati unicamente a un numero limitato di frammenti

verosimilmente quelli che contengono un gene specifico di interesse

Ci si avvale allora di una sonda radioattiva che prima prevede:

Al di sopra del gel viene posto il filtro di nitrocellulosa (o nylon)

evitando la formazione di bolle d’aria

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La soluzione salina sale attraverso il gel trascinando con sé il DNA che si attaccherà alla nitrocellulosa con legami di tipo elettrostatico

Tecnica ideata da Ed Southern (Southern Blotting)

In genere si usa dire fare un Southern per indicare un’analisi di DNA su gel e susseguente trasferimento e ibridazione

È possibile trasferire da un gel a un supporto solido anche l’RNA (Northern blotting)

l’ibridazione di una sonda può rilevare le dimensioni di una piccola molecola di mRNA, la sua abbondanza relativa oppure i tessuti in cui il messaggero viene trascritto

Il Westhern blotting è il trasferimento di proteine da un gel a una membrana

In questo caso al sonda è di solito costituita da un anticorpo, utilizzato per stabilire le dimensioni di una particolare molecola proteica e il suo profilo di espressione