ENZIMI

Gli ENZIMI sono proteine (eccezioni: RIBOZIMI = RNA con attività catalitica) che sono strutturalmente suddivise in due classi:

•  PROTEINE SEMPLICI (costituite solo dalla parte di natura proteica) •  PROTEINE CONIUGATE (costituite da una parte proteica e da una di natura non proteica)

Cofattori

Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché un enzima sia attivo •  GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima

ATTIVATORI IONI ESSENZIALI COSTITUTIVI

COFATTORI

CO-SUBSTRATI COENZIMI GRUPPI PROSTETICI

Gli ENZIMI sono costituiti da molecole di natura proteica (eccezioni: RIBOZIMI= RNA con attività catalitica) e possono

essere suddivisi in due classi: •  PROTEINE SEMPLICI •  PROTEINE CONIUGATE

Oloenzima: complesso cataliticamente attivo enzima-cofattore Apoenzima: la parte proteica,priva di cofattore,

cataliticamente inattiva Cofattore: componente non proteica (IONE METALLICO o

MOLECOLA ORGANICA) Dal punto di vista strutturale gli enzimi possono essere distinti in: •  MONOMERICI •  OLIGOMERICI •  COMPLESSI ENZIMATICI

Cofattori

Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché un enzima sia attivo •  In genere TERMOSTABILI, mentre la maggior parte degli enzimi perde l’attività in seguito a riscaldamento •  Funzionano in genere da trasportatori intermedi di gruppi funzionali, di atomi specifici o di elettroni che vengono trasferiti nella reazione enzimatica generale

•  GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima

ATTIVATORI IONI ESSENZIALI COSTITUTIVI

COFATTORI

CO-SUBSTRATI COENZIMI GRUPPI PROSTETICI

GLI ENZIMI SONO PROTEINE!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Alcuni enzimi che contengono o richiedono come cofattori elementi inorganici

Zn2+ Alcool deidrogenasi Anidrasi carbonica carbossipeptidasi

Fe2+ o Fe3+ Citocromi Catalasi Perossidasi

Mg2+ Esochinasi Glucosio-6-fosfatasi Piruvato chinasi

Mn2+ Arginasi Ribonucleotide reduttasi

Cu2+ Citocromo ossidasi Tirosinasi

K+ Piruvato chinasi Na+ ATPasi della membrana plasmatica Ni2+ Ureasi Mo Xantina ossidasi Se Glutatione perossidasi

N.B. Effetti tossici di alcuni metalli pesanti (Cd2+ e Hg2+ possono sostituire lo ione Zn2+ nel sito attivo di alcuni enzimi, rendendoli inattivi)

VITAMINE IDROSOLUBILI

DENOMINAZIONE FABBISOGNO CARENZA COENZIMA FUNZIONE

B1 TIAMINA 1.5 mg beri-beri TPP Decarbossilazione B2 RIBOFLAVINA 1.5 mg Dermatite,

Cheilosi FMN, FAD Redox

PP NICOTINAMIDE 10 mg Pellagra NAD, NADP Redox B5 Ac. PANTOTENICO 10 mg Affaticamento HSCoA Trasporto acili B6 PIRIDOSSALE 2 mg Anemia

microcitica Dermatite, Nevrite

PLP Metabolismo Aa, Sintesi EME

B10 Ac. FOLICO 0.4 mg Anemia macro. megaloblastica FH4 Metab. Unità

monoCarboniose B12 COBALAMINA 5 µg Anemia

perniciosa Adenosil B12 Metil B12

Isomerizzazione, Metilazione

C Ac. ASCORBICO 60 mg Scorbuto Redox

H BIOTINA 0.3mg Affaticamento, Depressione, Dermatite

Biocitina Carbossilazione

Classificazione

Ø Ossidoriduttasi : reazioni di ossidoriduzione   Ø Transferasi : trasferimento di un raggruppamento chimico (carbossile, acile, amminico, fosforico, etc.) Ø Idrolasi : reazioni idrolitiche Ø Liasi : rottura non idrolitica e, in molti casi, formazione di legami covalenti C-C, C-N, C-S (decarbossilasi, aldolasi, etc.) Ø Isomerasi : riorganizzazioni intramolecolari (reazioni monomolecolari) Ø Ligasi : formazione di legami covalenti in reazioni fortemente endoergoniche, che avvengono grazie all’utilizzo di ATP (sintetasi, carbossilasi, etc.)

Gli enzimi: catalizzatori biologici

- La catalisi è necessaria per permettere a molte reazioni biochimiche essenziali di procedere ad una velocità compatibile con le esigenze fisiologiche in condizioni di

temperatura e pH molto blande

- Gli enzimi aumentano la velocità di una reazione chimica senza subire trasformazioni durante l’intero processo

- Gli enzimi non influiscono sulla posizione dell‘equilibrio di una reazione

- Un processo termodinamicamente favorito non viene reso più favorito, né un

processo sfavorito viene reso favorito, dalla presenza di un catalizzatore

LO STATO DI EQUILIBRIO VIENE SOLO RAGGIUNTO PIU’ VELOCEMENTE

AUMENTANO LA VELOCITA’ DI REAZIONE ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE

A B v = d[A] dt

d[B] dt = -

Velocità di una reazione

Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso, nell’unità di tempo

A B v = - d[A] dt

d[B] dt

=

Velocità di una reazione irreversibile di primo ordine Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso,

nell’unità di tempo

Il ΔG è utile per comprendere il funzionamento degli enzimi

•  L’energia libera (G) è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell’energia utile, cioè dell’energia in grado di compiere un lavoro

•  L’equilibrio della reazione dipende da ΔG°

ΔG° <0 spontanea

•  La velocità di reazione

dipende dalla barriera energetica ΔG‡ :

l’energia di attivazione

A --à B GA > GB ΔG° negativo reazione esoergonica

Energia di

attivazione

Affinché una reazione chimica abbia luogo: 1. I reagenti devono entrare in collisione 2. La collisione deve avvenire con un

orientamento corretto 3. I reagenti devono avere energia

sufficiente per poter reagire 4. ENERGIA DI ATTIVAZIONE energia libera supplementare che le

molecole devono possedere per raggiungere una condizione reattiva nota come stato di transizione

Gli enzimi catalizzano le reazioni abbassando la barriera di attivazione piuttosto che aumentando l’energia media dei reagent i . Ess i legano saldamente gli intermedi allo stato di transizione e l’energia di legame di questa interazione riduce l’ ENERGIA DI ATTIVAZIONE.

Enzimi

Sito di legame (microambiente tridimensionale della struttura della proteina dove vi è l’interazione con il substrato)

SITO ATTIVO Specificità di reazione Sito catalitico (porzione limitata del sito attivo costituito dagli aminoacidi coinvolti direttamente nella reazione enzimatica)

Le molecole non devono incontrarsi casualmente ma vengono ospitate nel sito attivo e quindi il loro incontro è facilitato inoltre vengono a confrontarsi in una posizione utile (corretto orientamento).

Le interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione della reazione; i siti attivi non sono complementari al substrato come tale, ma allo stato di transizione

che il substrato deve raggiungere per convertirsi in prodotto

Meccanismo catalisi enzimatica

Cosa fa l’enzima ? - forma il complesso ENZIMA-SUBSTRATO (ES) -  abbassa il livello energetico dello STATO DI TRANSIZIONE - diminuisce quindi l’ ENERGIA DI ATTIVAZIONE - aumenta la velocità della reazione aumentando la frazione di molecole che hanno sufficiente energia per raggiungere lo stato di transizione

Ø  In mancanza di enzima solo una piccola proporzione di molecole possiede un’energia sufficiente a raggiungere lo stato di transizione

Ø  La velocità di una reazione dipende dal numero di molecole che possono raggiungere lo stato di transizione

Ø  In genere, quanto più è bassa l’energia di attivazione, tanti più numerose saranno le molecole dotate di un’energia sufficiente e, quindi, tanto più veloce sarà la reazione.

Gli enzimi aumentano la velocità di reazione abbassando l’energia di attivazione, senza modificare lo stato energetico finale dei reagenti e dei prodotti e, quindi, l’equilibrio della reazione

Proprietà degli enzimi •  Siti attivi •  Efficienza catalitica •  Specificità •  Cofattori •  Regolazione •  Compartimentazione

Modello serratura e chiave

Modello dell’adattamento indotto

Un enzima lega due reagenti assicurando un corretto orientamento reciproco e la loro vicinanza. Li unisce inoltre più saldamente nello stato di transizione.

Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione enzimatica

Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica

•  Ionizzazione del sito attivo •  Denaturazione dell’enzima •  pH ottimale

Equazione di Michaelis-Menten

v0 = Vmax [S] Km + [S]

N.B. La velocità di una reazione è direttamente

proporzionale alla concentrazione dell’enzima

La costante di Michaelis (KM)

kM kM kM kM kM kM kM

affinità

Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il substrato sono saturati. Quindi KM fornisce una misura della conc di substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo

•  Il valore di Km caratterizza l’interazione di un enzima con un dato substrato

•  Molti enzimi hanno valori di Km vicini alle concentrazioni fisiologiche dei loro substrati

PERCHE’????

La dipendenza della velocità dalla concentrazione del substrato e quindi il

controllo che il substrato può esercitare sulla velocità di reazione verrà esercitato soltanto se la concentrazione del substrato cade in quel range in cui la cinetica si

approssima al I ORDINE

Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di una reazione enzimatica

Trasformazione di Lineweaver-Burk

€

1v0

=KM + [S]Vmax ⋅ [S]

1v0

=KM

Vmax ⋅ [S]+

[S]Vmax ⋅ [S]

1v0

=KM

Vmax⋅1[S]

+1

Vmax

v0 =Vmax ⋅[S]KM + [S]

Y

X equazione di una retta: y = ax + b

Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche

-1/KM

1v0=KM

Vmax⋅1[S]

+1Vmax

1/[S]

1/v0

1/Vmax

Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche

1/[S]

1/V0

-1/KM

1/Vmax

Vmax

[S] KM

Vmax/2

Grafico di Lineweaver-Burk V0

Grafico di Lineweaver-Burke (o dei doppi reciproci)

v0 = Vmax [S]

Km + [S]

v0 Vmax [S]

Km + [S] =

1

regolazione

modulazione dell’attività

quantità di proteina enzimatica

GLI ENZIMI REGOLATORI

Regolazione a breve termine

Regolazione a lungo termine (variazione della concentrazione dell’enzima)

Regolazione dell'attività enzimatica

Controllo a livello di substrato

•  Da concentrazione di substrato •  Inibizione da prodotto Interazione con ligandi •  Cooperatività di legame •  Regolazione allosterica •  Associazione-dissociazione Modifica covalente

•  Fosforilazione •  Acetilazione •  Adenilazione •  Metilazione •  Proteolisi

Induzione Repressione Turnover

ENZIMI REGOLATORI

•  Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore).

•  In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima regolatore.

Vi sono due classi di enzimi regolatori: •  Enzimi allosterici che agiscono mediante il legame reversibile di un

metabolita chiamato modulatore

•  Enzimi regolati mediante modificazioni covalenti reversibili

La regolazione dell’attività enzimatica

Gli enzimi allosterici sono regolati da molecole chiamate effettori (o modulatori), che si legano in modo non covalente in un sito diverso da quello attivo.

Quando il substrato è esso stesso un effettore, si dice omotropico. Quando l’effettore

omotropico è positivo, i siti di legame funzionano in modo cooperativo e la curva tra velocità iniziale e concentrazione di substrato è sigmoidale.

Un esempio di regolazione allosterica da parte di un effettore eterotropico negativo: l’inibizione retroattiva di una via metabolica.

La regolazione dell’attività enzimatica

Regolazione da modifica covalente: fosforilazione e defosforilazione

La regolazione dell’attività enzimatica

ISOENZIMI Si definiscono isoenzimi (o isozimi) quegli enzimi

che catalizzano la stessa reazione, ma hanno differente sequenza primaria. Molti isoenzimi

contengono subunità diverse in varie combinazioni. Organi (e tessuti) differenti spesso contengono

isoenzimi differenti

INIBIZIONI ENZIMATICHE

1.  Gli inibitori enzimatici sono molecole che interferiscono con la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni catalizzate da enzimi. Sono tra i più importanti Agenti Farmaceutici conosciuti (es. ACIDO ACETILSALICILICO inibisce l’enzima che catalizza la prima reazione della sintesi delle prostaglandine).

2.  Lo studio degli inibitori enzimatici ha fornito importanti informazioni sul MECCANISMO DI CATALISI ENZIMATICA ed ha aiutato a definire le singole reazioni di alcune vie metaboliche.

Vi sono due grandi classi di INIBITORI ENZIMATICI:

a. REVERSIBILI (rapida dissociazione del complesso EI) b. IRREVERSIBILI (si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima che è

essenziale per la sua attività catalitica, diminuendo così la quantità assoluta di enzima libero)

Inibizione competitiva (I si lega solo a E)

Un inibitore competitivo diminuisce la velocità di catalisi diminuendo il numero di molecole enzimatiche disponibili per legare il substrato in quanto competono per lo stesso sito di legame sull’enzima

• Diminuisce la vo (vo = k2 [ES])

• La vmax resta inalterata (vmax = k2[Et]) • Aumenta la Km ed il nuovo valore è generalmente detta Km apparente

P

Inibizione incompetitiva o acompetitiva (I si lega solo a ES)

L’inibitore incompetitivo si lega ad un sito diverso da quello del substrato, presente solo nel complesso ES

+ 2I

+ I

Km [S]

vo

vmax

P

• Diminuisce la vo (vo = k2 [ES])

• Diminuisce la vmax (vmax = k2[Et]) • Diminuisce la Km

INIBIZIONE IRREVERSIBILE

•  Gli inibitori irreversibili sono quelli che si combinano o che distruggono un gruppo funzionale dell’enzima che è essenziale per la sua attività catalitica o che formano un’associazione non covalente particolarmente stabile.

Es. 1. azione dei gas nervini sull’acetilcolinesterasi 2. inibizione irreversibile della chimotripsina

Diisopropilfluorofosfato

Es. reagenti dei gruppi sulfidrilici: iodoacetamide, agente alchilante

CH2SH + ICH2 C NH2 CH2S CH2 C NH2 + HI

O O

iodoacetamide

Enz Enz

•  Sono particolarmente utili per lo studio dei meccanismi delle reazioni enzimatiche

Regolazione mediante COMPARTIMENTAZIONE

-  È utile per tenere separati i substrati o i

prodotti di reazioni tra loro in competizione

Meccanismi responsabili di un aumento degli enzimi nel plasma

1)necrosi o danno cellulare indotto da fattori tossici o da ischemia, in cui gli enzimi normalmente contenuti nel citoplasma fuoriescono dalle cellule per citolisi

2)variazione della quantità di tessuto: aumentato turnover cellulare che si realizza normalmente durante l'accrescimento, la rigenerazione cellulare o anche in corso di neoplasie

3)alterata sintesi: induzione enzimatica in cui aumenta la sintesi proteica dell'enzima

4)ostruzione dei dotti escretori per cui enzimi normalmente presenti nelle secrezioni esocrine si riversano nel plasma

5)variazione nella permeabilità cellulare

6)alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione

7)altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...)

Inibitori come farmaci: i sulfamidici

Inibitori enzimatici come agenti terapeutici

Inibitore

Enzima

Applicazione

AZT

Trascrittasi inversa

HIV

Ritonavir, saquinavir Proteasi HIV

HIV

Sulfonammidi

Diidrofolato sintasi

Infezioni batteriche

Trimetoprim, methotrexate

Diidrofolato reduttasi

Infezioni batteriche

Allopurinolo

Xantina ossidasi

Gotta

Statine

HMG CoA reduttasi

Sintesi colesterolo

Aspirina

Cicloossigenasi

Sintesi prostaglandine

 

Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi

•  Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine •  Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro) •  occorrono inibitori ad alta specificità

Le statine, agenti anti-iperlipidemici, sono farmaci che agiscono da inibitori COMPETITIVI

Dosaggi enzimatici

•  Valutazioni cinetiche

•  Valutazioni cliniche

•  Dosaggio di metaboliti •  Valutazioni merceologiche (alimentari)

Dosaggi enzimatici in Biochimica Clinica

•  Enzimi plasmatici a scopo diagnostico

•  carenze/difetti enzimatici responsabili di alterazioni metaboliche e patologie correlate

N.B. Il plasma è la parte fluida non cellulare del sangue. Il siero è la parte liquida ottenuta centrifugando il sangue dopo averlo lasciato coagulare.

Gli enzimi nella diagnosi clinica

Gli enzimi si possono trovare: •  Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi

•  Confinati in particolari strutture all’interno delle cellule stesse

•  In un determinato tessuto od organo specifico.

Localizzazione Enzimatica

Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo sanguigno. In questo modo, un aumento della loro concentrazione nel campione può rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno cellulare.

Enzimi plasmatici da dosare:

•  enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione) •  enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi

digestivi) •  enzimi del metabolismo cellulare

–  ubiquitari –  organo (tessuto)-specifici