ESPRESSIONE GENICA, PROTEINE, ENZIMI

LA MEMBRANA PLASMATICA costituisce  e  delimita  la  superficie  esterna  della  cellula.  

!!IL CITOPLASMA è  contenuto  fra  la  membrana  citoplasmatica  e  il  nucleo.    

            La  porzione  fluida  è  detta  citosol:  al  suo  interno  sono  presenti  vari  

          tipi  di  organuli,  ed  è  la  sede  della  sintesi  proteica

!!IL NUCLEO è  l’organulo  in  cui  è  contenuto  il  DNA  e  in  cui  avviene  la  trascrizione  del    

          mRNA

PRINCIPALI COMPARTIMENTI della CELLULA ANIMALE

LA CELLULA ANIMALE

Reticolo  endoplasmatico  liscio

Mitocondrio

Ribosoma  (polisomi)

Reticolo  endoplasmatico  ruvido  

(RER)

Lisosoma

Endosoma

Apparati  di  Golgi

Perossisoma

Nucleo

L’ESPRESSIONE GENICA

L’ESPRESSIONE GENICA dogma  DNA  -­‐  proteina

GENOMA (DNA)

mRNA

PROTEINE

Nucleo

Citosol

RNA  PolimerasiCodone    Start

Filamento  singolo  mRNA

Sequenza  di  

triplette  

nucleotidiche

Codone    stop

Filamento  di  DNA  

(gene)

Codone    start

Catena  polipeptidica

Interazioni  elettrostatiche

L’ESPRESSIONE GENICA trascrizione  e  traduzione

Complesso  RNA  Polimerasi

Trascrizione

Filamento  antisensoTrascritto  di  mRNA

Filamento  senso

3’

Traduzione

Ribosoma

Legame    

peptidico

Catena    

nascente  polipeptidica

mRNA

tRNA

Amminoacido

Codone-­‐anticodone

Durante  la  trascrizione  il  DNA  viene  usato  come  

stampo  per  la  formazione  dell’RNA  messaggero  

(mRNA)

Durante  la  traduzione,    l’mRNA  dirige  la  sequenza  degli  

amminoacidi  del  polipeptide  che  deve  essere  costruito

LA TRADUZIONE i  ribosomi

Polisomi

Limite  risolutivo  del  microscopio  elettronico:  2  nm

Cristallografia  NMR:  risoluzione  a  livello  atomico    !(Angstrom,  A  =  0.1  nm)

RER

LA SINTESI PROTEICA  ribosoma  -­‐tRNA  -­‐  mRNA  -­‐  polipeptide

Polisoma I  ribosomi  hanno  un  sito  di  legame  per  l’mRNA  e  tre  siti  di  legame  per  il  tRNA.  Quando  un  ribosoma  si  sposta  lungo    

una  molecola  di  mRNA,  il  polipeptide  in  formazione  si  allunga  di  un  amminoacido  alla  volta.  

Molti  ribosomi  sono  associati  e  in  fase  di  traduzione  dello  stesso  mRNA.  L’intero  complesso  di  traduzione  è  detto    

polisoma.  

LA SINTESI PROTEICA  fasi  della  traduzione

1. Inizio L’inizio  è  la  fase  che  mette  insieme  tutti  i  componenti  necessari  alla  traduzione.  Il  codone  di  inizio  è  AUG.  

Ogni  ribosoma  ha  3  siti  di  attacco  per  i  tRNA:    

sito  E  (da  exit),  sito  P  (da  peptide)  e  sito  A  (da  amminoacido).  

Il  primo  tRNA-­‐amminoacido  entra  nel  sito  A  ed  il  legame  peptidico  si  compie  nel  sito  P.

2. Allungamento Ogni  volta  che  un  tRNA-­‐amminoacido  si  aggancia  al    

sito  A,  il  peptide  in  via  di  formazione  sarà    

trasferito  a  questo  tRNA-­‐amminoacido.  

In  seguito  alla  traslocazione  l’mRNA  si  sposta  in  avanti,    

in  modo  che  il  tRNA  che  porta  agganciato  il  peptide  si    

trovi  ora  al  sito  P  del  ribosoma.  Infine,  il  tRNA  usato    

fuoriesce  dal  sito  E.

3. Terminazione Il  processo  di  allungamento  e  traslocazione  si  ripete  più  volte,  con  il  tRNA  usato  che  fuoriesce  dal  sito  E  

mentre  sul  sito  A  si  aggancia  un  nuovo  codone,  pronto  a  ricevere  un  altro  tRNA-­‐amminoacido.  

Quando  il  ribosoma  raggiunge  un  codone  di  terminazione  (STOP),  la  traduzione  si  conclude  con  la  fase    

terminazione,  in  cui  il  polipeptide  viene  rilasciato.  

MODELLINO DI TRADUZIONE codone  e  anticodone

tRNA trasferisce  gli  amminoacidi  che  si  trovano  nel  citoplasma  ai    

ribosomi,  dove  l’mRNA  viene  trasformato  nella  sequenza  di    

amminoacidi  che  corrisponde  a  una  determinata  proteina

Amminoacido

STOP

mRNA

A

U

G

G

A

A

U

A

G

Metionina

Leucina

Traduzione nei ribosomi

NH3

C R (Metionina)

C0

N

C

C0

R (Leucina)

O

H

H

+

-

HNH3

C R (Metionina)

C0

H

+

O -

Catena  polipeptidica

Peptide

H2O

IL CODICE GENETICO gli  amminoacidi

Codone - Amminoacido

La  sequenza  di  nucleotidi  del  DNA  (il  codice  genetico)  

specifica  l’ordine  degli  amminoacidi  di  un  polipeptide.  

!Il  codice  genetico  è  basato  su  una  tripletta  di  basi,  ossia  un  

codone  (contenuto  nel  mRNA),  che  è  una  sequenza  

precisa  di  tre  basi  nucleotidiche  indicate  da  tre  lettere,  per  

esempio  UUU,  e  corrisponde  a  un  amminoacido  

(fenilalanina).  

!Il  codone  di  inizio  (start)  è  AUG  e  codifica  anche  per  

l’amminoacido  metionina  

!Il  codice  genetico  è  degenerato:  più  codini  codificano  per  lo  

stesso  amminoacido  

!Il  codice  genetico  è  universale

Metionina

LE MUTAZIONI  cambiamento  della  funzione  proteica

Mutazione nucleotidica Una  mutazione  genica  è  un  cambiamento  permanente  nella  sequenza  di  basi  del  DNA.    

Le  mutazioni  possono  alterare  l’espressione  genica.

Le  mutazioni  germinali  avvengono  nelle  cellule  sessuali  e  possono  essere  trasmesse  alla  generazione    

successiva  attraverso  la  riproduzione.

Le  mutazioni  somatiche  avvengono  nelle  cellule  del  corpo  e  non  vengono  trasmesse  alla  progenie.

Mutazione germinale

Mutazione somatiche

Mutazione puntiformi Le  mutazioni  puntiformi  rappresentano  il  cambiamento  di  un  singolo  nucleotide  nel  DNA  di  un  gene,  di    

conseguenza  producono  il    cambiamento  in  uno  specifico  codone.

Mutazione di sfasamento Le  mutazioni  di  sfasamento  avvengono  soprattutto  per  inserzione  o  delezione  di  uno  o  più  nucleotidi  nel    

DNA.

Le  mutazioni  sono  spontanee  o  indotte  da  agenti  mutageni,  fissate  della  RNA  Polimerasi  e  trasmesse  dal  mRNA.    

Una  mutazione  in  un  gene  è  rilevante  quando  altera  la  funzione  della  proteina  codificata  dal  gene.  

Le  mutazioni  sono  particolarmente  rilevanti  se  avvengono  nella  porzione  genica  che  codifica  il  domino  catalitico  di  un  enzima

A T A A T C G T A

U A U U A G C A UTirosina    

(proteina  normale)

Codone  STOP    

(proteina  tronca)

Istidina    

(proteina  alterata)

DNA  (gene)

mRNA  (codificante)

LE PROTEINE

LE PROTEINE  struttura  funzionale

Struttura quaternaria dell’emoglobina

Struttura primaria

Struttura secondaria Struttura quaternaria

Gruppo  eme

alfa  elica

alfa  elica

Legame    

idrogenoStruttura terziaria

Struttura Terziaria delle proteine

Interazioni  

idrofobiche

Catena    

polipeptidica

Ponti  disolfuro

Legami  ionici

Legami    

idrogeno

LE PROTEINE  funzione  e  tipologia

Proteine strutturali Sono  fondamentali  per  l’integrità  dei  tessuti,  come  per  esempio  la  cheratina  dei  capelli,  delle  unghie    

e  dello  strato  corneo  della  cute;  il  collagene  e  l’elastina,  che  formano  tessuto  connettivo  

sottocutaneo.

Proteine contrattili

Immunitaria

L’actina  e  la  miosina  sono  le  principali  proteine  contrattili  della  cellula  muscolare;  sono  presenti    

anche  in  tutti  gli  altri  tipi  cellulari  dove  costituiscono  il  citischeletro  (actina)  e  regolano  il  movimento    

degli  organuli  cellulari  e  della  cellula  stessa.

Ormoni Alcuni  ormoni  sono  piccoli  peptidi  secreti  da  cellule  specializzate  e  rilasciati  nel  flusso  sanguino  per  

regolare  a  distanza  l’azione  degli  organi  e  tessuti.  Gli  ormoni  della  crescita  sono  in  genere  peptidi.

Gli  anticorpi  sono  proteine  particolarmente  complesse  in  grado  di  riconoscere,  in  seguito  a  legame,    

selettivo  molecole  (antigeni)  estranei  e  innescare  la  risposta  immunitaria.

Le  proteine  rappresentano  l’aspetto  funzionale  dell’espressione  genica  e  concorrono  a  tutti  i  processi  principali  della  cellula  e    

alla  costituzione  di  tessuti  ed  organi

Enzimi Sono  proteine  estremamente  specializzate  dotate  di  azione  catalitica  (sito  attivo)  che  servono  a    

tutte  le  funzioni  metaboliche  ed  energetiche  della  cellula.  Gli  enzimi  partecipano  alla  sintesi  delle    

nuove  molecole  e  delle  proteine.    Molti  bersagli  farmacologici  sono  enzimi.

LE PROTEINE  saggi  colorimetrici  di  rilevazione

Coomassie Brilliant Blue

Il  colore  del  Blue  di  Coomassie  dipende  dall’acidità  della  soluzione:  a  PH  molto  acidi  (<2)  il  colore  è  rosso  per  passare  al  marrone    

ed  al  blu  a  PH  maggiori.

I  cambiamenti  di  colore  del  Blue  di  Coomassie  sono  dovuti  ai  differenti  stati  di  carica  delle  molecola:  nella  forma  rossa  gli  atomi  di    

azoto  sono  carichi  positivamente;  a  PH  7  la  molecola  assume  una  carica  netta  negativa  e  il  colore  vira  al  blu.

Il  Blue  di  Coomassie  lega  le  proteine  formando  dei  complessi  che  caricano  negativamente  la  molecola  producendo  il  colore  blue.    

In  soluzione,  l’intensità  del  blu  corrisponde  alla  concentrazione  delle  proteine.  

Fenilalanina Tirosina Triptofano

SEPARAZIONE delle PROTEINE  metodi  analitici  

Permette  di  separare  le  proteine  in  soluzione  attraverso  il  passaggio  in  una  matrice  assorbente  (fase    

stazionaria).    

Il  principio  frutta  il  fatto  che  proteine  sciolte  in  un  solvente  che  viene  assorbito  dalla  fase  stazionaria  sono    

separate  in  base  alla  loro  dimensione.

Cromatografia

su strato sottile

Centrifugazione Permette  di  separare  i  vari  componenti  cellulari  in  fase  liquida  grazie  alla  notevole  accelerazione  applicata.    

Le  proteine  rimangono  sciolte  nella  fase  acquosa  mentre  sono  poco  solubili  in  solventi  organici  come  l’etanolo    

o  l’acetone.  Il  principio  si  basa  sul  fatto  che  l’acqua  (carica  negativamente)  mantiene  in  soluzione  le  proteine    

minimizzando  le  interazioni  elettrostatiche.

Le  proteine  vengono  denaturate  e  dotate  di  una  totale  carica  negativa  mediante  l’utilizzo  di  composti    

intercalanti.  In  un  campo  elettrico  applicato  migreranno  verso  il  polo  positivo  esclusivamente  in  base  alla    

lunghezza  della  catena  polipeptidica  (proteine  più  grandi  migreranno  più  lentamente).

Campo

elettroforetico

SEPARAZIONE delle PROTEINE  cromatografia  su  carta

La  cromatografia  è  una  tecnica  semplice  utilizzata  per  la  separazione  di  una  miscela  di  soluti,  sfruttando    

la  differente  velocità  di  spostamento  dei  singoli  soluti  in  seno  ad  un  mezzo  poroso,  sotto  l’azione  di  un  solvente.

La  carta  assorbe  per  capillarità:  il  principio  si  basa  sull’interazione  tra  le  molecole  del  liquido  e  del  solido;  forze  di  adesione  tra    

l'acqua  e  la  cellulosa  della  carta  sono  maggiori  delle  forze  di  coesione  tra  le  molecole  d'acqua  stesse.

Separazione dei pigmenti vegetali

Principio della cromatografia su carta

GLI ENZIMI

GLI ENZIMI  meccanismo  di  azione

Gli  enzimi  rendono  possibile  la  realizzazione  di  molti  processi  cellulari  (come  la  sintesi  di  molecole  e  proteine)  abbassando    

l’energia  di  attivazione  necessaria  al  compimento  di  una  reazione  biochimica

Enzima + SubstratoComplesso enzima-substrato

(cambio conformazionale)Enzima + Prodotto

Sito  attivo

Inibitore allosterico

Inibitore competitivo

Tasca  allosterica

Agonista

LE PROTEINE della BOCCA  l’azione  dell’amilasi

Proteine  batteriche

Enzimi  digestivi

Proteine  della  mucosa  (epiteliali):  cheratina

Immunoglobuline

Cloro

Calcio

Poli-Glucosio

(amilosio)

GlucosioH2O Maltosio

Alfa-Amilasi (glicogenasi)

Acido  dinitrosalicilico

Idrolisi

H2O