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ENZIMI

DI

RESTRIZIONE

La scoperta degli enzimi di restrizione emodificazione

Intorno agli anni ‘50 si notò che talvoltal’introduzione in E. coli di DNA esogeno,proveniente da un diverso ceppo di E.coli, venivarapidamente frammentato in piccoli pezzi(ristretto).Si scoprì, inoltre, l’esistenza in E. coli di sistemidi restrizione/modificazione capaci di metilarespecifiche basi e, contemporaneamente, ditagliare le stesse basi quando non metilate.

Sono enzimi (endonucleasi di restrizione) di originebatterica capaci di tagliare il DNA a doppia elica in

punti specifici, laddove riconoscono una determinatasequenza di basi.

Sono prodotti da diverse specie di batteri per difendersidall’invasione di batteriofagi, riconoscendo e

degradando ogni DNA estraneo.Il DNA endogeno viene modificato (metilazione) dal

batterio stesso in modo da non essere riconosciutodall’enzima di restrizione il quale può agire solo sul

DNA non modificato proveniente da altra fonte:SISTEMA DI RESTRIZIONE E MODIFICAZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

Batterioceppo A

Batteriofagi

Batterioceppo B

Batterio lisato

Batterio vivo

SISTEMA DI RESTRIZIONE EMODIFICAZIONE = SISTEMA DI

PROTEZIONE

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONENel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia ilDNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica.

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Esistono tre classi di enzimi di restrizione: I,II e III.- Gli enzimi di tipo I e III portano le attivitàdi restrizione e di metilazione sulla stessamolecola. Il taglio effettuato non sempre èprevedibile. Per questo motivo non sonoutilizzati in biologia molecolare.- Negli enzimi di classe II, invece, le dueattività sono separate.Centinaia di endonucleasi di tipo II sonocorrentemente utilizzate e commercializzate.

RICONOSCIMENTO DISEQUENZE PALINDROMICHE

Le sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione sonogeneralmente delle PALINDROMI (4, 6 e 8 basi) ovvero sequenze di basi a simmetria binaria: presentano la stessa

sequenza se vengono lette in direzione 5’ 3’

5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’

DA DOVE DERIVA IL NOMEDI UN ENZIMA DI

RESTRIZIONE

Il nome degli enzimi di restrizione si basa sulgenere e sulla specie del batterio dal quale è statoisolato: per es. Eco RI da Escherichia coli, HindIII da Haemophilus influenzae etc.

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche(sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi).

EcoRI E = genere Escherichia co = specie coli G/AATTC R = ceppo RY13 CTTAA/G I = prima endonucleasi isolata

BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens G/GATCC H = ceppo H CCTAG/G I = prima endonucleasi isolata

Gli enzimi di restrizione possono produrre tre tipi di estremità:

•Estremità piatte (blunt ends)

•Estremità coesive (sticky ends) sporgenti al 5’(5’ protruding)

•Estremità coesive (sticky ends) sporgenti al 3’(3’ protruding)

Trovano molteplici applicazioni, oltre che nella routine dilaboratorio, nel clonaggio, nella costruzione di mappe direstrizione (RFLP).

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TIPO DI TAGLIO:Endonucleasi Endonucleasi di restrizionedi restrizioneEnzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specificiEnzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici

Blunt EndsBlunt Ends = = estremità piatteestremità piatte

Endonucleasi Endonucleasi di restrizionedi restrizione

EcoRI non taglierà questa sequenza

QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE?

La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi; seassumiamo che i 4 nucleotidi (A, C, T, G) siano distribuiti a casonelle molecole di DNA:

-per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIAun taglio ogni 256 nucleotidi (44).

-per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi si avrà INMEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (46).

ISOSCHIZOMERI

Sebbene gli enzimi di restrizione isolati siano oltre 1200, lesequenze bersaglio che possono essere tagliate sono moltedi meno (poco più di duecento). E’ evidente che molti enzimiisolati da batteri diversi hanno la stessa specificità disequenza (RICONOSCONO LA STESSA SEQUENZA), sonocioè ISOSCHIZOMERI.

Esempi:HapII Haemophilus aphrophilusHpaII Haemophilus parainfluenzaeMspI Moraxella species

riconoscono e tagliano tutti la stessa sequenza CC|CGGG

SmaI Serratia marcescens CCC | GGG

XmaI Xantomonas malvacearum C | CCGGG riconoscono lastessa sequenza, ma tagliano in modo diverso.

DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sonoadiacenti, possono essere uniti in provetta. I due tratti da unire devono essere tagliati con uno stesso enzima di restrizione.

Le estremità adesive prodotte dallo stesso enzima possonoappaiarsi tra loro.

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

EcoRIG AATTCCTTAA G

G AATTCCTTAA G

GAATTCCTTAAG

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LA DNA LIGASI LEGA COVALENTEMENTEDUE MOLECOLE DI DNA

G AATTCCTTAA G

5’3’

OH P

OHP

5’3’

GCTTAA

OH

P

AATTC G

OH

P

GAATTCCTTAAG

DNA LIGASI

5’3’ 5’

3’

ATP

5’3’

G AATTCCTTAA G

OH

OH

P

P

5’3’ 5’

3’