ELETTROFORESI SU GELELETTROFORESI SU GEL

Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessada una miscela complessa

EE’’ una una tecnica fondamentaletecnica fondamentale per:per:

••ll’’analisianalisi (elettroforesi(elettroforesi analiticaanalitica))••la la purificazionepurificazione degli acidi nucleici (elettroforesi degli acidi nucleici (elettroforesi preparativapreparativa))

-- ++

RNA e DNA sono RNA e DNA sono carichi negativamentecarichi negativamente

catodocatodo anodoanodo

Effetto Effetto ““setacciosetaccio”” in un gel uniformein un gel uniforme

--

++

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

LL’’agarosioagarosio èè un un polisaccaridepolisaccaride

costituito da residui alternati di costituito da residui alternati di DD--

galattosgalattosiioo e e 3,63,6--anidroanidro--LL--galattosgalattosiioo..

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

Consente la separazioni di molecole di Consente la separazioni di molecole di

grandigrandi dimensioni: 0.1 dimensioni: 0.1 -- 20 kb20 kb

Concentrazione Concentrazione

di agarosiodi agarosio

RisoluzioneRisoluzione0.8% : 0.5 0.8% : 0.5 –– 20 kb20 kb

2% : 0.1 2% : 0.1 –– 3 kb3 kb

Come si prepara un gel dCome si prepara un gel d’’agarosioagarosio

Alla soluzione dAlla soluzione d’’agarosioagarosiosi aggiunge si aggiunge EtidioEtidio BromuroBromuro((EtBrEtBr))

Si scioglie lSi scioglie l’’agarosioagarosio ininpolvere in una soluzione polvere in una soluzione tampone a 100tampone a 100°°CC

100V 0,2A

tampone elettroforetico

generatore di corrente

Polo +

Polo -

gel di agarosio 1.2%

scatola elettroforetica

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

LoadingLoading dyedye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contienaiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, e glicerolo, Blu di Blu di bromofenolobromofenolo e e Blu di Blu di xilencianoloxilencianolo che migrano nel gel a velocitche migrano nel gel a velocitàà diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

LoadingLoading dyedye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contienaiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, e glicerolo, Blu di Blu di bromofenolobromofenolo e e Blu di Blu di xilencianoloxilencianolo che migrano nel gel a velocitche migrano nel gel a velocitàà diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

LoadingLoading dyedye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contienaiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, e glicerolo, Blu di Blu di bromofenolobromofenolo e e Blu di Blu di xilencianoloxilencianolo che migrano nel gel a velocitche migrano nel gel a velocitàà diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

EtidioEtidio Bromuro (Bromuro (EtBrEtBr))::

colorante fluorescentecolorante fluorescenteassorbe la luce assorbe la luce UVUV a a 300 300 nmnmdando colore giallodando colore giallo--arancioarancio

EE’’ utile sia per utile sia per visualizzarevisualizzare, , sia per sia per quantificarequantificare il il campione: lcampione: l’’intensitintensitàà della della fluorescenza fluorescenza èè, infatti, , infatti, proporzionale alla quantitproporzionale alla quantitààdel campione.del campione.

Per frammenti Per frammenti linearilineari di DNA di DNA e/o RNA e/o RNA la distanza di la distanza di migrazione migrazione èè inversamente inversamente proporzionaleproporzionale alle dimensioni alle dimensioni della molecola (ovvero alla della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi)sua lunghezza in basi)

Conoscendo la distanza di Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso dimensione nota (M) posso ““interpolareinterpolare”” la lunghezza la lunghezza delle molecole A e Bdelle molecole A e B

Dai Geni ai Genomi

-EdiSES-

A = 2.5 A = 2.5 kbkb

B = 6 B = 6 kbkb

Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batteriNon tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici)ci)

Sebbene le due forme abbiano le Sebbene le due forme abbiano le stessestesse dimensioni, esse migreranno dimensioni, esse migreranno in maniera differentein maniera differente

plasmide circolare “rilassato”

nick

plasmidesuperavvolto

migra più lentamente rispetto ad un DNA

lineare o superavvolto della stessa massa

pBR322

pBR322pBR322 pBR322pBR322dopo digestionedopo digestione

plasmide“linearizzato”

Gli acidi nucleici a Gli acidi nucleici a singolo filamentosingolo filamento (come l(come l’’RNA) RNA) tendono a formare tendono a formare complesse strutture secondariecomplesse strutture secondarie, , pertanto la loro pertanto la loro ““corsa elettroforeticacorsa elettroforetica”” èè fortemente fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano.influenzata dal modo in cui si ripiegano.

NB

LL’’RNA prima di essere separato per elettroforesi deveRNA prima di essere separato per elettroforesi deveessere prima essere prima denaturatodenaturato, al fine di mantenere le molecole, al fine di mantenere le molecolein forma in forma linearelineare

NB

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTIDENATURANTI

Agenti denaturanti comunemente usati: Agenti denaturanti comunemente usati: calore, calore, formaldeideformaldeide, , formammideformammide, , ureaurea

SeparazioneSeparazione in gel in gel dd’’agarosioagarosio didi molecolemolecole didi RNARNAin in condizionicondizioni denaturantidenaturanti

28S (3400 nt)

18S (1800 nt)

Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante lPer ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, a corsa nel gel,

ll’’RNA deve essere RNA deve essere denaturatodenaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da , ossia le molecole devono essere liberate sia da

appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intraappaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari.molecolari.

La denaturazione si ottiene La denaturazione si ottiene ““scottandoscottando”” (90(90--9595°°C) il campione e aggiungendo C) il campione e aggiungendo

formaldeideformaldeide al gel. Anche il al gel. Anche il loadingloading dyedye contribuisce alla denaturazione contribuisce alla denaturazione poichpoichèè

contiene contiene formaldeideformaldeide e e formammideformammide..

� Separazione di frammenti minori di 1 kb

� Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)

�� Separazione di frammenti minori di 1 Separazione di frammenti minori di 1 kbkb

�� Permette di separare frammenti che differiscono di Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del una sola base (determinazione della sequenza del DNA)DNA)

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDEPOLIACRILAMMIDE (PAGE)(PAGE)

Formazione di un gel di Formazione di un gel di poliacrilammidepoliacrilammide

acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea

Spessore del gel0,4-1,5 mm

Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene ureache funziona da denaturante.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDEPOLIACRILAMMIDE (PAGE)(PAGE)

Risoluzione: 20 - 1000 nt

Polo +

Polo -

1000V 22 mA

1000V 22 mA

ON

Polo +

Polo -

5.8SL(circa 150 nt)

5S (circa 120 nt)

pre-tRNAs/tRNAs (circa 80 nt)

5.8SS

Separazione di RNA totaleSeparazione di RNA totaledopo PAGE 6%dopo PAGE 6%

1000V 22 mA

RNA RNA circolarecircolare

RIASSUMENDORIASSUMENDO

Acido nucleico Agarosio PAGECondizioni

denaturanti

dsDNA

ssDNA oligo

RNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.)

piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.)

PulsedPulsed fieldfield

gel gel electrophoresiselectrophoresis

(PFGE)(PFGE)

••

L'elettroforesi su gel di L'elettroforesi su gel di agarosioagarosio

èè

utilizzata per utilizzata per separare DNA di 60 separare DNA di 60 kbkb

o di dimensioni inferiori. o di dimensioni inferiori.

L'introduzione della PFGE e le successive L'introduzione della PFGE e le successive varianti introdotte sulla tecnica di base varianti introdotte sulla tecnica di base permettono oggi la separazione di frammenti di permettono oggi la separazione di frammenti di DNA della lunghezza di 2 DNA della lunghezza di 2 kbkb. .

Ciò consente la separazione in elettroforesi di Ciò consente la separazione in elettroforesi di cromosomi interi.cromosomi interi.

•

Il metodo consiste in una elettroforesi su gel di agarosio

nella quale due campi

elettrìci

con differenti angolazioni vengono applicati alternativamente per

periodi di tempo definiti (ad esempío

60s).

•

L'azione del primo campo elettrico causa uno stiramento lungo il piano orizzontale delle molecole avvolte e il loro movimento

all'interno del gel.

•

L'interruzione di questo campo e l'applicazione del secondo campo

elettrico fa sì

che le molecole si muovano nella nuova direzione.

•

Per una molecola lineare a catena lunga esiste una relazione tra il cambiamento conformazionale indotto da un campo elettrico e la lunghezza della molecola stessa

•

le molecole più

piccole si riallineeranno più velocemente nel nuovo campo elettrico e,

quindi, continueranno a muoversi attraverso il gel.

•

Molecole più

grosse, viceversa, impiegheranno più

tempo per allinearsi.

•

In questo modo, variando continuamente la direzione del campo, si separano le molecole più

piccole da quelle più

grandi.

BlottingBlotting di Acidi Nucleici:di Acidi Nucleici:SouthernSouthern e e NorthernNorthern BlotBlot

1.1. ElettroforesiElettroforesi su gelsu gel

2.2. TrasferimentoTrasferimento ((blottingblotting) su membrana) su membrana

3.3. IbridazioneIbridazione con una sonda marcata con una sonda marcata

radioattivamenteradioattivamente

Permettono di studiare:Permettono di studiare:��Struttura ed organizzazione del genomaStruttura ed organizzazione del genoma��Regolazione dellRegolazione dell’’espressione genicaespressione genica

Trasferimento di acidi nucleici(Blotting)

• Southern

• Northern

Schema trasferimento

Schema ibridazione

Metodi di trasferimento

• Capillare

• Elettroblot

carta 3MM

membrana nylon

gel

supporto

}

carta 3MM

tampone

vaschetta

Assemblaggio del blot capillare

- +

tampone

carta 3MM

spugnettegel

membrana nylon

Assemblaggio dell’elettroblot

Analisi di espressione con Northern blot