Additivi introdotti nei tamponi per CE

Vari tipi di additivi vengono comunemente introdotti nei tamponiimpiegati in CE:

Solventi organici (metanolo, acetonitrile, glicole etilenico)

Ostacolano la dissociazione dei gruppi silanolici sulla parete interna delcapillare, riducendo il potenziale z, e aumentano la viscosità. Nelcomplesso riducono il flusso elettrosmotico (EOF).

Tensioattivi (sali di ammonioquaternari come CTAB)

Si adsorbono sulle pareti delcapillare mediante interazioniidrofobiche o ioniche,influenzando l’EOF: quelli anionicilo incrementano, quelli cationici loriducono o possono addiritturainvertirlo.

Polimeri idrofili neutri (metil-cellulosa, polivinilalcool, poliacrilammide)

Si adsorbono sulle pareti del capillare aumentando la viscositàall’interfaccia soluzione-superficie e riducendo così l’EOF.

Altri additivi organici

Diammine (2HN-(CH2)3-NH2) modificatori di EOF o di carica

Urea solubilizzante/denaturante per le proteine

Acidi alchil-solfonici agenti per l’accoppiamento ionico

Ciclodestrine/eteri corona – sono particolarmente importanti perchéconsentono di ottenere una selettività nei confronti di analitienantiomerici.

cavità idrofoba

parete idrofila

(+) 18C6H4 (-) 18C6H4

Esempio: separazione dei due enantiomeri del farmaco esobarbital medianteelettroforesi capillare in presenza di ciclodestrine (CD).

Esempio: separazione CE dei due enantiomeri di miscele racemiche dei compostinorepinefrina edepinefrina in presenza di ciclodestrine:

Sililazione dei gruppi Si-OH (Si-O-Si-R)

Si basa sulle stesse reazioni impiegate per preparare colonnecromatografiche a fase legata o per l’end-capping.I gruppi laterali tipici sono: oligo-acrilammide, pentafluorofenile

Accoppiamento Si-C con reattivi di Grignard

E’ più stabile a valori di pH estremi. Di solito si legano al silicio oligomeridi acrilammide.

Adsorbimento di polimeri idrofilici

Si impiegano cellulosa, polivinilalcool, polietilenglicole, che creano sullaparete del capillare uno strato superficiale in grado di impedirel’adsorbimento di molecole di analita.

Modificazioni permanenti dei capillari per CE

Classificazione delle principali tecniche di elettroforesi capillare (CE) in base al meccanismo di separazione

Cromatografia Capillare Elettrocinetica Micellare

(MECC o MEKC)

Elettroforesi Capillare in Gel (GCE)

Elettroforesi Capillare Zonale (CZE)

ElettroCromatografia Capillare (ECC)

CE

Elettroforesi Capillare Zonale (CZE)

E’ la tecnica di base per l’elettroforesi capillare (infatti viene spessoindicata semplicemente con l’acronimo CE), più largamente impiegata in virtùdella sua semplicità. Ha l’inconveniente di non poter separare le specieneutre, che si spostano tutte indistintamente, spinte dal flussoelettroosmotico.

Separazione di anioni inorganici mediante CZE

Elettroforesi Capillare in Gel (GCE)

La CGE è l’adattamento della tipica separazione elettroforetica su gel alformato capillare.

Al posto del tampone impiegato in CZE si adopera un mezzo polimericogelatinoso, più o meno reticolato, a seconda dei casi, ad esempio:poliacrilammide non reticolata, derivati della cellulosa, gel di agarosio,polietilenglicole.

Vantaggi della GCE

Anche se poco (o per nulla) reticolato il mezzo polimerico gelatinoso ècomunque in grado di determinare una diversa migrazione anche framolecole neutre, in particolare molecole di grandi dimensioni, trainate dalflusso elettrosmotico presente, seppure basso.Nel caso di molecole di grandi dimensioni e ad elevata carica (proteine,oligonucleotidi), si opta per un mezzo polimerico molto reticolato, cheannulla il flusso elettrosmotico e amplifica l'effetto delle dimensioni deglianaliti sulla loro velocità di migrazione, oltre a tenere basso il flussoelettroforetico.

In entrambi i casi, dunque, la velocità del trasporto degli analiti è bassa; ciò,unito alla riduzione dell'adsorbimento di analita alle pareti del capillare,porta ad un aumento di efficienza separativa.

Il riscaldamento per effetto Joule è molto inferiore rispetto alla gelelettroforesi convenzionale; ciò consente di applicare campi elettricimaggiori, migliorando la separazione.

La CGE viene comunemente impiegata nella separazione di proteine eoligonucleotidi.

E’ possibile realizzare curve di taratura per stimare la lunghezza di unoligonucleotide, in termini di numero di paia di basi (bp), a partire daitempi di migrazione CGE.

Cromatografia Capillare Elettrocinetica Micellare (MECC o MEKC)

La MECC è una variante dell’elettroforesicapillare zonale in cui si introduce neltampone una quantità di tensioattivo taleda superare la concentrazione criticamicellare (CMC), portando così allaformazione di micelle:

Tipicamente si adoperano i seguenti tensioattivi:

Sodio dodecil solfato (SDS), che dà origine a micelle con le testesolforiche, cariche negativamente, rivolte all’esterno;sali di alchil ammonio (CTAB, DTAB), che generano micelle con caricapositiva;zwitterionici, in cui la natura della carica dipende dal pH.

tensioattivo molecola neutra micella

EOF

Ano

do C

ato

do

Le micelle rappresentano una fase pseudo-stazionaria, perché gli analitineutri possono ripartirsi fra la fase acquosa elettroforetica e la faseapolare interna delle micelle. Tale ripartizione modifica i tempi dimigrazione, a seconda dell’analita, favorendo la separazione di analitineutri:

EOF

Ano

do C

ato

do

Se le micelle hanno caricanegativa gli analiti con lamaggiore tendenza a ripartirsial loro interno verrannorallentati (rispetto all’EOF).

Se le micelle hanno caricapositiva gli analiti con lamaggiore tendenza a ripartirsial loro interno verrannoaccelerati.

++

+

+

++

+

+

+ +

+

+

++

++

Applicazione della MECC con SDS alla separazione elettroforeticacapillare di alcoli idrossi-benzilici e fenoli variamente sostituiti:

ElettroCromatografia Capillare (CEC)

La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC.Rispetto alla tipica CZE il capillare è infatti impaccato con una fasestazionaria tipica per l’HPLC in fase inversa (C18, C8, ecc.):

La presenza anche digruppi silanolici non legatialla fase stazionaria sullasuperficie delle particelledi impaccamento sitraduce in un forteincremento del flussoelettrosmotico rispettoall’elettroforesi capillareconvenzionale.

Poiché il flusso elettrosmotico ha un profilo piatto, non parabolico,l’allargamento di banda è decisamente inferiore rispetto all’HPLC e quindil’efficienza molto superiore, anche se inferiore rispetto a quella della CZE, acausa della presenza dell’impaccamento.

Esempio di applicazione della CEC

A fronte della diminuzione di efficienza rispetto alla CZEl’elettrocromatografia capillare consente di sfruttare le interazionispecifiche fra gli analiti e la fase stazionaria, aumentando la selettivitàsoprattutto per le specie neutre.

parabene = para-idrossi-benzoato

Metodi di iniezione del campione in CE

L’introduzione del campione è uno stadio molto critico nell’elettroforesicapillare.La banda introdotta dev’essere stretta per non generare eccessiviallargamenti durante la separazione e quindi un peggioramento dellarisoluzione.

Tipicamente si usano larghezze di banda corrispondenti all’1-2 % dellalunghezza del capillare.

Esistono due diverse tecniche di iniezione:

Idrodinamica Elettrocinetica

Iniezione idrodinamica

In questa tecnica una delleestremità del capillareelettroforetico viene immersanel contenitore del campione,l’altra resta immersa nelcontenitore dell’elettrolita.

Un volume di campione vienespinto nel capillare da unadifferenza di pressione.

Esso è dato dall’equazione di Hagen-Poiseuille:

DP è la differenza di pressione provocata (in mbar)

d è il diametro interno del capillare (in mm)

t è il tempo di iniezione

h è la viscosità della soluzione

Lt è la lunghezza totale del capillare

Iniezione elettrocinetica

In questo caso si applica per un brevetempo un voltaggio agli elettrodidell’apparato CE, dopo aver immersouna delle estremità del capillare nelrecipiente contenente il campione.

Gli analiti migreranno in virtù delle loromobilità, entrando nel capillare.

La quantità Qi di analita introdotta è data dall’equazione:

vapp è la velocità apparente dell’analitat è il tempo di iniezioner è il raggio interno del capillareCi è la concentrazione dell’analitakb/ka è il rapporto fra le conducibilitàdell’elettrolita e del campione.

Preconcentrazione del campione durante un’iniezione elettrocinetica

In generale:

l’iniezione idrodinamica è più riproducibile e soprattutto non dipendentedalle conducibilità di analita e tampone;

l’iniezione elettrocinetica ha il vantaggio di poter preconcentrare ilcampione.

Se il campione ha unaconducibilità inferiore aquella del tampone che loprecede e che lo segue nelcapillare, l’applicazione diuna differenza dipotenziale genererà uncampo elettrico maggiorenella banda del campione:

campione in tampone

campione in acqua

Gli ioni-analita (nell’esempio anioni, colorati in giallo per distinguerli daglianioni del tampone) tenderanno a migrare verso l’interfaccia con il tamponeposta nel verso della migrazione, dove verranno preconcentrati (fenomenodetto stacking):

Il fenomeno di stackingdetermina un restringimento dellabanda e quindi, a parità diquantità di analita iniettato, unincremento dell’altezza del piccoelettroforetico, oltre ad undecremento del tempo dimigrazione:

Rivelatori in CE

Assorbimento di radiazione UV-Visibile

E’ uno dei metodi di rivelazione più largamente usati in CE.

La configurazione tipica prevede lapresenza di un’apertura nelrivestimento di poliimmide (nontrasparente alla radiazione UV) postointorno al capillare di silice.

Il fascio della radiazione incidenteattraversa perpendicolarmente laparete in silice del capillare e ilflusso di analita, raggiungendo poi ilrivelatore.

Il fascio della radiazione dev’essere estremamente focalizzato, datal’esiguità dell’ampiezza della fenditura. Il rivelatore può essere un singolofototubo o fotomoltiplicatore o un DAD (Diode Array Detector).

Nella configurazione indiretta si adoperaun tampone con un’elevata assorbanza allalunghezza d’onda di lavoro.Il passaggio dell’analita determinerà inquesto caso un picco verso il basso, perchéesso avrà un’assorbanza inferiore rispettoal tampone.

Nel caso di campioni moltodiluiti è possibileamplificare l’assorbanzaaumentando il camminoottico attraverso la bandadi analita.Si può infatti rivestire lasuperficie interna delcapillare con un materialeriflettente (argento),provocando riflessionimultiple della radiazione.

Radiazioneincidente

Poliimmide

Argento

Capillare

Rivelatore

Silice

Fluorescenza indotta da laser (LIF)

L’approccio più adottato per larivelazione in fluorescenza in CEsi basa sulla fluorescenza indottada laser (LIF).La radiazione emessa dal laserviene convogliata da una fibraottica sulla finestra diosservazione ricavata sulla paretedel capillare.

La radiazione fluorescente viene raccolta inquesto caso da uno specchio ellissoidale sottoun angolo compreso fra 160 e 200° rispettoalla direzione di incidenza, escludendo peròquella emessa intorno a 180°, che sisovrappone alla direzione della radiazionetrasmessa.Un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o un DADrivelano la radiazione fluorescente.

160°

200°

La rivelazione LIF è la più sensibile fra quelle in uso attualmente inaccoppiamento all’elettroforesi capillare, anche se è decisamente piùcostosa rispetto alla fluorescenza convenzionale.

Esempi di applicazione

Separazione CZE-LIF di Riboflavina (Vitamina B2) (RF), Flavina-mono-nucleotide (FMN) e Flavina-adenina-dinucleotide (FAD)

O

O

HOOH

OH1

2

3 4

56

7

98

10

1' 2'

3'4'

5'

N

NN

NH

O X FMN X= PO32-

FAD

X=

RF X = H

ON

N

N

N

NH2

OHOH

O PO

O

O

P

O

O

- -

Tim e /m in

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Flu

ores

cenc

e /a

.u.

0.00

0.02

0.04

0.06

a

c

RF

b

(c) VINO ROSSO

(b) VINO ROSATO

(a) VINO BIANCO

Tim e / m in

0.0 5.0 10.0 15.0

Flu

ores

cenc

e /

a.u.

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

RF

FMN

FAD

I limiti di rivelabilità sono: RF – 50 × 10-18 moli, FAD – 300 × 10-18 moliFMN – 350 × 10-18 moli.

La tecnica è stata applicata con successo all’analisi della riboflavina nei vini(concentrazione 1-2 ppm).

Rivelazione in CE mediante Spettrometria di Massa a Ionizzazione Elettrospray (CE-ESI-MS)

L’accoppiamento dell’elettroforesicapillare con la spettrometria dimassa ad interfaccia elettrosprayrichiede una modificazione rispettoad una tipica interfaccia ESI:

La parte terminale del capillare CE è inserita in un sistema costituito dadue tubi concentrici metallici. Nel più interno scorre un liquido di supportoper l’elettrospray (sheath liquid), in quello più esterno fluisce il gasnebulizzante. Al tubo più interno è applicato il potenziale ESI.Il flusso di liquido uscente dal capillare CE viene aumentato a valorisufficienti a generare lo spray e il potenziale ESI non interferisce conquello applicato al capillare per la separazione elettroforetica.

sheath liquid

gas

MS

Schema dei collegamenti elettrici per l’accoppiamento CE-ESI-MS

Applicazioni dellaCE-MS

Analisi diglicoalcaloidisteroidei in matricialimentari medianteCZE in fase organica

Separazione CZE-ESI-MS di una serie di glicoalcaloidi steroidei in tamponenon acquoso (miscela metanolo-acetonitrile contenente acetato di ammonio)

0

5 0

1 0 0

0

5 0

1 0 0

T i m e / m i n

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 40

5 0

1 0 0

0

5 0

1 0 0 Rel

ativ

e A

bund

ance

0

5 0

1 0 0

8 .0 9 m ins o la n id in e

1 0 .3 1 m in - c h a c o n in e

1 0 .7 1 m in - s o la n in e

1 2 .7 8 m in - to m a t in e

1 0 .6 2 m int o m a t id in e

Elettroferogrammiottenuti visualizzando lecorrenti ionichespecifiche per i diversicomposti (Selective IonMonitoring, SIM)

Vantaggi dell’Elettroforesi Capillare

Rispetto ad altre tecniche separative di uso comune l’elettroforesicapillare presenta una serie di vantaggi:

elevata efficienza separativa (un capillare per CE può contenere fino a105-106 piatti teorici)

elevatissima sensibilità

buona riproducibilità (variabilità inferiore al 5%)

necessità di piccoli volumi di campione (anche dell’ordine del nL)

separazioni relativamente veloci (da 1 a 45 minuti)

possibilità di prevedere la selettività, in base alle mobilità

ampia scelta di modalità operative

costo inferiore rispetto all’HPLC

Separazione per elettroforesicapillare su gel in presenza disodio dodecil solfato (SDS-CGE)di una serie di proteine:

OG: colorante Orange-G (rif.)1) b-lattalbumina (PM 14200 Da)2) Anidrasi carbonica (PM 29000

Da)3) Ovalbumina (PM 45000)4) Albumina di siero bovino (PM

66000)5) Fosforilasi B (PM 97400)6) b-galattosidasi (PM 116000)7) Miosina (PM 205000)

Applicazioni bioanalitiche della CE

Separazione di virus, batteri, cellule eucariotiche

Separazione di tre batteri e del lievito per panificazione (S. cerevisiae)mediante elettroforesi capillare zonale (CZE).Il picco del flusso elettroosmotico (EOF) è ottenuto monitorando l’ossidodi mesitile, (CH3)2C=CHCOCH3, usato come riferimento.