Enzimi come Biocatalizzatori: pregiudiziEnzimi come Biocatalizzatori: pregiudizi

•• Gli enzimi sono delicatiGli enzimi sono delicati

•• Gli enzimi sono costosiGli enzimi sono costosi

•• Gli enzimi sono attivi solo con i loro substrati naturaliGli enzimi sono attivi solo con i loro substrati naturali

•• Gli enzimi lavorano solo in ambiente naturaleGli enzimi lavorano solo in ambiente naturale

Enzimi come Biocatalizzatori: VantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi

Gli enzimi sono ecoGli enzimi sono eco--compatibilicompatibiliA differenza dei metalli pesanti sono biodegradabili e quindi non tossici A differenza dei metalli pesanti sono biodegradabili e quindi non tossici A differenza dei metalli pesanti sono biodegradabili e quindi non tossici A differenza dei metalli pesanti sono biodegradabili e quindi non tossici per l’ambienteper l’ambiente

Gli enzimi sono catalizzatori efficientiGli enzimi sono catalizzatori efficienti

l à d 1l à d 1 88 11 1010 l d ll l d ll Velocità di reazione 10Velocità di reazione 1088--10101010 volte maggiori delle reazioni non volte maggiori delle reazioni non catalizzate.catalizzate.

Si usano basse quantità di catalizzatore (10Si usano basse quantità di catalizzatore (10--33--1010--44%), per catalizzatori %), per catalizzatori artificiali (0.1artificiali (0.1--1%).1%).

Accelerazione delle reazioni catalizzate da enzimiAccelerazione delle reazioni catalizzate da enzimi

‡‡Più basso è il Più basso è il ∆GG‡‡, più veloce è il processo, più veloce è il processo

Equazione di EyringEquazione di Eyring

Ent lpi di tti i n :Ent lpi di tti i n :

Teoria dello stato di transizioneTeoria dello stato di transizione

Entalpia di attivazione:Entalpia di attivazione:cambi nelle energie di legame e interazioni debolicambi nelle energie di legame e interazioni deboli

Entropia di attivazione:Entropia di attivazione:costi di orientamento dei reagenti (minor disordine), perdita di costi di orientamento dei reagenti (minor disordine), perdita di flessibilità comformazionale, effetti della concentrazione e solventeflessibilità comformazionale, effetti della concentrazione e solvente

L’enzima riesce a ridurre il L’enzima riesce a ridurre il ∆GG‡‡ del processo stabilizzando lo del processo stabilizzando lo stato di transizione del rds e questo accelera la reazione.stato di transizione del rds e questo accelera la reazione.

Questo può essere fatto agendo su entrabi i contributi entalpici Questo può essere fatto agendo su entrabi i contributi entalpici ed entropicied entropici

Cinetiche di Michaelis MentenCinetiche di Michaelis Menten

PrePre--steady state: steady state: enzima, largo eccesso substrato, sistema non all’equilibrioenzima, largo eccesso substrato, sistema non all’equilibrio

SteadySteady--state: state: lente variazioni degli intermedi reattivilente variazioni degli intermedi reattivilente variazioni degli intermedi reattivilente variazioni degli intermedi reattivi

Cinetica di Michaelis MentenCinetica di Michaelis Menten

Elevate concentrazioni di substratoElevate concentrazioni di substrato

Basse concentrazioni di substratoBasse concentrazioni di substratoBasse concentrazioni di substratoBasse concentrazioni di substrato

Relazione tra la kRelazione tra la kcat cat e la ke la kcatcat/K/Kmm

kkcatcat/K/Km m ≤ kk11

Enzimi come Biocatalizzatori: VantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi

Gli enzimi reagiscono in condizioni blande:Gli enzimi reagiscono in condizioni blande:pH=5pH=5--8, T=208, T=20--4040°°C. In questo modo reazioni collaterali (racemizzazioni, C. In questo modo reazioni collaterali (racemizzazioni, pHpH ,, . q m ( m ,. q m ( m ,isomerizzazioni, decomposizioni, riarrangiamenti) vengono minimizzateisomerizzazioni, decomposizioni, riarrangiamenti) vengono minimizzate

Gli enzimi sono compatibili tra loro: Gli enzimi sono compatibili tra loro: Lavorando in condizioni simili possono essere usati in reazioni a cascata Lavorando in condizioni simili possono essere usati in reazioni a cascata ((cascade reactionscascade reactions) che evitano l’accumulo di prodotti instabili o permettono ) che evitano l’accumulo di prodotti instabili o permettono di t i i di ilib idi t i i di ilib i f lif lidi spostare reazioni di equilibriodi spostare reazioni di equilibrio sfavorevolisfavorevoli

Gli enzimi non sono confinati al loro ruolo naturale: Gli enzimi non sono confinati al loro ruolo naturale: Possono avere elevate tolleranze verso il substrato e lavorare in solventi Possono avere elevate tolleranze verso il substrato e lavorare in solventi diversi dall’acqua.diversi dall’acqua.

Enzimi come Biocatalizzatori: VantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi

Gli enzimi catalizzano ampie classi di reazioni:Gli enzimi catalizzano ampie classi di reazioni:In quanto catalizzatori gli enzimi accelerano le reazioni ma non influiscono In quanto catalizzatori gli enzimi accelerano le reazioni ma non influiscono sull’equilibrio termodinamico della reazione Per cui alcune reazioni sull’equilibrio termodinamico della reazione Per cui alcune reazioni sull equilibrio termodinamico della reazione. Per cui alcune reazioni sull equilibrio termodinamico della reazione. Per cui alcune reazioni catalizzare da enzimi possono essere fatte in entrambi i sensicatalizzare da enzimi possono essere fatte in entrambi i sensi

Vi sono enzimi per quasi tutte le reazioni organiche:Vi sono enzimi per quasi tutte le reazioni organiche:

IdrolisiIdrolisi--Sintesi di esteri, ammidi, lattoni, lattami, eteri, anidridi di acidi, Sintesi di esteri, ammidi, lattoni, lattami, eteri, anidridi di acidi, epossidi, e nitrili.epossidi, e nitrili.

OssidazioniOssidazioni--Riduzioni di alcani, alcheni, aromatici, alcoli, aldeidi e chetoni, Riduzioni di alcani, alcheni, aromatici, alcoli, aldeidi e chetoni, solfuri e solfossidi.solfuri e solfossidi.

Alogenazioni e dealogenazioni, alchilazioni e dealchilazioni, carbossilazioni e Alogenazioni e dealogenazioni, alchilazioni e dealchilazioni, carbossilazioni e decarbossilazioni, isomerizzazioni, reazioni aldoliche e addizioni di Michael.decarbossilazioni, isomerizzazioni, reazioni aldoliche e addizioni di Michael.

Classificazione di enzimi (1987Classificazione di enzimi (1987--1999)1999)

NomenclaturaNomenclatura

EC A.B.C.DEC A.B.C.D

EC EC EnzymeEnzyme CommissionCommission

AA: : denota il tipo principale di reazionedenota il tipo principale di reazione

B. B. Denota il sottotipo, indicando il tipo di substrato o di Denota il sottotipo, indicando il tipo di substrato o di l l h fl l h fmolecola che viene trasferitamolecola che viene trasferita

C:C: indica la natura del indica la natura del coco--substratosubstrato

D: D: il numero individuale di enzimail numero individuale di enzima

Enzimi come BiocatalizzatoriEnzimi come Biocatalizzatori

Gli enzimi sono selettivi: Gli enzimi sono selettivi: Ch l tti iCh l tti i i ll l ifi ità i t f i ll l ifi ità i t f

Enzimi come Biocatalizzatori: VantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Vantaggi

Chemoselettivi:Chemoselettivi: grazie alla loro specificità riescono a trasformare un gruppo grazie alla loro specificità riescono a trasformare un gruppo funzionale in presenza di altri che reagiscono in condizioni confrontabili. funzionale in presenza di altri che reagiscono in condizioni confrontabili.

Regioselettivi:Regioselettivi: grazie alla loro struttura tridimensionale vengono riconosciuti grazie alla loro struttura tridimensionale vengono riconosciuti gruppi funzionali situati in posizioni diverse del substrato. gruppi funzionali situati in posizioni diverse del substrato.

Stereoselettivi:Stereoselettivi: Gli enzimi sono molecole chirali enantiopure e quindi sono Gli enzimi sono molecole chirali enantiopure e quindi sono catalizzatori chirali. Possono quindi reagire in maniera diversa con gruppi catalizzatori chirali. Possono quindi reagire in maniera diversa con gruppi enantiotopici producendo molecole chirali con un certo grado di arricchimento enantiotopici producendo molecole chirali con un certo grado di arricchimento p p gp p genantiomerico. enantiomerico.

Enzimi come Biocatalizzatori: SvantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi

Gli enzimi vengono prodotti in una sola forma enantiomerica:Gli enzimi vengono prodotti in una sola forma enantiomerica:

Per via naturale non possono essere preparati enzimi composti da ammino acidi Per via naturale non possono essere preparati enzimi composti da ammino acidi della serie D. Per ottenere l’enantiomero opposto devono essere seguite vie della serie D. Per ottenere l’enantiomero opposto devono essere seguite vie alternative.alternative.

Enzimi come Biocatalizzatori: SvantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi

Gli enzimi richiedono condizioni di reazioni molto specifiche:Gli enzimi richiedono condizioni di reazioni molto specifiche:

Il fatto che gli enzimi lavorino in condizioni blande non ci consente di Il fatto che gli enzimi lavorino in condizioni blande non ci consente di modificare troppo i parametri di reazione (temperatura, pH) per modificare troppo i parametri di reazione (temperatura, pH) per modificare troppo i parametri di reazione (temperatura, pH) per modificare troppo i parametri di reazione (temperatura, pH) per forzare la reazione.forzare la reazione.

Gli enzimi forniscono la massima attività in acqua:Gli enzimi forniscono la massima attività in acqua:

L’acqua, a causa dell’elevata temperatura di ebollizione e la bassa L’acqua, a causa dell’elevata temperatura di ebollizione e la bassa volatilità, non è spesso il miglior solvente per le reazioni organiche. volatilità, non è spesso il miglior solvente per le reazioni organiche. volatilità, non è spesso il miglior solvente per le reazioni organiche. volatilità, non è spesso il miglior solvente per le reazioni organiche. Pochi solventi organici sono solubili con l’acqua.Pochi solventi organici sono solubili con l’acqua.

Gli enzimi possono lavorare in solventi organici, ma la loro attività cala, Gli enzimi possono lavorare in solventi organici, ma la loro attività cala, di solito di almeno un ordine di grandezza.di solito di almeno un ordine di grandezza.

Enzimi come Biocatalizzatori: SvantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi

Gli enzimi richiedono i loro cofattori naturali:Gli enzimi richiedono i loro cofattori naturali:

Mentre gli enzimi si sono Mentre gli enzimi si sono riveltirivelti molto flessibili nell’accettare substrati molto flessibili nell’accettare substrati non naturali, richiedono quasi esclusivamente i loro cofattori naturali. non naturali, richiedono quasi esclusivamente i loro cofattori naturali.

Questi Questi reagenti biologici sono relativamente instabili e troppo costosi reagenti biologici sono relativamente instabili e troppo costosi per essere usati in quantità stechiometriche. Sino ad ora non si sono per essere usati in quantità stechiometriche. Sino ad ora non si sono trovati sostituti sintetici validi.trovati sostituti sintetici validi.

Gli enzimi possono causare allergie:Gli enzimi possono causare allergie:

Devono quindi essere maneggiati con cura, analogamente ai reagenti Devono quindi essere maneggiati con cura, analogamente ai reagenti chimicichimici

Gli enzimi sono proni alla disattivazione:Gli enzimi sono proni alla disattivazione:

Molte reazioni enzimatiche possono essere inibite sia dai reagenti che Molte reazioni enzimatiche possono essere inibite sia dai reagenti che dai prodotti, il che comporta un forte calo di attività a concentrazioni dai prodotti, il che comporta un forte calo di attività a concentrazioni elevate di substrato o prodotto. elevate di substrato o prodotto.

chimici.chimici.

Enzimi come Biocatalizzatori: SvantaggiEnzimi come Biocatalizzatori: Svantaggi

Inibizione: Inibizione: competitiva (C); non competitiva (NC), competitiva (C); non competitiva (NC), incompetitiva (UC)incompetitiva (UC)incompetitiva (UC).incompetitiva (UC).

Grafici di LineweaverGrafici di Lineweaver--BurkBurk

P= prodotto; P= prodotto; S= substratoS= substrato

Inibizione competitiva:Inibizione competitiva: l’inibitore si lega l’inibitore si lega al sito attivo impedendo al substrato di al sito attivo impedendo al substrato di coordinarsi nel modo corretto o di coordinarsi nel modo corretto o di coordinarsi nel modo corretto o di coordinarsi nel modo corretto o di coordinarsi del tutto. coordinarsi del tutto. Km aumenta all’aumentare dell’inibitore; Km aumenta all’aumentare dell’inibitore; Vmax (o kcat) non cambiano. Vmax (o kcat) non cambiano. Aumentando la concentrazione di S Vmax Aumentando la concentrazione di S Vmax può essere raggiuntapuò essere raggiunta

P= prodotto; P= prodotto; S= substratoS= substrato

Inibizione non competitiva:Inibizione non competitiva: l’inibitore si l’inibitore si lega ad un altro sito dell’enzima. Viene lega ad un altro sito dell’enzima. Viene modificata la modificata la VmaxVmax ma non la Km. ma non la Km. La coordinazione dell’inibitore causa per La coordinazione dell’inibitore causa per ppesempio modifiche nella geometria del sito esempio modifiche nella geometria del sito attivoattivo. Possiamo . Possiamo avere coordinazione sia avere coordinazione sia all’enzima che al complesso enzimaall’enzima che al complesso enzima--substratosubstrato

Inibizione incompetitiva:Inibizione incompetitiva: l’inibitore l’inibitore influenza sia la Vmax che la Km. influenza sia la Vmax che la Km. Questo può essere causato da una Questo può essere causato da una preferenziale coordinazione al preferenziale coordinazione al complesso enzimacomplesso enzima--substrato o dalla substrato o dalla m difi i n d ll’ n im t m difi i n d ll’ n im t modificazione dell enzima stesso modificazione dell enzima stesso

L’inibizione non competitiva e la combinazione di diverse inibizioni sono L’inibizione non competitiva e la combinazione di diverse inibizioni sono il problema più serio per l’applicazione sintetica di enzimi perché sono il problema più serio per l’applicazione sintetica di enzimi perché sono il problema più serio per l applicazione sintetica di enzimi, perché sono il problema più serio per l applicazione sintetica di enzimi, perché sono problemi che non possono essere risolti per semplice aumento della problemi che non possono essere risolti per semplice aumento della concentrazione del substrato.concentrazione del substrato.

Enzimi isolati vs celluleEnzimi isolati vs cellule

La forma in cui vogliamo usare un certo enzima La forma in cui vogliamo usare un certo enzima dipende da molti fattori quali:dipende da molti fattori quali:p m f qp m f q

1)1) tipo di reazione, tipo di reazione, 2)2) possibilità di riciclo del cofattore; possibilità di riciclo del cofattore; 3)3) scala in cui si effettua la reazione.scala in cui si effettua la reazione.

Enzimi isolati vs celluleEnzimi isolati vs cellule

Enzimi isolati vs celluleEnzimi isolati vs cellule

EnzymationEnzymation:: biotrasformazionibiotrasformazioni microbiche di substrati complessi microbiche di substrati complessi che utilizzano alcuni o solamente un passaggio sintetico per che utilizzano alcuni o solamente un passaggio sintetico per convertire prodotti non naturali nei prodotti desiderati.convertire prodotti non naturali nei prodotti desiderati.

CoenzimiCoenzimi

Molecole a basso peso molecolare, 15000 Da, piuttosto delicate e Molecole a basso peso molecolare, 15000 Da, piuttosto delicate e decisamente costose per essere usate in quantità stechiometrichedecisamente costose per essere usate in quantità stechiometriche

Devono quindi essere riciclateDevono quindi essere riciclateDevono quindi essere riciclateDevono quindi essere riciclate

Riciclo necessario (+) o non necessario (Riciclo necessario (+) o non necessario (--). ). Riciclo facile (++) o complesso (Riciclo facile (++) o complesso (±))

Fonti di EnzimiFonti di Enzimi

La maggior parte degli enzimi usati nelle biotrasformazioni sono La maggior parte degli enzimi usati nelle biotrasformazioni sono usati nella forma non purificata e quindi sono relativamente usati nella forma non purificata e quindi sono relativamente economici. Il contenuto varia (1economici. Il contenuto varia (1--30%) e la forma non purificata è 30%) e la forma non purificata è

n lm nt più t biln lm nt più t bilgeneralmente più stabile.generalmente più stabile.

Si ottengono:Si ottengono:

•• Industria della detergenza (lipasi e proteasi)Industria della detergenza (lipasi e proteasi)•• Industria alimentare (proteasi e lipasi per la lavorazione della Industria alimentare (proteasi e lipasi per la lavorazione della

carne, formaggio, grassi e olio. Per le fermentazione e la cottura carne, formaggio, grassi e olio. Per le fermentazione e la cottura di dolci e pane vengono usate delle glicosidasidi dolci e pane vengono usate delle glicosidasip g gp g g

•• Isolamento da organi (fegato, reni)Isolamento da organi (fegato, reni)•• Processi di fermentazione da batteri o funghiProcessi di fermentazione da batteri o funghi•• Origine vegetale (piante o frutti) abbastanza rariOrigine vegetale (piante o frutti) abbastanza rari•• Gli enzimi purificati sono molto costosi. Esistono però mezzi di Gli enzimi purificati sono molto costosi. Esistono però mezzi di

purificazione sempre più efficaci ed economici.purificazione sempre più efficaci ed economici...

Reazioni di IdrolisiReazioni di Idrolisi

TrasformazioniTrasformazioni idroliticheidrolitiche didi esteriesteri ee ammidiammidi (proteasi,(proteasi, esterasi,esterasi,lipasi)lipasi)

VantaggiVantaggi:: assenzaassenza didi cofattoricofattori sensibili,sensibili, disponibilitàdisponibilità didi unun largolargogggg ff ,, pp ggnumeronumero didi enzimienzimi nonnon altamentealtamente specificispecifici..

AmpioAmpio utilizzoutilizzo inin sintesisintesi organicaorganica ((22//33 delledelle biotrasformazioni)biotrasformazioni)

M i i tti i ti iM i i tti i ti iMeccanismi e aspetti cineticiMeccanismi e aspetti cinetici

Meccanismo di idrolisi enzimatica di ammidi e esteriMeccanismo di idrolisi enzimatica di ammidi e esteri

Attacco nucleofilo da parte di un gruppo attivo dell’enzima alla gruppo Attacco nucleofilo da parte di un gruppo attivo dell’enzima alla gruppo carbonilico dell’estere o ammide (idrolisi basica)carbonilico dell’estere o ammide (idrolisi basica)

Gruppo attivo: Gruppo attivo: --OHOH (serina) (serina) esterasi di fegato di maiale, lipasi microbicheesterasi di fegato di maiale, lipasi microbiche--COOCOO-- (acido aspartico)(acido aspartico) pepsinapepsina--SHSH (cisteina)(cisteina) papainapapaina

Gruppo attivo: Gruppo attivo: --OHOH (serina) (serina) esterasi di fegato di maiale, lipasi microbicheesterasi di fegato di maiale, lipasi microbiche--COOCOO-- (acido aspartico)(acido aspartico) pepsinapepsina--SHSH (cisteina)(cisteina) papainapapaina

Meccanismo serina idrolasiMeccanismo serina idrolasi

Meccanismo serina idrolasiMeccanismo serina idrolasi

Idrolisi di proteine enzima catalizzataIdrolisi di proteine enzima catalizzata

istidinaistidina serinaserina

Chimotripsina (serina proteasi)Chimotripsina (serina proteasi)

Acido asparticoAcido aspartico

EnzimaEnzima

SubstratoSubstrato

Complesso EnzimaComplesso Enzima--SubstratoSubstrato

Intermedio tetraedricoIntermedio tetraedrico

Nuovo peptide Nuovo peptide NN--terminaleterminale

In ambienti con basse concentrazioni di acqua In ambienti con basse concentrazioni di acqua altri nucleofili competono con l’acqua:altri nucleofili competono con l’acqua:

Acil transfer: reazione di un altro alcol (transAcil transfer: reazione di un altro alcol (trans--esterificazione)esterificazione)Amminolisi: reazione di RNHAmminolisi: reazione di RNH22 (ammide N(ammide N--sostituita)sostituita)Reazione con HReazione con H22OO22 (peracidi RCOOOH)(peracidi RCOOOH)Reazione con HReazione con H22OO22 (peracidi, RCOOOH)(peracidi, RCOOOH)Reazione con tioli (tioesteri) Reazione con tioli (tioesteri) non avvienenon avviene

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)

Si genera un nuovo stereocentro grazie Si genera un nuovo stereocentro grazie alla tautomeria cheto enolicaalla tautomeria cheto enolica

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)

Reagisce preferenzialmente uno dei gruppi enantiotopiciReagisce preferenzialmente uno dei gruppi enantiotopici

Si genera una nuova unità stereogenicaSi genera una nuova unità stereogenica

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)Processo ad uno stadio (diesteri)Processo ad uno stadio (diesteri)

Idrolisi dell diestere dell’acido malonico Idrolisi dell diestere dell’acido malonico α,,α--disostituito ad opera disostituito ad opera dell’dell’α--chimotripsina o dell’esterasi di fegato di maiale (PLE)chimotripsina o dell’esterasi di fegato di maiale (PLE)

La reazione si ferma dopo l’idrolisi del primo gruppo poiché il La reazione si ferma dopo l’idrolisi del primo gruppo poiché il prodotto è fortemente idrato in ambiente acquoso e non viene più prodotto è fortemente idrato in ambiente acquoso e non viene più

accettato dall’idrolasiaccettato dall’idrolasi

Cosa accade se la reazione procede? (seconda idrolisi)Cosa accade se la reazione procede? (seconda idrolisi)

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)Processo a due stadi (diacetato)Processo a due stadi (diacetato)

Il prodotto di monoIl prodotto di mono--idrolisi, monoacetato, è meno polare per cui si ottiene idrolisi, monoacetato, è meno polare per cui si ottiene anche il secondo processo che porta nuovamente ad un prodotto achirale.anche il secondo processo che porta nuovamente ad un prodotto achirale.

La velocità però è inferiore (processo meno favorito) quindi si può La velocità però è inferiore (processo meno favorito) quindi si può recuperare il monoestere chirale ad elevati eerecuperare il monoestere chirale ad elevati ee

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)Composti meso (Composti meso (mesomeso--tricktrick))

Sintesi enzimatica stereoselettiva Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali)(substrati achirali)Composti meso (Composti meso (mesomeso--tricktrick))

Processo a doppio stadio, diacetatoProcesso a doppio stadio, diacetato

Cinetiche processi a singolo stadioCinetiche processi a singolo stadio(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)

SelettivitàSelettività

S= substrati achirale con gruppi enantiotopici S= substrati achirale con gruppi enantiotopici o composto mesoo composto meso

P,Q= prodotti enantiomericiP,Q= prodotti enantiomerici

L’ ee dipende dal rapporto kL’ ee dipende dal rapporto k11/k/k22, che è costante nel corso di tutta la reazione, che è costante nel corso di tutta la reazione

Quindi l’ee non varia al variare della conversione, è costanteQuindi l’ee non varia al variare della conversione, è costante

Cinetiche processi a doppio stadioCinetiche processi a doppio stadio(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)

Il secondo processo è una risoluzione Il secondo processo è una risoluzione cinetica. Solitamente la selettività cinetica. Solitamente la selettività dell’enzima è la stessa, per cui se kdell’enzima è la stessa, per cui se k11>k>k22 kk44sarà maggiore di ksarà maggiore di k sarà maggiore di ksarà maggiore di k33. .

Con la conversione si otterrà un aumento Con la conversione si otterrà un aumento nell’ee del prodotto, mentre la resa in nell’ee del prodotto, mentre la resa in prodotto diminuisceprodotto diminuisce

ConversioneConversione

Cinetiche processi a doppio stadioCinetiche processi a doppio stadio(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)

Resa chimica dipende da:Resa chimica dipende da:

Selettività dipende da:Selettività dipende da:

Per avere alte rese in prodotto [Q+P] Per avere alte rese in prodotto [Q+P]

Per avere alte stereoselezioni in prodotto [P] Per avere alte stereoselezioni in prodotto [P]

Cinetiche processi a doppio stadioCinetiche processi a doppio stadio(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)(reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)

Enzimi come BiocatalizzatoriEnzimi come Biocatalizzatori

PLE pig liver esterase, PPL porcine pancreatic lipasePLE pig liver esterase, PPL porcine pancreatic lipase

Cambiando enzima si ottiene opposta stereoselezione Cambiando enzima si ottiene opposta stereoselezione (ee(eePLEPLE= 42%, ee= 42%, eePPLPPL=89%)=89%)

La risoluzione cinetica aumenta l’eeLa risoluzione cinetica aumenta l’ee

Risoluzione cineticaRisoluzione cinetica

Primo esempio riportato risale al 1903Primo esempio riportato risale al 1903

Nelle Nelle biobio--trasformazionitrasformazioni le risoluzioni cinetiche sono 4 volte più le risoluzioni cinetiche sono 4 volte più frequenti delle trasformazioni frequenti delle trasformazioni stereoselettivestereoselettive

Risoluzione cineticaRisoluzione cinetica

Resa massima teorica: 50%Resa massima teorica: 50%In alcuni casi kIn alcuni casi kSS>>k>>kRR, si trasforma solo uno dei due enantiomeri, si trasforma solo uno dei due enantiomeri

Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih)Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih)Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih)Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih)

Selettività di una risoluzione = E = Enatiomeric Ratio Selettività di una risoluzione = E = Enatiomeric Ratio

EutomeroEutomero: enantiomero con la massima reattività: enantiomero con la massima reattivitàDistomeroDistomero: enantiomero con bassa reattività o indesiderata: enantiomero con bassa reattività o indesiderata

Risoluzione cinetica enzimaticaRisoluzione cinetica enzimatica

Costanti cinetiche sono Costanti cinetiche sono diffi ili d idiffi ili d idifficili da misuraredifficili da misurare

Si preferisce utilizzare Si preferisce utilizzare gli ee e la conversionegli ee e la conversione

Dipendenza del valore di ee contro la conversioneDipendenza del valore di ee contro la conversione

Processo di risoluzione enzimatica a due stadiProcesso di risoluzione enzimatica a due stadi

I stadio: I stadio: la reazione viene la reazione viene bloccata al 40% per il quale il bloccata al 40% per il quale il

d tt h / d tt h / prodotto ha un ee/resa prodotto ha un ee/resa massimizzata (vicini al punto massimizzata (vicini al punto X)X)

II stadio: II stadio: il substrato viene il substrato viene idrolizzato nuovamente fino idrolizzato nuovamente fino ad una conversione ad una conversione complessiva del 60%, con un complessiva del 60%, con un complessiva del 60%, con un complessiva del 60%, con un recupero di reagente ee/resa recupero di reagente ee/resa ottimale. Si sacrifica il 20% ottimale. Si sacrifica il 20% di prodottodi prodotto

Processo di risoluzione enzimatica reversibileProcesso di risoluzione enzimatica reversibile

L’ee del substrato varia ha un profilo diverso rispetto a quello delle L’ee del substrato varia ha un profilo diverso rispetto a quello delle p p qp p qreazioni irreversibili.reazioni irreversibili.Ad alti livelli di conversione la reazione inversa diventa più importante. Ad alti livelli di conversione la reazione inversa diventa più importante. Ovviamente sarà lo stesso enantiomero a reagire preferenzialmente, Ovviamente sarà lo stesso enantiomero a reagire preferenzialmente, portanto ad una diminuzione dell’ ee globale del substrato.portanto ad una diminuzione dell’ ee globale del substrato.

Per cui si deve operare in condizioni in cui la reazione sia irreversibile Per cui si deve operare in condizioni in cui la reazione sia irreversibile (per esempio aumentando la concentrazione del nucleofilo)(per esempio aumentando la concentrazione del nucleofilo)

Risoluzione biocatalitica sequenzialeRisoluzione biocatalitica sequenziale

Il substrato racemo ha due siti di reazione uguali, per cui la reazione Il substrato racemo ha due siti di reazione uguali, per cui la reazione procede due volte con la formazione di un mono estere intermedio procede due volte con la formazione di un mono estere intermedio

In pratica il substrato deve coordinarsi al sito attivo e reagire due volteIn pratica il substrato deve coordinarsi al sito attivo e reagire due volte

Si ottengono selettività molto alteSi ottengono selettività molto alte

Etot rappresenta la selettività che Etot rappresenta la selettività che un singolo processo dovrebbe avere un singolo processo dovrebbe avere per ottenere questi ee per ottenere questi ee

Risoluzione enzimatica sequenziale: idrolisi Risoluzione enzimatica sequenziale: idrolisi -- esterificazioneesterificazione

MeccanismoMeccanismo

L’acetato racemo A e B viene idrolizzato per dare gli alcoli P e Q in un mezzo L’acetato racemo A e B viene idrolizzato per dare gli alcoli P e Q in un mezzo organico contenente il minimo quantitativo di acqua. organico contenente il minimo quantitativo di acqua. Per cui, per azione della stessa lipasi, si ha l’esterificazione degli alcoli P e Q Per cui, per azione della stessa lipasi, si ha l’esterificazione degli alcoli P e Q ad opera dell’acido cicloesanoico presente nella miscela di reazione.ad opera dell’acido cicloesanoico presente nella miscela di reazione.

Il processo avviene quindi due volte con un notevole incremento della Il processo avviene quindi due volte con un notevole incremento della stereoselezione del processostereoselezione del processo

Nel caso specifico si ottiene una Nel caso specifico si ottiene una EEapparenteapparente=400=400 utilizzando processi che hanno utilizzando processi che hanno EE11=8=8 (idrolisi) e (idrolisi) e EE22=97=97 per l’esterificazione di P/Q con l’acido cicloesanoicoper l’esterificazione di P/Q con l’acido cicloesanoico

DeracemizzazioniDeracemizzazioniRisoluzione cinetica: svantaggiRisoluzione cinetica: svantaggi

--Massima resa del 50%. Scarsa importanza dell’enantiomero non volutoMassima resa del 50%. Scarsa importanza dell’enantiomero non voluto--Separazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosaSeparazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosaSeparazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosaSeparazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosa--Eccesso enantiomerico dei prodotti non ottimaleEccesso enantiomerico dei prodotti non ottimale

Per evitare questi svantaggi si possono utilizzare varie strategie:Per evitare questi svantaggi si possono utilizzare varie strategie:

Risoluzione RipetutaRisoluzione RipetutaInversione inInversione in--situsitu

Risoluzione Dinamica Risoluzione Dinamica

Risoluzione RipetutaRisoluzione Ripetuta

L’enantiomero non voluto (distomero), dopo separazione, viene racemizzato L’enantiomero non voluto (distomero), dopo separazione, viene racemizzato e riutilizzato nel successivo ciclo di risoluzione cineticae riutilizzato nel successivo ciclo di risoluzione cinetica

Approccio importante in processi industriali (sistemi in continuo)Approccio importante in processi industriali (sistemi in continuo)

Conversione totale nel prodotto voluto (virtuale)Conversione totale nel prodotto voluto (virtuale)

CicloCiclo Eutomero (%)Eutomero (%) Distomero (%)Distomero (%)1 1 5050 505022 2525 252533 12.512.5 12.512.544 6.256.25 6.256.25

93.7593.75 6.256.25

Rese reali più basse a causa delle condizioni energiche richieste per la racemizzazioneRese reali più basse a causa delle condizioni energiche richieste per la racemizzazione

Uso di racemasiUso di racemasi

Dopo 4 cicli teorica resa del ca 94%Dopo 4 cicli teorica resa del ca 94%

RacemasiRacemasiIn generale riescono a racemizzare:In generale riescono a racemizzare:

--sistemi che contengono stereocentri con un protonesistemi che contengono stereocentri con un protone

--sistemi nei quali il protone è vicino ad un gruppo elettron attrattoresistemi nei quali il protone è vicino ad un gruppo elettron attrattore

α--idrossiidrossiacidi, acidi, H2N COOH

RH

HO COOH

RHammino acidiammino acidi

Classificazione in base ai siti basici nel sito attivoClassificazione in base ai siti basici nel sito attivo

Richiedono il Richiedono il piridossilpiridossil fosfato (PLP) come cofattorefosfato (PLP) come cofattore

Enzimi oneEnzimi one--base (alanina racemasi) base (alanina racemasi)

Racemasi e relativi substratiRacemasi e relativi substrati

Inversione inInversione in--situsitu

Utilizzabile con molecole che contengono un singolo stereocentro.Utilizzabile con molecole che contengono un singolo stereocentro.

A seguito di una risoluzione cinetica il reagente e il prodotto vengono A seguito di una risoluzione cinetica il reagente e il prodotto vengono tt n ti n ll d f m n nti m i h Il nt il p d tt tt n ti n ll d f m n nti m i h Il nt il p d tt ottenuti nelle due forme enantiomeriche. Il reagente o il prodotto, ottenuti nelle due forme enantiomeriche. Il reagente o il prodotto,

opportunamente modificato, viene trasformato mediante un processo opportunamente modificato, viene trasformato mediante un processo stereospecifico, portando ad un derivato del prodotto o del reagente con stereospecifico, portando ad un derivato del prodotto o del reagente con la stessa configurazione assoluta.la stessa configurazione assoluta.

Esempio: idrolisi di esteriEsempio: idrolisi di esteri

In una reazione di idrolisi, l’alcol che si ottiene viene trasformato In una reazione di idrolisi, l’alcol che si ottiene viene trasformato in tosilato o triflato che viene poi idrolizzato con inversione di in tosilato o triflato che viene poi idrolizzato con inversione di configurazione. Nelle stesse condizione l’estere a opposta configurazione. Nelle stesse condizione l’estere a opposta configurazione viene idrolizzato con ritenzione di configurazioneconfigurazione viene idrolizzato con ritenzione di configurazione

Poiché eePoiché eeSS e eee eePP dipendono dalla conversione, dipendono dalla conversione, la conversione deve essere calcolata in funzione del valore di E la conversione deve essere calcolata in funzione del valore di E

(usualmente intorno al 50%)(usualmente intorno al 50%)

Inversione inInversione in--situsitu

Risoluzione Dinamica Risoluzione Dinamica

La risoluzione avviene in condizioni nelle quali il substrato racemizza rapidamente.La risoluzione avviene in condizioni nelle quali il substrato racemizza rapidamente.

Diverse reazioni avvengono contemporaneamente:Diverse reazioni avvengono contemporaneamente:

L’enzima deve avere un’elevata specificità per uno degli enantiomeri (kL’enzima deve avere un’elevata specificità per uno degli enantiomeri (kSS>>k>>kRR o o kkRR>>k>>kSS).).RR SS))

L’idrolisi non catalizzata deve essere trascurabileL’idrolisi non catalizzata deve essere trascurabile

La racemizzazione del substrato deve avvenire a velocità uguali e maggiori della La racemizzazione del substrato deve avvenire a velocità uguali e maggiori della reazione enzimatica (kreazione enzimatica (kracrac

SubSub≥kkRR o ko kSS) ) al fine di consentire concentrazioni al fine di consentire concentrazioni sufficienti di enantiomero buonosufficienti di enantiomero buono

La racemizzazione del prodotto deve essere trascurabileLa racemizzazione del prodotto deve essere trascurabile

Risoluzione DinamicaRisoluzione Dinamica

diminuzione di eediminuzione di eePPa causa delle a causa delle risoluzione cineticarisoluzione cinetica

Risoluzione DinamicaRisoluzione Dinamica

con la risoluzione dinamica si possono ottenere elevati con la risoluzione dinamica si possono ottenere elevati valori di eevalori di eePP solo per elevate stereoselezionisolo per elevate stereoselezioni

E=19 eeE=19 eePP=90%; E=40 ee=90%; E=40 eePP=95%; E=100 ee=95%; E=100 eePP=98%=98%

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

L’idrolisi delle ammidi è naturalmente legato al mondo L’idrolisi delle ammidi è naturalmente legato al mondo dei peptidi e ammino acididei peptidi e ammino acidi

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Ammino acidi più importanti:Ammino acidi più importanti:

Produzione mondiale superiore ai 0.5 milioni di tonellateProduzione mondiale superiore ai 0.5 milioni di tonellate

A id LA id L l t il t i LL li ili i D LD L thi ithi iAcido LAcido L--glutammicoglutammico LL--lisinalisina D,LD,L--methioninamethionina

Prodotti per fermentazione o per via sinteticaProdotti per fermentazione o per via sintetica

AmminoAmmino acidi acidi D e L vengono D e L vengono prodotti con metodi prodotti con metodi enzimaticienzimatici

Mercato globale USA 2004: 4.5 miliardi di USDMercato globale USA 2004: 4.5 miliardi di USD

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Applicazioni Applicazioni amminoammino acidiacidi

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Metodi più importanti per la produzione di ammino acidiMetodi più importanti per la produzione di ammino acidi

Risoluzione di substrati racemi via idrolisi con proteasi, esterasi e Risoluzione di substrati racemi via idrolisi con proteasi, esterasi e lipasi: metodo più usato perché facile ed economico lipasi: metodo più usato perché facile ed economico

Criteri generaliCriteri generali

Generalmente il substrato con configurazione L viene accettato Generalmente il substrato con configurazione L viene accettato dall’enzima e trasformato mentre il D non reagisce e viene recuperato dall’enzima e trasformato mentre il D non reagisce e viene recuperato dal mezzo di reazione.dal mezzo di reazione.Se l’enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere Se l’enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Se l enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere Se l enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere utilizzando opportuni gruppi protettori.utilizzando opportuni gruppi protettori.Con opportuni enzimi (idantoinasi) sono disponibili anche enzimi che Con opportuni enzimi (idantoinasi) sono disponibili anche enzimi che accettano preferenzialmente l’enantiomero D.accettano preferenzialmente l’enantiomero D.

I due enantiomeri si separano agevolmente sfruttando le diverse I due enantiomeri si separano agevolmente sfruttando le diverse caratteristiche del reagente e del prodotto, per esempio solubilità a caratteristiche del reagente e del prodotto, per esempio solubilità a diversi pH. Questo consente la separazione via estrazioni o diversi pH. Questo consente la separazione via estrazioni o cromatografie con resine a scambio ionico.cromatografie con resine a scambio ionico.

Generalmente questi enzimi accettano solo ammino acidi Generalmente questi enzimi accettano solo ammino acidi α--sostituiti sostituiti

Produzione di D e L Produzione di D e L amminoammino acidi con acidi con acilasiacilasi. . Utilizzato per Utilizzato per LL--metioninametionina, , LL--valinavalina, acido L, acido L--αα--amino butirrico, amino butirrico,

DD--fenilfenil alaninaalanina

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Risoluzioni con acilasiRisoluzioni con acilasiIdrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Risoluzioni con Risoluzioni con idantoinasiidantoinasiUtilizzato per Utilizzato per LL--metioninametionina, , LL--serinaserina, , DD--amminoammino acidi aromatici (acidi aromatici (DD--fenilfenil

glicinaglicina, , pp--idrossiidrossi--DD--fenilglicinafenilglicina))

Idrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Risoluzioni con lattamasiRisoluzioni con lattamasiIdrolisi del legame ammidicoIdrolisi del legame ammidico

Idrolisi di Esteri Idrolisi di Esteri --Criteri generaliCriteri generali

Esistono molte poche esterasi che possono essere utilizzate per Esistono molte poche esterasi che possono essere utilizzate per l’idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sono la l’idrolisi di esteri. Tra queste particolarmente importanti sono la

PLE PLE ((pigpig liverliver esteraseesterase) ) HLEHLE ((horsehorse liverliver esteraseesterase) e la ) e la ACEACE

Idrolisi di esteriIdrolisi di esteri

((p gp g )) (( ))((acetilcolineacetilcoline esteraseesterase) estratta dall’anguilla elettrica. ) estratta dall’anguilla elettrica.

Possono essere anche utilizzare le cellule microbiche, ma questo limita Possono essere anche utilizzare le cellule microbiche, ma questo limita la variazione delle condizioni di reazione. Ampi screening per la variazione delle condizioni di reazione. Ampi screening per individuare nuove esterasi e per esprimerle in microorganismi ospiti individuare nuove esterasi e per esprimerle in microorganismi ospiti sono in corsosono in corso

F t t t t i i tili h l F t t t t i i tili h l Fortunatamente per queste reazioni possono essere utilizzare anche le Fortunatamente per queste reazioni possono essere utilizzare anche le proteasiproteasi. Le più utilizzate sono la . Le più utilizzate sono la α--chimotripsinachimotripsina e la e la subtilisinasubtilisina. . Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la Vengono anche utilizzate, anche se in modo minore, la tripsinatripsina, , pepsinapepsina, , papainapapaina e la e la penicillina penicillina acilasiacilasiIn generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configurazione In generale vengono idrolizzati gli esteri che mimano la configurazione di un amminoacido Ldi un amminoacido L

Substrato tipo per esterasi e proteasiSubstrato tipo per esterasi e proteasiIdrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Idrolisi di esteriIdrolisi di esteri

Idrolisi di Esteri Idrolisi di Esteri ––Regole generaliRegole generali

Per entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegato Per entrambi i tipi di esteri lo stereocentro deve essere collegato il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un il più possibile vicino al centro reattivo per assicurare un riconoscimento chirale massimo.riconoscimento chirale massimo.I gruppi RI gruppi R11 e Re R22 possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi possono essere gruppi arilici o alchilici o sistemi ciclici, ma la loro differenziazione sterica deve essere ciclici, ma la loro differenziazione sterica deve essere massimizzata. massimizzata. Non devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONHNon devono essere presenti gruppi carichi o polari (COOH, CONH22, , NHNH22) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui ) che sono fortemente idratati in ambiente acquoso. Per cui devono essere opportunamente protetti.devono essere opportunamente protetti.P b d l f l l P b d l f l l 33 d l ù d l ù Per i substrati di tipo I la funzione alcolica RPer i substrati di tipo I la funzione alcolica R33 deve essere la più deve essere la più piccola possibile (Me, Et). Questo vale anche per quelli di tipo II piccola possibile (Me, Et). Questo vale anche per quelli di tipo II (acetati o propionati). (acetati o propionati). In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo In tutti i casi deve essere presente un protone legato allo stereocentro.stereocentro.

Principali usi degli enzimi nelle Principali usi degli enzimi nelle biotrasformazionibiotrasformazioni

Principali enzimi usati nelle Principali enzimi usati nelle biotrasformazionibiotrasformazioni

LipasiLipasiLe lipasi sono enzimi che idrolizzano trigliceridi nei corrispondenti Le lipasi sono enzimi che idrolizzano trigliceridi nei corrispondenti acidi grassi e glicerolo. acidi grassi e glicerolo. Giocano un importante ruolo nelle biotecnologie poiché vengono Giocano un importante ruolo nelle biotecnologie poiché vengono utilizzati in processi alimentari e per la preparazione di intermedi utilizzati in processi alimentari e per la preparazione di intermedi chirali Più del 35% delle biochirali Più del 35% delle bio--trasformazioni vengono effettuate con trasformazioni vengono effettuate con

LipasiLipasi

chirali. Più del 35% delle biochirali. Più del 35% delle bio--trasformazioni vengono effettuate con trasformazioni vengono effettuate con lipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi più studiati. lipasi e per questo le lipasi sono gli enzimi più studiati.

Sono state clonate più di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di Sono state clonate più di 30 lipasi e sono state risolte le strutture di 12 lipasi. 12 lipasi.

Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni esteree è differente da Il meccanismo con cui idrolizzano funzioni esteree è differente da quello delle esterasiquello delle esterasi

LipasiLipasi

Lipasi e Esterasi: cineticheLipasi e Esterasi: cinetiche

Differente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzima non mostra Differente interazione fisico chimica con il substrato: l’enzima non mostra attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma attività finché il substrato è sciolto nel solvente in forma monomericamonomerica. . Quando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda fase Quando la concentrazione aumenta tanto da formare una seconda fase ((lipofilicalipofilica), si ottiene un brusco innalzamento della reattività. ), si ottiene un brusco innalzamento della reattività.

Attivazione all’interfaccia:Attivazione all’interfaccia:origina dal fatto che il origina dal fatto che il sistema diventa attivo solo sistema diventa attivo solo quanto la concentrazione quanto la concentrazione del substrato raggiunge la del substrato raggiunge la del substrato raggiunge la del substrato raggiunge la CMC (concentrazione CMC (concentrazione micellare critica)micellare critica)

Attivazione all’interfaccia:Attivazione all’interfaccia: la spiegazione a livello molecolare del la spiegazione a livello molecolare del fenomeno è stato visto derivare da un riarrangiamento fenomeno è stato visto derivare da un riarrangiamento dell’enzima: l’enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua dell’enzima: l’enzima in fase acquosa è inattivo poiché una sua parte copre il sito attivo [Enz].parte copre il sito attivo [Enz].

a contatto con la fasea contatto con la fase--bifasica un piccolo peptide in bifasica un piccolo peptide in α--elica si elica si a contatto con la fasea contatto con la fase--bifasica un piccolo peptide in bifasica un piccolo peptide in α--elica si elica si allontana e allontana e scopre il sito attivo e la lipasi si riarrangia nella forma scopre il sito attivo e la lipasi si riarrangia nella forma attiva [Enz]attiva [Enz]‡‡..Per cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte in Per cui idrolisi catalizzare da lipasi devono essere condotte in mezzi bifasici. mezzi bifasici. Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi Il substrato può essere usato come tale o dissolto in solventi organici immiscibili con l’Horganici immiscibili con l’H22O (esano, etere etilico, toluene).O (esano, etere etilico, toluene).

Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) Fenomeni di trasferimento di massa (per esempio agitazione) influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in influenzano notevolmente la reattività del sistema (rese in prodotto) prodotto)

Per determinare l’attività di una lipasi si utilizzano triacilgliceroli Per determinare l’attività di una lipasi si utilizzano triacilgliceroli quali la trioleina e tributilina mentre per le esterasi si utilizza il quali la trioleina e tributilina mentre per le esterasi si utilizza il pp nitroacetatonitroacetatopp--nitroacetatonitroacetato

OO

O

COCOCO

R

RR

lipasiOHOH

OH+ 3 R-COOH

R= ?????

NO2 O

H2C O

ONO2

esterasiH2C OH

ONO2HO+

CoCo--solventi miscibili con l’acqua attivano le esterasi mentre cosolventi miscibili con l’acqua attivano le esterasi mentre co--solventi immiscibili attivano le lipasisolventi immiscibili attivano le lipasi

Le lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzioni Le lipasi sono sono state maggiormente utilizzate in risoluzioni piuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chirali, piuttosto che con composti meso, e con derivati di alcoli chirali, vista la natura dei substrati naturali vista la natura dei substrati naturali

In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo In generali le stereoselezioni sono più elevate quando lo stereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza di un stereocentro è vicino alla funzione carbossilica e in presenza di un f pf pprotone, (analogamente alle esterasi)protone, (analogamente alle esterasi)

Criteri generaliCriteri generali

Per substrati di tipo III la catena RPer substrati di tipo III la catena R33 deve essere sufficientemente deve essere sufficientemente lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficiente lipofilicità al lunga (3,4 atomi di C) per conferire sufficiente lipofilicità al substrato. D’altro canto catene troppo lunghe portano a substrati con substrato. D’altro canto catene troppo lunghe portano a substrati con punto di ebollizionetroppo alto e alla formazione di schiume e punto di ebollizionetroppo alto e alla formazione di schiume e emulsioni nemulsioni n Butanoati sono normalmente gli esteri prescelti Butanoati sono normalmente gli esteri prescelti emulsioni. nemulsioni. n--Butanoati sono normalmente gli esteri prescelti Butanoati sono normalmente gli esteri prescelti

Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente Usualmente vengono idrolizzati preferibilmente substrati con configurazione R allo stereocentro substrati con configurazione R allo stereocentro alcolico. Molte proteasi (alcolico. Molte proteasi (α--chimistripsina, chimistripsina, subtilisina) mostrano stereoselezioni opposte.subtilisina) mostrano stereoselezioni opposte.Nelle strutture risolte ai raggi x si è osservato Nelle strutture risolte ai raggi x si è osservato che la disposizione della triade catalitica è che la disposizione della triade catalitica è invertita nelle due classi di idrolasi. Questa invertita nelle due classi di idrolasi. Questa potrebbe essere l’origine dell’opposta potrebbe essere l’origine dell’opposta stereoselezione.stereoselezione.

Criteri generaliCriteri generali

Per substrati di tipo IV il residuo RPer substrati di tipo IV il residuo R33 dell’alcol deve essere dell’alcol deve essere preferenzialmente una catena alifatica lunga (npreferenzialmente una catena alifatica lunga (n--butanolo). Per qyesti butanolo). Per qyesti substrati si è osservata una preferenza nell’idrolisi di esteri S.substrati si è osservata una preferenza nell’idrolisi di esteri S.

Criteri generaliCriteri generali

Per substrati di tipo IV il residuo RPer substrati di tipo IV il residuo R33 dell’alcol deve essere dell’alcol deve essere preferenzialmente una catena alifatica lunga (npreferenzialmente una catena alifatica lunga (n--butanolo). Per qyesti butanolo). Per qyesti substrati si è osservata una preferenza nell’idrolisi di esteri S.substrati si è osservata una preferenza nell’idrolisi di esteri S.

Funghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sono Funghi e batteri producono un elevato numero di lipasi. Poiché sono enzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantità su enzimi extracellulari possono venire prodotti in elevate quantità su larga scala. larga scala. Spesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamente Spesso vengono prodotti due isoenzimi (A e B), che sono strettamente correlati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoselezione, ma correlati. Solitamente mostrano la stesso senso di stereoselezione, ma in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. in alcuni casi si notano diversi valori di stereoselezione. Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La loro Estratti di lipasi usualmente contengono entrambe le forme. La loro attività dipende dal quantitativo di enzima presente nella preparazione attività dipende dal quantitativo di enzima presente nella preparazione e anche dal fornitore.e anche dal fornitore.

Source Name

Mammalian

Human Pancreatic LipaseHorse Pancreatic LipasePig Pancreatic Lipase

Guinea Pig Pancreatic Lipase

Rhizomucor meiheiPencillium cambertii

Fungal

Humicola lanuginosaRhizopus oryzaeCandida rugosa

Candida antarctica Lipase A, Lipase B Aspergillus niger

Geotrichium candidum

Chromobacterium viscosum

Bacterial

Chromobacterium viscosumPseudomonas cepacia

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas fluorescens

Pseudomonas fragiBacillus thermocate nulatus

Staphylococcus hyicusStaphylococcus aereus

Brand Name Main Application

Lipopan® Baking industry Lipozyme® Oils and fats industry

Novozym® 27007 Pasta/Noodles

PalataseTM Dairy industry

Clear-LensTM LIPOPersonal care industry

Greasex Leather

LipolaseTM Detergent industry

LipoPrime® Detergent industry

NovoCorTM AD Leather industry

Novozym® 735 Textile industry

Novozym® 871 Pet Food Industry

Requisiti Sterici per le LipasiRequisiti Sterici per le Lipasi

Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base delle Le lipasi più utilizzate possono essere classificate sulla base delle caratteristiche del substrato naturalecaratteristiche del substrato naturale

Lipasi di Pancreas Suino (PPL)Lipasi di Pancreas Suino (PPL)

E’ la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L’estratto crudo E’ la lipasi più economica e quindi più utilizzata. L’estratto crudo contiene una serie di altre idrolasi oltre alla PPL (la forma contiene una serie di altre idrolasi oltre alla PPL (la forma parzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più alto).parzialmente purificata è commerciale ad un prezzo molto più alto).

L’estratto commerciale che contiene L’estratto commerciale che contiene caca 5% di PPL viene chiamato 5% di PPL viene chiamato L estratto commerciale che contiene L estratto commerciale che contiene caca 5% di PPL viene chiamato 5% di PPL viene chiamato pancreatina o steapsina. Contiene anche altre idrolasi (pancreatina o steapsina. Contiene anche altre idrolasi (α--chimotripsinachimotripsina, , colesterolcolesterol esteraseesterase, , carbossipeptidasicarbossipeptidasi B, B, fosfolipasifosfolipasi) ) per cui la reattività osservata può originare dalle diverse specie.per cui la reattività osservata può originare dalle diverse specie.

PPL è particolarmente attiva nell’idrolisi di esteri primari mentre PPL è particolarmente attiva nell’idrolisi di esteri primari mentre α--chimotripsinachimotripsina e e colesterolcolesterol esteraseesterase sia con esteri di alcoli primari che sia con esteri di alcoli primari che secondari.secondari.

Idrolisi asimmetrica di derivati Idrolisi asimmetrica di derivati mesomeso con PPLcon PPLRisultati complementare con l’idrolisi catalizzata da PLERisultati complementare con l’idrolisi catalizzata da PLE

Ee maggiori con modificazioni del substrato Ee maggiori con modificazioni del substrato ––sintesi di prostaglandine carbacicliche sintesi di prostaglandine carbacicliche –– trattamento della trombositrattamento della trombosi

Idrolisi asimmetrica di gliceroli con PPLIdrolisi asimmetrica di gliceroli con PPL1,31,3--propandioli achirali come substrato (fattori stereopropandioli achirali come substrato (fattori stereo--elettronici)elettronici)

Migliori risultati con sistemi bifasiciMigliori risultati con sistemi bifasici

Risoluzione di acetati bicicliciRisoluzione di acetati bicicliciReattività delle diverse idrolasi contenute nel PPLReattività delle diverse idrolasi contenute nel PPL

L’elevata selettività è dovuta ad una nuova idrolasi isolata dal estratto di PPLL’elevata selettività è dovuta ad una nuova idrolasi isolata dal estratto di PPL

Candida sp. LipasiCandida sp. LipasiSono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida.Sono disponibili diverse lipasi da lieviti tipo Candida.

I più utilizzati sono quelli di I più utilizzati sono quelli di Candida lipolitica, C. antartica e C. rugosaCandida lipolitica, C. antartica e C. rugosa..

Lipasi di Candida rugosaLipasi di Candida rugosaSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari cicliciSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari cicliciSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari cicliciSono principalmente attivi con esteri di alcoli secondari ciclici

+ veloce+ veloce

Modello del Substrato per Lipasi di C. RugosaModello del Substrato per Lipasi di C. Rugosa

L’estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività con esteri L’estratto di CRL occasionalmente manifesta scarsa selettività con esteri α--sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme isomeriche sostituiti. Questo è attribuibile alla presenza di due forme isomeriche dell’enzima che operano con differenti selettività anche se hanno la dell’enzima che operano con differenti selettività anche se hanno la stessa enantiopreferenzastessa enantiopreferenza

Forma A più selettiva e stabileForma A più selettiva e stabile

Modificazioni non covalenti di Lipasi di C. RugosaModificazioni non covalenti di Lipasi di C. Rugosa(trattamento con i(trattamento con i--PrOH)PrOH)

Il semplice trattamento con iIl semplice trattamento con i--PrOH acquoso (50%) porta ad una lipasi PrOH acquoso (50%) porta ad una lipasi modificata che mostra un considerevole aumento di attività e modificata che mostra un considerevole aumento di attività e

stereoselezionestereoselezione

Lipasi di Candida antarticaLipasi di Candida antartica

Questi enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno screening Questi enzimi sono stati trovati in Antartico nel corso di uno screening effettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreme da effettuato per ottenere lipasi che operassero in condizioni estreme da usare in formulazioni per la detergenzausare in formulazioni per la detergenzaf p gf p g

I due isoenzimi sono abbastanza diversi: I due isoenzimi sono abbastanza diversi:

isoenzima A: Caisoenzima A: Ca2+2+ dipendente, termostabile, molto stabile con trigliceridi dipendente, termostabile, molto stabile con trigliceridi in modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali.in modo non specifico, non molto utile per sistemi non naturali.

isoenzima B: non è Caisoenzima B: non è Ca2+2+ dipendente, meno termostabile, attivo con un dipendente, meno termostabile, attivo con un largo numero di substrati non naturali.largo numero di substrati non naturali.

Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Entranbi sono stati clonati e sovraespressi in Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae e sono e sono disponibili in larghe quantitàdisponibili in larghe quantità

Tipici substrati per lipasi di Candida antarticaTipici substrati per lipasi di Candida antartica

Meccanismo di Reazione della CALBMeccanismo di Reazione della CALB

Meccanismo di Racemizzazione di alcoli ad opera di complessi di Meccanismo di Racemizzazione di alcoli ad opera di complessi di RuRu