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Cromatografia edElettroforesi

Prof.ssa Flavia Frabetti

Esplorando le proteineUn passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitanodi conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la

PURIFICAZIONE della proteina di interesse

Tre metodi chiave: cromatografiaelettroforesiultracentrifugazione

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CROMATOGRAFIA

• metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa

• può essere analitica o preparativa

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema cromatografico

fase stazionaria impaccata in un letto cromatograficofase mobilesistema di distribuzione della fase mobilesistema di rilevazione

• di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza sideve usare una sequenza di più metodi cromatografici

• il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente diripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come ilcomposto si distribuisce tra due fasi immiscibili.

I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE:

dimensione e forma

carica

volatilità solubilità

affinità di legame permolecole specifiche

la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile dalla diversa interazione degli stessi con la fase stazionaria

interazione forte ritardo maggioreinterazione scarsa ritardo minimo

tempi di eluizione >tempi di eluizione <

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Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionare alla quale ha aderito per una specificaaffinità

Lessico scientifico

Fase = componente del sistema caratterizzato da unauniforme composizione chimica e proprietà fisiche(densità, struttura cristallina, ecc.)

miscela

fasestazionaria

rilevatorefase mobile

Si inietta una miscela da analizzare su una colonna

I componenti avanzanoa diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovverola fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscitaverrà registrato dal rilevatore

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Tipologie dei sistemi cromatografici

La classificazione può avvenire in base a:

forma del letto cromatografico

natura delle fasi mobile o stazionaria

metodo di separazione

Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna

Tipologia-classificazione

raccolta dei componenti

aggiunta solvente

caricamentocampione

colonna contenente

la fasestazionaria

Cromatografia su CARTA

Cromatografia su STRATO SOTTILE

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Metodo di separazioneTipologia-classificazione

1) cromatografia di partizioneo ripartizione

• separazione sulla base della solubilità di molecole piccole• ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matricesolida inerte + fase mobile organica non polare• cromatografia a fase inversa (vedi HPLC)

matrice inerte di supporto

fase stazionarialiquida

flusso della fase mobile

molecole non polariche si sciolgono nella fase

stazionaria

molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna

Metodo di separazione2) cromatografia per gel permeazione(o esclusione molecolare)

• separazione sulla base della dimensione• fase stazionaria = granuli porosi di un polimeroinsolubile ma molto idratato

flusso della fase mobile

fase stazionaria gelmicroporoso

molecole piccole che hannoaccesso all’intera matrice molecole medie che hanno

accesso solo ai pori più larghi

molecole grandi che sono totalmenteescluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna

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Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico

• separazione sulla base della carica• fase stazionaria = colonne con resine: cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppurecariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa)

flusso della fase mobile

cationi (+) del campioneche vengono trattenuti dalla

colonna+

+

+

__ _

_

_

_

_

_ _

++

--- --

fase stazionariaresina a scambiocationico

Separazione di aa in una colonna a scambio cationico

Asp Ser Lys

Colonnaa scambiocationico

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Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità

• separazione sulla base ad una affinità chimica di legame• fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzatoun ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando

flusso della fase mobile

fase stazionaria:matrice solida disupportotratto spaziatoreligando

tutti gli altri soluti vengono eluiti

molecola complementarelegata da interazioni specifiche

al ligando

Tipologia-classificazioneNatura delle fasi mobile o stazionaria

fase stazionaria: solido/gel o liquido

fase mobile: liquido o gas

liquidasolidaCromatografia aScambio ionico (IEC)

liquidasolidaCromatografia sustrato sottile (TLC)

liquidasolidaCromatografialiquida (LC)

gasSolida oliquida

Gascromatografia

Fasemobile

Fasestazionaria

Tipo es.

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Tipologia-classificazioneNatura delle fasi mobile o stazionaria

cromatografia liquida-liquida: HPLC cromatografia ad alta performanceo cromatografia liquida ad alta pressione

esempi:

cromatografia gas -liquida: gas-cromatografia

fase stazionaria: solido/gel o liquido

fase mobile: liquido o gas

carrier gas

pompa colonna

rilevatore

Fase stazionariasolida

Esempio di un cromatogramma

Deve avere una buona risoluzione

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inizio

t’R2

t’R1 ΔttM

picco di un solutonon trattenuto

tR = tempo di ritenzionetM = tempo di ritardo della fase mobile

t’R1= tR-tMΔt = distanza tra i 2 picchi

R�ISOLUZIONE R= Δt Wb1+Wb2

2se R = 1.5 separazione completa

Wb1 Wb2

ELETTORFORESI

• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico

• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico

matrice di gelcella elettroforeticaalimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante)tamponi salini

si possono studiare sia gliacidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine

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Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consentela separazione

può essere fatto di polimeriagarosio o poliacrilamide

Gel di agarosio: pesare l’agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita

Gel di acrilamide:miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*

Come si forma il gel?

Gel di acrilamide

• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine• di solito in sistemi verticali• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri

taglia molecolare del peptideconcentrazione di acrilamideconformazione della molecola (denaturata o meno)voltaggio

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pozzetticon i campioni

campione

anodo

catodo

supportodiplastica

tampone

tampone

PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteineè di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistemaverticaleSDS = detergente(sodio-dodecil-solfato)carico

-

Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE

proteina tetramerica proteina monomerica

bollitura

bollitura

peptidi connessi daponti disolfuro

peptidi separati

DENATURAZIONE DELLE PROTEINE

SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico)BME = β- mercaptoetanolo (riducente)

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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi(in kilodalton)

8 200 - 25

10 100 - 15

12.5 70 - 10

15 60 - 6

20 40 - 4

Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine

Dal Chieffiriquadro 2.2 pag:44-48

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALESU GEL o ISOELECTROFOCUSINGpunto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica nettadi una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, quiLa proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica

pH acido

pH basico

I fase:sep. x carica

II fase: separazione dimensionale

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Rivelazione della separazione elettroforetica:

• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela(es. con comassie blue o silver-stain)

• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche

1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici

consente di riconoscere una specifica proteina di interesse

consta di diverse fasi schematizzabili in:a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosab) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)

1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi

consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare ilturn-over proteico. L’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S

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a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa

trasferimentodelle proteine

proteina di interesse

carta imbevutadi tampone

carta imbevutadi tampone

b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) -fasi procedurali

anticorpi Ilegano l’antigene

anticorpi IIlegano gli anticorpi I

la membrana viene saturata daproteine inerti

sviluppo della colorazione enzimatica

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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi(in kilodalton)

8 200 - 25

10 100 - 15

12.5 70 - 10

15 60 - 6

20 40 - 4

Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforeticadi std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine)

Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine