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Lezione 2

Multicolor labeling - CGH

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Aberrazioni numeriche

Aberrazioni strutturali traslocazioni, inserzioni

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Sistema combinatoriale:

n=3 fluorocromi

2n-1=7 combinazioni

Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da Ried e coll. con l’impiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a sette sonde genomiche.

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MARCATURA COMBINATORIALE

RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi)

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• Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande colorate (Muller et al 1997);• MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per pseudobandeggio (Chudoba et al 1999);

• cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al 2001);

• M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000).

• M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996);SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996);COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi (Tanke et al 1999);

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M-FISH, SKY & COBRA (Multiplex-FISH,

Spectral KarYotyping & COmbined Binary RAtio labelling) :

finalità•analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un

approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R):

un singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo;•sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti

i riarrangiamenti cromosomici;•strumento di screening per l’identificazione di nuovi

riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio.

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M-FISH, SKY & COBRA:

applicazioni• Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e

double minutes;

• Corretta identificazione di traslocazioni quando il

pattern di bandeggiatura non è ottimale, o

in metafasi di scarsa qualità;

• Caratterizzazione di traslocazioni complesse.

• Identificazione di inserzioni cromosomiche.

• Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’.

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- Non e’ possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune pericentriche

- E’ difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei

telomeri

- Necessita’ di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti

perche’ possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole

duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono

regioni di dimensioni >3Mb

M-FISH, SKY & COBRA:

limiti

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Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma

A = RodaminaB = Texas RedC = Cy 5

D = FITCE = Cy 5.5 Esempio

Sistema combinatoriale: n=5 fluorocromi

2n-1=31 combinazioni

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M-FISHmethodology

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Si ottiene infine l’immagine totale combinando le informazioni delle acquisizioni effettuate con i sei filtri.

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Cariotipo complesso

Cariotipo con M-FISH

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Cariotipo con SKY

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Marker cromosomico

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Traslocazione complessa

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RATIO IMAGE FIRST BINARY IMAGE

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riarrangiamenti intracromosomici

marcatori con neocentromeri o privi di centromero

risoluzione: 3Mb

riarrangiamenti intracromosomici

riarrangiamenti tra più cromosomi

identificazione piccoli marcatori (<17p)

Limiti

risoluzione: riarrangiamenti submicroscopici telomerici

identificazione piccoli marcatori (<17p)

riarrangiamenti tra più cromosomi

due esperimenti sequenzialisingolo esperimentosingolo esperimentoVantaggi

M-TEL-FISHcen-M-FISHM-FISH/SKY/COBRA

conclusioni

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Conventional CGH

Rat

io

Position on Chromosome

Test Genomic DNA Reference

Genomic DNACot-1 DNA

gain deletion

TumourNormal

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RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO

10.8 1.2

Software per l’analisi delle immagini digitali

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Small cell lung carcinoma

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Array CGH

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Espressione genica

G3PDH

Sequenza ibridatata su mRNA

Northern Blot

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30,000 Geni30,000 Northerns

Northern Blot

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Test Genomic DNA

(Tumour DNA)

Reference

Genomic DNA

Rat

ioPosition on Sequence

Cot-1 DNA

Rat

io

Position on Chromosome

gain deletion

CGH su microarrays

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Chip fabrication

Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e con precisione.

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AA * *

AB * * *

BB * *

Chromosome

SNP 1 2 3 4 5 6 7

SNP array

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SNP array genoma maschile normale

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SNP array genoma esempio patologico?

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SNP array 3 delezioni?

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genitore - figlio 1/2

fratelli 1/2

zio - nipote 1/4

cugini primi 1/8

cugini secondi 1/16

Condivisione genoma

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Ricombinazione mitotica(MR)

Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936)

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Ricombinazione mitotica(MR)

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Ricombinazione mitotica(MR)

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Ricombinazione mitotica(MR)

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Ricombinazione mitotica(MR) origina una popolazione a mosaico

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UPD segnalata in alcuni tumori:

Breast Cancer

Retinoblastoma

Ulveal melanoma

Wilms tumour

Myeloproliferative disorders (9p)

Haematopoietic malignancies

SNP array nei tumori

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SNP array AML

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SNP array AML

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+ +

UPD