Analisi di proteine:Elettroforesi e Western Blot

Seminario Metodologico per

il Corso di Didattica Libera

Marilena Dinardo

mm.dinardo@biologia.uniba.it

Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le proteine che servono a “fabbricare” un organismo, a farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono responsabili di malattie.

Ed è proprio attraverso lo studio del funzionamento delle proteine che si potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….

Purificazione delle proteine:

La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà.

Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

La rottura delle cellule può essere ottenuta

mediante:Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi);Shock osmotico;Successivi cicli di congelamento/scongelamento;

Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi:

mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido;mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (Potter-Elvejham).

Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto l’attrito sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

Le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono:

- la rottura delle cellule in uno specifico buffer;

- la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

Campioni proteici

Estratti di tessuti o cellule

Proteine ricombinanti “etichettate” con antigeni (“tags”: HA, T7)

Virus interi purificati

Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma)

Proteasi

Estrazione delle proteine

Proteasi

Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) pH Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio)

Elettroforesi

Analisi elettroforetica

delle proteine del siero

Elettroforesi

La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza):

v = Eq/fdove f=6πrη

Fattori che influenzano la velocità di migrazione

CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma)

TAMPONE (Concentrazione, pH)

SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

SUPPORTI

Non setaccianti

(Carta), acetato di cellulosa

Setaccianti

Gel di poliacrilammide(PAG) Gel di Agarosio

Elettroforesi su gel

Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o chimiche quali:

(1) dimensioni

(2) forma

(3) carica elettrica

Elettroforesi di DNA

I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammideI campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenzialeIl DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+”I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente

Elettroforesi di Proteine

Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNAProteine diverse hanno cariche diverseLe proteine variano molto per forma

Generalmente il gel e’ fatto di poliacrilammide

Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare

le proteine?

I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compattaI pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosioLe proteine sono molto piu’ piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da

1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

Elettroforesi di proteineCondizioni Non Denaturanti

Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell’elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°;

legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma

Nome Carica Massa Forma

Proteina Q

Proteina R

+3 30kD

4 42kD

Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti

Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro

dimensioni

SDS

Carica Massa

+3 30kD

4 42kD

Carica Massa

300 30kD

420 42kD

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

SDS (Sodio Dodecil Solfato)Solubilizza e denatura le

proteineAggiunge cariche

negative alle proteine

O S

O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

Proteina NativaCarica netta: -4

Proteina trattata con SDSCarica netta: Molto (-)

Sistemi per la corsa di SDS-PAGE

Amersham Biosciences

Medio (16 x 16 cm)Piccolo (8 x 10 cm)

Bio-Rad

SDS-PAGE

Colorazione con Blu di Coomassie

acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

Come funziona un Gel SDS-PAGE ?

s-s SDS, calore

Proteine con SDS

+

–

Le proteine cariche negativamente si muovono verso l’elettrodo positivo

Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente

Le proteine si separano per dimensione

Cosa c’e’ nelbuffer di caricamento?

Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8)

SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva

Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti

Un agente riducente (DTT o -Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro

Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

Il Gel

E’ costituito da due parti:Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8Running gel: 8-14% gel separatore, pH 8.8Le molecole di acrilammide sono tenute

assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice

Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

Il Gel

Componenti del gel SDS-PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8SDSddH2OTEMEDAPS (ammonio persolfato)Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

Il GelCome funziona: Proteine vengono caricate,

viene applicata una corrente elettrica

Includere un marker di peso molecolare colorato

10-50ug di estratto proteico totale

0.1-1ug di proteina purificata

Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+)

Si muovono verso il gel

separatore (“resolving”) Differenze di pH causano la

ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore

+

–

StackingpH 6,8

ResolvingpH 8,8

Il Gel

% di acrilammide consigliata

8%

10%

12%

Dimensioni delle proteine

40-200 kDa

21-100 kDa

10-40 kDa

Visualizzazione delle proteine nel gel

I due metodi piu’ usati sono:

Colorazione con il Coomassie Brilliant

Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda)

Coomassie staining Silver staining

Stima dei pesi molecolari

0

50

100

150

200

250

0 20 40 60

Distanza (mm dal pozzetto)

Dim

ensi

on

i in

kD

a

kD mm203 8.5135 12.086 18.5

41 28.0

33 34.0

19 41.5

8 44.5

Stima dei pesi

molecolari

Western Blotting

Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA).

Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. (sonda = DNA o RNA).

Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

Cosa e’ un Western Blot?

Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

Qual e’ la proteina che mi interessa?

SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare

Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo

A cosa serve il Western Blot?

+

–

?

Fasi di un Western BlotPrima fase: elettroforesi su gel.

(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni)

Seconda fase: trasferimento su membrana.

(Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico)

Terza fase: saturazione o “blocking”.

(La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

Fasi di un Western BlotQuarta fase: legame dell’anticorpo primario.

(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana)

Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario.

(L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana)

Sesta fase: rivelazione o “detection”.

(L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo

E’ necessaria l’immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l’esperimento di

elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche

La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana Nitrocellulosa PVDF (Polivinilidene fluoride) Nylon

Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento

Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento

membrana

Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la

membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo

Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si legano alla membrana

Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento

Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+)

1) Spugnette2) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di trasferimento

3) Gel4) Membrana5) 3 fogli di carta da filtro

imbevuti di tampone di trasferimento

6) Spugnette

Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento

Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

Western Blotting+-

-

+

SDS-PAGE

Assemble ‘sandwich’

Buffer-soaked filter papers

Gel

Nitrocellulose membrane

Wet blotting

Electrode

Buffer

Direction of transfer

Semi-dry blotting

Graphite Electrode Plates

Nitrocellulose with bound proteins

Stained (Red Ponceau)

Componenti del tampone di trasferimento:25mM Tris190mM glicina20% metanolo

Western blot: seconda faseImmobilizzazione e trasferimento

3

Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana

Per prevenire il legame dell’anticorpo primario alla membrana stessa

Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

Western blot: terza fasesaturazione o “blocking”

4

L’anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana

Anticorpi come sonde: Molto sensibili Possono essere “prodotti”

Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) Generando anticorpi monoclonali (mAb)

Economici

Western blot: quarta faseincubazione con anticorpo primario

Anticorpi

Ab + Ag AbAgKd

Kd = = 10-9 M[Ab][AbAg]

Anticorpi

Anticorpi (immunoglobuline, Ig)

Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza l’antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria.

Anticorpi policlonali

ProduzioneImmunizzazione ripetuta dell’animale con l’antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante)Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il sieroIl “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi dell’antigene usato per l’immunizzazione

Anticorpi monoclonali

Riconoscono solo un epitopo

Western blot: quarta faseincubazione con anticorpo primario

5

Western blot: quinta faseIncubazione con anticorpo secondario

Anticorpi

Anticorpo primario Riconosce la

proteina

Anticorpo secondario Lega l’anticorpo primario Generalmente prodotto in

una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell’enzima

sara’ convertito in un prodotto colorato

Puo’ anche essere radioattivo o fluorescente

Western blot: quinta faseIncubazione con anticorpo secondario

6

Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un

precipitato colorato

Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall’enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche

Marcatura radioattivaAnticorpi secondari biotinilati

Western blot: sesta faserivelazione o “detection”

HRP

Western blot

HRP

substrato

luce

Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione

Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

Quanta proteina di interesse c’e’?

A cosa serve il Western Blot?

Proteina di interesse

Bande non specifiche

[Proteina], pg

020406080

100

1 100 10000

Pg di ProteinaD

ensi

ta' m

edia

(i

nte

nsi

ta')