Enzimi: catalizzatori biologiciEnzimi: catalizzatori biologici

• praticamente tutte le reazioni biochimiche della chimica della vita sono catalizzate da enzimi

• gli enzimi sono proteine

• la velocità di reazioni enzimatiche è aumentata di fattori 106-1012

rispetto alle stesse reazioni non catalizzate

• le condizioni biologiche di reazione sono moderate: T<100 oC, Patm, pH ≅ 7 , soluzioni acquose

• gli enzimi hanno un elevatissimo grado di specificità

• l’attività degli enzimi è regolata

Energia libera di Gibbs

Nei sistemi biologici∆V è molto piccolo

spontaneo

non spontaneo

equilibrio

∆Ssistema+ ∆Suniverso > 0

spontaneo

∆G positivo

∆G negativo

∆G=0

Il ∆G di una reazione dipende solo dalla differenza di energia libera dei prodotti (stato finale) e dei reagenti (stato iniziale)

è lo stesso

La VELOCITA’ della reazione non è prevedibile in base al ∆G

Teoria della velocità di reazione o dello stato di transizione

• i reagenti devono incontrarsi (collidere)• i reagenti devono aver sufficiente energia per raggiungere lo stato di transizione• i reagenti devono essere orientati correttamente• nello stato di transizione normalmente, gli angoli di legame e le lunghezze di legame sono distorti verso quelli caratteristici dei prodotti

Effetto della temperatura e di un catalizzatore sulla velocità di reazione

Equazione di Arrhenius:

k = Aexp(-Ea/RT)ln k = lnA -Ea/RT

la velocità dei reazione è proporzionale: alla frequenza degli urti molecolari • alla probabilità che l’urto avvenga con energia sufficiente a far avvenire la reazione

Ea = energia di attivazione

I catalizzatori riducono l’energia di attivazione

CINETICA CHIMICA

La stechiometria di una reazione chimica non specifica il meccanismo della reazione

A P

una reazione è descritta da reazioni elementari

A I1 I2 Pintermedi

Generalmente una reazione avviene in molte tappe (meccanismo)Spesso uno step è il più lento e determina la velocità della reazione

(rate determining step)

A I Pk1 k2

I = intermedio

gli intermedi di reazione non sono gli stati di transizione

Proprietà di un catalizzatore

• è presente in piccole quantità

• non viene alterato dalla reazione

• fa aumentare la velocità di reazione ma non sposta l’equilibrio

• facilita la reazione in entrambi i sensi

• è specifico per la reazione

non catalizzata

catalizzata

coordinata di reazione

aumento della velocità di reazione

I catalizzatori riducono l’energia di attivazione

Fattori responsabili dell’aumento della velocità nella catalisi enzimaticaFattori responsabili dell’aumento della velocità nella catalisi enzimatica

Le reazioni non catalizzate possono essere lente in quanto:

• coinvolgono la formazione di cariche positive e/o negative nello stato di transizione• richiedono spesso che molecole vengano in stretto contatto con concomitante perdita

di entropia

Queste difficoltà vengono superate con gli enzimi:

• le cariche vengono stabilizzate piazzando acidi, basi, ioni metallici, o dipoli che fanno parte della struttura dell’enzima nel sito attivo

• catalisi covalente viene utilizzata per percorrere cammini di reazione a bassa energia

• le perdite di entropia sono minimizzate in quanto i gruppi catalitici sono parte della struttura dell’enzima

• sito attivo

• substrato

• coenzima o cofattore

• velocità di reazione

• attivatore

• inibitore

Definizioni importanti per l’attività e proprietà degli enzimi

Modello chiave-serratura

Adattamento indottol’enzima forza il substrato ad assumere una conformazione simile

allo stato di transizione

L’enzima lega il substrato nel proprio sito attivo

La distorsione indotta può essere localizzata od estesa a gran parte dell’enzima

esochinasiD-glucosio

Le interazioni Enzima-Substrato

• legami a H• forze di van der Waals

•forze elettrostaticheResidui idrofobici

Legami multi-contatto

E + S ES

N.B gli enzimi non si limitanoa posizionare e/o distorcere isubstrati abbassando l’energiadi attivazione, ma promuovonol’evento catalitico utilizzandoresidui “opportunamente posti”

I siti attivi includono generalmente residui anche lontani nellasequenza primaria

Lisozima:enzima che catalizzala reazione di rottura delle pareti cellulari di alcuni batteri

I siti attivi occupano una parte relativamente piccola del volumetotale dell’enzima, che comprende anche siti regolatori, di interazione, canali etc

POCHI PRINCIPI CATALITICI DI BASE SONO USATI DA MOLTI ENZIMI

• Catalisi acido-base

• Catalisi con ioni metallici (elettrofili)

• Catalisi per prossimità (reazioni a più substrati)

• Catalisi covalente

Ex. 1 Trioso-fosfato isomerTrioso-fosfato isomerasiasireazione della glicolisi

sitoattivo

Lys

HisGlu

Il residuo di acido glutammico Glu 165 è essenziale per la funzione enzimatica

Il sito attivo: legame con DHAP

Ansa protettiva

LysHisGlu

L’ enzima in assenza

e in presenza del substrato

Lys-P del substrato Glu- C1 e C2His- C1 e C2

G3P-enzima

Stato di transizione

Intermedio endiolico

Stato di transizione

DHAP-enzima

Reazione

acido-base

catalizzata

concertata

E+G-3P E-G-3PE-G3P E-edE-ed E-DHAPE-DHAP E+DHAP

destabilizzazionedell’enediolo

Proteasi serinicheProteasi serinichela reazione consiste nell’idrolisi di legami peptidici dal lato carbossilico di particolari AA

Asp His Ser sono semprepresenti nel sito attivo

chimotripsina

un residuo di serina gioca un ruolo importantenella catalisi di tipo covalente

L’idrolisi del legame peptidico è termodinamicamente favorita rispetto alla formazione del legame (condensazione ∆G0=+10kJmol-1)

I POLIPEPTIDI SONO MOLECOLE METASTABILI

La formazione del legame avviene con l’utilizzo di ATP, per azione di aminoacil-tRNA-sintetasi che attivano gli AA nel legame con tRNA

1. AA+ATP Amminoacil-AMP + PPi

2. Amminoacil-AMP +tRNA

+ AMPAmminoacil-tRNA tRNA

Il legame peptidico a partire dagli amminoacil-tRNA ètermodinamicamente favorito

chimotripsina: residui del sito attivo

La differenza tra gli enzimi riguarda la “tasca” vicina alla Ser (responsabile della specificità delle proteasi)

• chimostripsina idrolizza i legami la cui porzione carbossilica è un residuo idrofobico (Phe, Leu)• tripsina idrolizza i legami la cui porzione carbossilica è un residuo basico (Lys Arg)

Meccanismo catalitico

La Ser attivata è un forte nucleofilo: attacco al carbonile del substrato

Phe buco delloossianione

La stabilizzazione degli stati di transizione (stabilizzazionedell’ossianione tetraedrico) e il corretto posizionamento dei reagenti abbassano l’energia di attivazione

Stabilizzazione dell’intermedio tetraedrico: buco ossianionico

La triade catalitica èconservata in varie famigliedi proteasi, sia battericheche virali, che di animali e piante(evoluzione convergente)

Le tasche di alloggiamento del substratorendono selettivo il taglio proteolitico

Arg,Lys Ala,SerPhe, Leu

PROTEASI NON SERINICHEIl sito attivo presentacaratteristiche per l’attivazione diun nucleofilo per l’attacco al carbonilee una stabilizzazione dell’intermedio tetraedrico

Inibitori di proteasi sono spesso farmaci importanti

Proteasi dell’HIV: aspartil proteasi deputata a convertire alcune proteine virali in forma attiva per proteolisispecifica

crixivan Inibitore altamente specifico(a livello delle falde)non in grado di inattivare le proteasi umane