LA TECNOLOGIA del DNA RICOMBINANTE o CLONAZIONE MOLECOLARE Corso di Biotecnologie 12 Maggio 2008.
Espressione e produzione di proteine da DNA ricombinante...
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Manuela Miuzzo 3 , Fabio Munari 3 , Mattia Vicario 1 , Nadia Cavallarin 1 , Jessica Grigoletto 2 , Dino Paladin 3 and Alessandro Negro 1 Dipt. di Scienze Sperimentali Veterinarie 1 , Dipt. di Farmacologia e Anestesiologia 2 , Università di Padova, DOTT DINO PALADIN 3 Padova. atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaa M R G S H H H H H H G M A S M T G G Q Q atgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccagagcaaatggctacaaatgtg M G R D L Y D D D D K D P E Q M A T N V aactgttccagccctgagcgacacacaagaagttatgattacatggaaggaggggatata N C S S P E R H T R S Y D Y M E G G D I agagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtacctgaggatcgataaaagaggcaaa R V R R L F C R T Q W Y L R I D K R G K gtaaaagggacccaagagatgaagaataattacaatatcatggaaatcaggacagtggca V K G T Q E M K N N Y N I M E I R T V A gttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaattctatcttgcaatgaacaaggaa V G I V A I K G V E S E F Y L A M N K E ggaaaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgtaacttcaaagaactaattctg G K L Y A K K E C N E D C N F K E L I L gaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggggaaatgttt E N H Y N T Y A S A K W T H N G G E M F gttgccttaaatcaaaaggggattcctgtaagaggaaaaaaaacgaagaaagaacaaaaa V A L N Q K G I P V R G K K T K K E Q K acagcccactttcttcctatggcaataacttaa T A H F L P M A I T - Espressione e produzione di proteine da DNA ricombinante di interesse scientifico e biotecnologico STRUTTURA DEL KGF 194 AA, 22.509 Da Singola catena polipeptidica Peptide segnale per la secrezione (N-term) 7 foglietto-beta (C-term) Nessun ponte disolfuro MHKW ILTW ILP TLLYR S C F HIIC LVG TIS LAC NDMTPEQMATNVNC SSPERHTRSY DYMEGGDIRVRRLFC RTQWYLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIK GVES EFYLAMNKEGKLYAKKEC NEDC NFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMF VALNQKGIP VRGKKTKKEQKTAHFLP MAIT PROPRIETA’ KGF Stabilità limitata in soluzione acquosa Ridotta resistenza al calore Sensibile a proteasi di E.coli Soggetto a ossidazione delle cisteine Tossico per i batteri SYDYMEGGDIR VRR LF C R TQWYLR IDKR G KVKGTQEMKNNYNIMEIR TVA VG IVAIKGVESEFYLAMNKEG KLYAKKE C NEDC NF KELILENHYNTYASAK WTHNGGEMFVALNQ KGIPVRG KKT KKEQ KTAHFLPMAIT APPLICAZIONI COMMERCIALI DEL KGF Produzione pelle artificiale nel trattamento di ustioni Riduzione dei danni alle mucose causati dalla cura oncologica (Palifermina) Matrice di affinità per anticoagulanti Riparazione tissutale KGF kDa 24 36 29 24 36 29 A B 1 giorno 0 50000 100000 150000 200000 250000 1 conc. KGF Eu conte 3 giorni 0 50000 100000 150000 200000 250000 1 conc. KGF Eu conte 5 giorni 0 50000 100000 150000 200000 250000 1 conc. KGF Eu conte 10 giorni 0 50000 100000 150000 200000 250000 1 conc. KGF Eu conte Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) è una proteina appartenente alla famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti ed ha il ruolo di maggiore mediatore della proliferazione delle cellule epiteliali. Le sue potenziali applicazioni in campo clinico e farmacologico richiedono grandi quantità di proteina attiva a bassi costi. Il KGF, infatti, può essere impiegato per la riparazione tissutale in numerosi tessuti ed organi, per la produzione di pelle artificiale nel trattamento di grandi ustionati e per la sopravvivenza delle cellule epiteliali delle mucose ai danni causati dalla cura chemioterapica.L’espressione del KGF in forma ricombinante, tuttavia, non porta a rese soddisfacenti tanto da rendere necessario l’uso di anticorpi per la rilevazione della proteina stessa. Le difficoltà nell’espressione derivano dalle caratteristiche di tossicità e instabilità del KGF. A questo scopo è stato creato un vettore di espressione che aumenti i livelli di KGF prodotto in Escherichia coli attraverso l’ottimizzazione dei codoni e per l’espressione si è utilizzato un plasmide (pRSETB) basato sul promotore del fago T7 RNA polimerasi dipendente e la purificazione è stata condotta tramite cromatografia di affinità per ioni metallici. La proteina purificata all’omogeneicità presenta il peso molecolare atteso ed è biologicamente attiva Sistema T7 per l’espressione del KGF in E. coli Vettore di espressione impiegato per E. coli Sequenza nucleotidica ed amminoacidica del KGF umano Ottimizzazione codoni per E.coli Espressione del KGF in E. coli A) Lisato batterico totale B) Western-blot Determinazione del peso molecolare mediante spettroscopia di massa Peso molecolare teorico calcolato 21961.9 KFG purificato dopo colonna Ni 2+ -NTA Determinazione dell’attività biologica. Colture primarie di cheratinociti umani sono state incubate con KGF. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante saggio di incorporazione di BrDU Purificazione per affinità in colonna Ni 2+ -NTA
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Manuela Miuzzo3, Fabio Munari3, Mattia Vicario 1, Nadia Cavallarin1, Jessica Grigoletto2,
Dino Paladin3 and Alessandro Negro1
Dipt. di Scienze Sperimentali Veterinarie1, Dipt. di Farmacologia e Anestesiologia2, Università di Padova, DOTT DINO PALADIN3 Padova.
atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaM R G S H H H H H H G M A S M T G G Q QatgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccagagcaaatggctacaaatgtgM G R D L Y D D D D K D P E Q M A T N VaactgttccagccctgagcgacacacaagaagttatgattacatggaaggaggggatataN C S S P E R H T R S Y D Y M E G G D IagagtgagaagactcttctgtcgaacacagtggtacctgaggatcgataaaagaggcaaaR V R R L F C R T Q W Y L R I D K R G KgtaaaagggacccaagagatgaagaataattacaatatcatggaaatcaggacagtggcaV K G T Q E M K N N Y N I M E I R T V Agttggaattgtggcaatcaaaggggtggaaagtgaattctatcttgcaatgaacaaggaa V G I V A I K G V E S E F Y L A M N K EggaaaactctatgcaaagaaagaatgcaatgaagattgtaacttcaaagaactaattctgG K L Y A K K E C N E D C N F K E L I LgaaaaccattacaacacatatgcatcagctaaatggacacacaacggaggggaaatgtttE N H Y N T Y A S A K W T H N G G E M FgttgccttaaatcaaaaggggattcctgtaagaggaaaaaaaacgaagaaagaacaaaaaV A L N Q K G I P V R G K K T K K E Q Kacagcccactttcttcctatggcaataacttaa
T A H F L P M A I T -
Espressione e produzione di proteine da DNA ricombinante di interesse scientifico e biotecnologico
STRUTTURA DEL KGF
�194 AA, 22.509 Da
�Singola catena polipeptidica
�Peptide segnale per la
secrezione (N-term)
�7 foglietto-beta (C-term)
�Nessun ponte disolfuro
MHKWILTW ILP TLLYRS CFHIICLVGTIS L ACNDMTP EQMATNVNCS S P ERHTRS YDYMEGGDIRVRRLFCRTQW YLRIDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVES EFYLAMNKEGKLYAKKE CNEDCNFKELILENHYNTYAS AKWTHNGGEMFVALNQKGIP VRGKKTKKEQKTAHFLP MAIT
PROPRIETA’ KGF
�Stabilità lim itata in soluzione acquosa
�Ridotta resistenza al calore
�Sensibile a proteasi di E.coli
�Soggetto a ossidazione dellecisteine
�Tossico per i batteri
S YDYME G G DIRVR RLF CRTQ W YLRID KR GKVKG TQ E MKNNYNIME I RT VAVG IVAI KG VE S E F YLAMNKE GKLYA KK ECNE DCNFKE LILE NHYNTYAS A KW THNG G E MF VALNQKG IP VR GKK T KK E QKTAHF LP MAIT
APPLICAZIONI COMMERCIALI DEL KGF
�Produzione pelle artificiale nel trattamento di ustioni
�Riduzione dei danni alle mucose causati dalla cura oncologica (Palifermina)
�Matrice di affinità per anticoagulanti
Riparazione tissutale
KGF
kDa
2 4
3 6
2 92 4
3 6
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A B
1 giorno
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conc. KGF
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conc. KGF
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100000
150000
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250000
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conc. KGF
Eu
co
nte
Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) è una proteina appartenente alla famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti ed ha il ruolo di maggiore mediatore della proliferazione delle cellule epiteliali. Le sue potenziali applicazioni in campo clinico e farmacologico richiedono grandi quantità di proteina attiva a bassi costi. Il KGF, infatti, puòessere impiegato per la riparazione tissutale in numerosi tessuti ed organi, per la produzione di pelle artificiale nel trattamento di grandi ustionati e per la sopravvivenza delle cellule epiteliali delle mucose ai danni causati dalla curachemioterapica.L’espressione del KGF in forma ricombinante, tuttavia, non porta a rese soddisfacenti tanto da rendere necessario l’uso di anticorpi per la rilevazione della proteina stessa. Le difficoltànell’espressione derivano dalle caratteristiche di tossicità e instabilità del KGF.A questo scopo è stato creato un vettore di espressione che aumenti i livelli di KGF prodotto inEscherichia coli attraverso l’ottimizzazione dei codoni e per l’espressione si è utilizzato un plasmide (pRSETB) basato sul promotore del fago T7 RNA polimerasi dipendente e la purificazione èstata condotta tramite cromatografia di affinità per ioni metallici. La proteina purificata all’omogeneicità presenta il peso molecolare atteso ed èbiologicamente attiva
Sistema T7 per l’espressione del KGF in E. coli Vettore di espressione impiegato per E. coli
Sequenza nucleotidica ed amminoacidica del KGF umanoOttimizzazione codoni per E.coli
Espressione del KGF in E. coliA) Lisato batterico totaleB) Western-blot
Determinazione del peso molecolare mediante spettroscopia di massaPeso molecolare teorico calcolato 21961.9KFG purificato dopo colonna Ni 2+-NTA
Determinazione dell’attività biologica.Colture primarie di cheratinociti umani sonostate incubate con KGF. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante saggiodi incorporazione di BrDU
Purificazione per affinitàin colonna Ni 2+-NTA
