Elettroforesi

Con il termine elettroforesi si indica una famiglia di tecniche in cui laseparazione di analiti viene effettuata sfruttandone la diversamigrazione sotto l’azione di un campo elettrico:

(+) anodo (-) catodo

-

+

++

n

In assenza di moti diffusivi/convettivi gli analiti neutri non possonospostarsi nel mezzo.

La velocità di migrazione degli analiti dotati di carica, invece, aumenta:

all’aumentare della carica (e quindi della forza coulombiana) al diminuire delle dimensioni (e quindi dell’attrito nel mezzo)

Evoluzione storica

1930-1940: l’elettroforesi vienesviluppata dal chimico svedeseTiselius (poi Premio Nobel per laChimica nel 1948) per la separazionedi proteine nel tampone contenuto inun tubo di vetro ad U e sottoposto alcampo elettrico generato da dueelettrodi immersi in esso incorrispondenza delle estremità deltubo:

1937: Konig sviluppa l’elettroforesisu carta, ossia la migrazione di analiticarichi attraverso carta imbevuta ditampone, a sua volta sottopostosempre ad una differenza dipotenziale:

Fine anni ’50: elettroforesi su gel

In questo caso il mezzo di migrazioneè un gel (inizialmente costituito daamido, oggi quasi unicamente dapoliacrilammide) schiacciato fralastre di vetro e posto in contatto,alle due estremità, con due riserve dielettrolita, nelle quali sono immersi idue elettrodi.

In presenza di sodio-dodecil-solfato (SDS, Na+ -O3S-O-(CH2)11CH3) e di unagente riducente (ad esempio ditiotreitolo, DTT) che rompa i pontidisolfuro le proteine possono essere “srotolate” e caricate negativamente:

SDS

Ditiotreitolo (DTT)

In queste condizioni la mobilitàelettroforetica dipende dal pesomolecolare della proteina:

Dopo la separazione le proteine possono essere individuate sfruttandodiversi metodi di colorazione:

Coomassie Blue

1966: Vesterberg e Svensson sviluppano la focalizzazione isoelettrica, unatecnica di separazione elettroforetica che sfrutta la presenza di ungradiente di pH stabile all’interno del mezzo di migrazione gelatinoso:

Il gel è realizzato in modo che il suo pH cambi in modo regolare lungo ladistanza, risultando elevato in corrispondenza del catodo (-) e basso incorrispondenza dell’anodo (+): le proteine migreranno in un particolareverso a seconda della loro carica, finché non avranno raggiunto la regionedel gel in cui il pH eguaglia il loro punto isoelettrico. In tale regione essenon avranno più una carica netta e quindi non potranno migrareulteriormente.

1975: O’Farrel sviluppal’elettroforesi bidimensionalesu gel.

Le proteine separate in unaprima corsa elettroforeticamediante focalizzazioneisoelettrica (IEF) vengonocaricate su un secondo gelimbevuto di un elettrolitacontenente SDS.

La migrazione lungo il secondogel dipende dal pesomolecolare, dunque nelcomplesso si realizza unaseparazione bidimensionale:

prima dimensione - carica (punto isoelettrico)

seconda dimensione - peso molecolare-dimensione

Esempio di gel elettroforetico bidimensionale per una miscela complessa diproteine, caratterizzato da centinaia di macchie ottenute per colorazione:

L’elettroforesi capillare è lavariante di elettroforesisviluppata più recentemente(1980).Accoppiata ad opportuni rivelatorirappresenta una delle tecniche diseparazione/analisi a più altarisoluzione e più sensibili inassoluto (LOD dell’ordine di 10-21

moli!).

La strumentazione di base per CE è costituita da: un capillare in silice fusa un generatore di differenze di potenziale elevate, fino a 30 kV (HV) due riserve di elettrolita, rappresentato da una soluzione tampone (buffer) due elettrodi un rivelatore montato sul capillare (on-column)

Elettroforesi capillare (CE)

Flusso elettrosmotico (EOF)

Il flusso elettrosmotico è uno spostamento del liquido contenuto nelcapillare per elettroforesi capillare innescato dall’applicazione del campoelettrico.

Il capillare è simile a quelli impiegati come colonne in GC ma molto più corto(meno di 1 m): il diametro totale è di circa 300 mm, quello della cavità interna di25-75 mm, il rivestimento esterno in polimmide ha uno spessore di circa 15 mm.

In assenza di elettrolita le pareti interne del capillare presentano una serie digruppi silanolici non deprotonati (Si-OH).

20-50 cm

Quando viene introdotto il tampone-elettrolita, tipicamente avente pH > 2,i gruppi silanolici si deprotonano e la loro carica negativa viene bilanciatada cationi dell’elettrolita, che formano un doppio strato di carica sullasuperficie interna del capillare:

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

S

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

D

S = Stern Layer(strato immobile)

D = strato diffuso (mobile)

L’applicazione di una differenza di potenziale provocherà lo spostamento deicationi presenti sulla superficie interna del capillare:

Parete interna del capillare

- - - - - - - ---

+ - -+ + + + +- - -

- -- --+ + + + +

+ + + + ++

++ ++ +

++

+ + ++ + +++Parete interna del capillare

- - - - - - - ---

+ - -+ + + + +- - -+ - -+ + + + +- - -

- -- --+ + + + +

+ + + + ++

++ ++ +

++

+ + ++ + +++ + + ++ + +++A

nod

o Ca

tod

o

Flusso netto

Parete interna del capillare

- - - - - - - ---

+ - -+ + + + +- - -

- -- --+ + + +

++ + + + +

+++ +

+ ++

+

+ + ++ + +++Ano

do C

ato

do

Flusso netto

Parete interna del capillare

- - - - - - - ---

+ - -+ + + + +- - -

- -- --+ + + +

++ + + + +

+++ +

+ ++

+

+ + ++ + +++Parete interna del capillare

- - - - - - - ---

+ - -+ + + + +- - -+ - -+ + + + +- - -

- -- --+ + + +

++ + + + +

+++ +

+ ++

+

+ + ++ + +++ + + ++ + +++

Il movimento delle cariche positive trascina con sé soluzione vincendol’attrito fra il liquido e le pareti del capillare.

In questa situazione il profilo delle velocità del liquido all’interno delcapillare è piatto, mentre in un sistema in cui il flusso è legato ad ungradiente di pressione la velocità del liquido è inferiore in prossimità dellepareti del capillare (a causa dell’attrito) e il profilo delle velocità èparabolico:

flusso elettrosmotico dovuto adun campo elettrico

flusso idrodinamico dovuto ad ungradiente di pressione

Il flusso elettrosmotico ha quindi il vantaggio di non provocare unallargamento di banda come invece quello idrodinamico (tipico di sistemiHPLC).

Il flusso elettrosmotico si compone con il flusso elettroforetico checaratterizza le specie cariche presenti all’interno del capillare:

i cationi saranno spinti verso il catodo da un flusso dato dalla somma delflusso elettroforetico e di quello elettrosmotico;

le specie neutre viaggeranno unicamente sotto la spinta del flussoelettrosmotico;

gli anioni si sposteranno comunque nella stessa direzione delle altrespecie perché il flusso elettrosmotico è normalmente superiore a quelloelettroforetico.

A

N

O

D

E

CATHODE

EOF

+ ions

- ions

A

N

O

D

E

CATHODE

EOFEOF

+ ions+ ions

- ions- ions

A

N

O

D

E

CATHODE

Net flow (- ions)

Net flow (+ ions)

EOFneutrals

Gli anioni più piccoli si sposteranno meno velocemente dei più grandi nelladirezione del catodo perché il loro flusso elettroforetico (diretto versol’anodo) è maggiore; l’opposto si verificherà per i cationi.

Rappresentazione schematica di una separazione elettroforetica capillare

Equazioni fondamentali: elettroforesi

La forza FE che agisce su una particella di carica qsottoposta al campo elettrico E è data da:

La forza Ff con cui il mezzo circostante si opponeal moto della particella, detti vep la velocità diquesta e f il coefficiente di attrito relativoall’azione esercitata dal mezzo, è data da:

Quando le due forze diventano uguali risulta:

e l’accelerazione della particella si annulla, dunqueessa assume una velocità costante, data da:

Il termine mep si definisce mobilità elettroforetica e risente della carica edella dimensione della particella.

Assumendo che la particella si possa considerare equivalente ad una sferadi raggio r e detta h la viscosità del mezzo il suo coefficiente di attrito fsarà dato da:

A parità di tutte le altre condizioni (campo elettrico, mezzo di migrazione,carica) le particelle di raggio maggiore avranno una mobilitàelettroforetica inferiore.

Equazioni fondamentali: elettrosmosi

La velocità assunta da una particella a causa delflusso elettrosmotico si può esprimere in modoformalmente analogo a quello usato per la velocitàelettroforetica:

La mobilità elettrosmotica, meo, dipende dallacostante dielettrica del mezzo (e) e dal potenzialezeta (z), a sua volta legato alla differenza dipotenziale che si crea alla superficie interna delcapillare a causa del gradiente di carica elettrica.

La mobilità elettrosmotica non dipende, quindi, dalle caratteristiche deisingoli analiti e viene favorita da un aumento della quantità di caricapresente alla superficie del capillare (e quindi di z) e da una diminuzionedella viscosità del mezzo.

La composizione (vettoriale) delle mobilitàelettroforetica ed elettrosmotica si definiscemobilità apparente, mapp:

La velocità apparente vapp deriva dallacorrispondente mobilità:

Poiché le mobilità elettroforetiche hanno lo stesso segno della carica dellespecie a cui si riferiscono, mentre la mobilità elettrosmotica è semprepositiva, nel caso degli anioni la mobilità apparente diventa negativa se mepè, in valore assoluto, maggiore di meo.

Ciò avviene se si opera a pH < 3, perché in tali condizioni diminuiscemoltissimo il numero di cariche negative dei gruppi Si-OH del capillare econ esso il valore di meo.

In tal caso gli anioni non potranno mai raggiungere il rivelatore se esso èposto in prossimità del catodo.

Equazioni fondamentali: elettroforesi + elettrosmosi

La mobilità apparente può essere espressa anche in termini di altriparametri strumentali tipici di un apparato per elettroforesi capillare:

dove:

Ld è la lunghezza del capillare dal punto di iniezione al rivelatore;

tm è il tempo di migrazione (l’analogo del tempo di ritenzione incromatografia);

V è la differenza di potenziale applicata agli elettrodi;

Lt è la lunghezza totale del capillare, pressoché pari alla distanza fragli elettrodi (perciò il campo elettrico è dato da V/Lt)

m

td

t

mdapp

app VtLL

LVtL

Ev

μ

Fissate tutte le condizioni strumentali, il tempo di migrazione saràcaratteristico di una particolare specie, come quello di ritenzione incromatografia.

L’efficienza di una separazione elettroforeticacapillare può essere espressa in termini di altezza dipiatto teorico H, come in cromatografia, ma vautilizzata un’equazione di Van Deemter modificata:

In questo caso, infatti, sono assenti i termini correlati: 1) aitrasferimenti di massa fra fasi diverse (termini contenenti ilcoefficiente C), non essendoci una fase stazionaria; 2) ai cammini multipli(parametro A o C modificato), non essendoci un impaccamento.

Il numero dei piatti teorici può esserecalcolato a partire dalle relazioni:

in cui D è il coefficiente di diffusione dell’analita e tm il suo tempo dimigrazione.

Efficienza separativa in CE

21

m2

2

2Dtσ σL

N

u

BH

x

D’altra parte il tempo di migrazione puòessere espresso con la relazione:

Il numero di piatti teorici per una separazione elettroforetica capillare sipuò dunque esprimere con la relazione:

N dipende quindi da una serie di fattori strumentali nonché da unparametro specifico per ciascun analita, il coefficiente di diffusione D.

Poiché le macromolecole hanno valori di D piccoli, nelle separazioni CE diproteine o acidi nucleici si possono raggiungere valori di N dell’ordine di500000-1000000, ossia superiori per uno-due ordini di grandezza a quellitipici dei metodi HPLC.

EμL

vL

tappapp

m

2DVμ

2D

ELμ

2DLEμL

2DtLL

N appappapp

2

m

2

2

2

La risoluzione in CE viene definitaoperativamente in modo analogo a quanto accadenelle tecniche cromatografiche:

In questo caso WA e WB sono le larghezze alla base dei due picchielettroforetici.

L’espressione matematica della risoluzione elettroforetica ricorda in parte,almeno formalmente, quella della risoluzione cromatografica:

Il termine centrale, in cui compaiono la differenza (Dmapp) e la media (mavg)delle mobilità apparenti delle due specie dalle quali si valuta R, rappresentala selettività elettroforetica.

BA

AB

WW)(t)(t2

R mm

BA

AB

WW)(t)(t2

R mm

Risoluzione in CE

Effetto Joule in elettroforesi capillare

Poiché l’applicazione di una differenza di potenziale alle estremità delcapillare genera un passaggio di corrente (dell’ordine dei mA), lasoluzione elettrolitica in esso contenuta si riscalda per effetto Joule.

L’energia dissipata sotto forma di calore è data dalla relazione:

Energiaterm = V I t

L’aumento del potenziale applicatoalle estremità del capillaredetermina, quindi: un incremento dell’efficienza e

della risoluzionema anche: un aumento della temperatura

dell’elettrolita e, con essa, delladiffusione longitudinale.

A parità di campo elettrico applicato e dicarica (+1 nel caso del grafico) l’impiegodi capillari di raggio interno crescente fainnalzare la temperatura della pareteinterna.

L’effetto è tanto più marcato quantomaggiore è il campo elettrico (C > B > A).

L’aumento della temperatura favorisce ladiffusione longitudinale e, diconseguenza, incrementa l’altezza dipiatto teorico rispetto al valore,costante, che essa avrebbe se non vifosse l’effetto Joule, valore indicato,per i vari campi elettrici, da una linea conpunti e trattini.

L’aumento del campo elettrico determina inizialmente un aumento diefficienza, ossia una diminuzione di H, ma a valori elevati provoca un effettoJoule così significativo da invertire la tendenza (le linee punteggiate indicanola situazione che si avrebbe se l’effetto Joule fosse assente).

m/s 10 66.5Eμ v -4eoeo x s109.2t 2

m

Effetto del pH sulle separazioni CE

L’effetto del pH su una separazione CE deriva principalmente dalla suainfluenza sulla mobilità elettroosmotica.

Si consideri un caso specifico in cui:meo = 1.3 × 10-8 m2/V s a pH 2 e 8.1 × 10-8 m2/V s a pH 12;

Ld = 52 cm, Lt = 62 cm

Per un campo elettrico pari a circa 4.3 × 104 V/m è possibile calcolare itempi di migrazione di un analita neutro (per il quale la mobilità èpuramente elettrosmotica):

pH 2

pH 12 m/s 10 53.3Eμ v -3eoeo x s101.5t 2

m

Il pH può influenzare anche la distribuzione delle forme cariche e neutredell’analita e quindi la mobilità totale osservata:

L’aumento del pH porterà inevitabilmente ad un aumento della caricanegativa media nel caso di acidi deboli, con conseguente aumento dellaloro mobilità elettroforetica (che in questo caso è opposta a quellaelettrosmotica).

Scelta del tampone per una separazione CE

La scelta del tampone è determinante per la qualità di una separazioneelettroforetica capillare.

Le caratteristiche fondamentali di un tampone per CE sono:

elevataconcentrazione(25-200 mM)per migliorare lafocalizzazionedelle bande

elevato potere tampone, per evitare fluttuazioni di pH nel mezzo dimigrazione;

basso assorbimento UV, essendo l’assorbimento della radiazione UV (ovisibile) il metodo di rivelazione più usato per gli analiti;

basso adsorbimento delle specie costituenti il tampone sulle paretiinterne del capillare;

basso costo ed elevata disponibilità

Anche la conducibilitàelettrica del tampone vaadeguatamentecontrollata per evitareeffetti sulla forma deipicchi elettroforetici(elettrodispersione):

Se la conducibilità del campione è superiore a quella del tampone (pannelli ain figura) il campo elettrico E sarà inferiore in corrispondenza della bandadel campione e la discontinuità del potenziale V creerà un accumulotransitorio delle cariche migranti sul confine posteriore della banda(fronting). L’inverso (tailing) avverrà se la conducibilità del campione èinferiore (pannelli c).

tailingfronting

tempo tempo tempo

fronting

tailing

Poiché specie aventi un’elevata mobilità elettroforetica dovrebbero anchegarantire alla propria banda una conducibilità elettrica elevata spesso siosserva il fenomeno del fronting sulle prime bande dell’elettroferogramma equello del tailing sulle bande che arrivano al detector più tardi: