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Diagnosi Prenatale I

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Diagnosi prenatale

fornire scelte informate alle coppie a rischio

rassicurare e ridurre l’ansia

permettere a coppie ad alto rischio di confermare o smentire l’anomalia nel feto mediante il test, anziche’ rinunciare ad avere figli

permettere a coppie con un bambino affetto di avere una preparazione psicologica prima e dopo la nascita

permettere il trattamento prenatale del feto affetto

nata nel 1966 (Steele e Breg); richiede l’intervento di numerose discipline: ostetricia, ultrasonografia, genetica clinica, diagnosi e consulenza genetica e la diagnostica di laboratorio;

scopi:

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Indicazioni Diagnosi prenatale

Incidenza della trisomia

21

1. Eta’ materna avanzata

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Indicazioni Diagnosi prenatale

2. un precedente bambino con un’anomalia cromosomica “de novo”

3. la presenza di anomalie cromosomiche di tipo strutturale in uno dei genitori

4. la presenza di una storia familiare per una malattia genetica che puo’ essere diagnosticata o esclusa mediante analisi biochimiche o del DNA

5. La presenza di una storia familiare per una malattia X-linked per la quale non esiste un test prenatale specifico

6. Il rischio dei difetti del tubo neurale

7. Lo screening del siero materno ed ecografia I e II trimestre (NT, nasal bone, CPC, EHF,SUA)

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Considerazione Importante!!!!!

Le diapositive che seguiranno trattano aspetti non genetici: sono teniche che attengono alla pratica medica, tuttavia mi sembra appropriato che li conosciate. Questo non vuol dire che siano l’aspetto piu’ importante o esaustivo …..ANZI!!!!

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Metodi “ostetrici”per la diagnosi prenatale

Tests invasivi:AmniocentesiEsame dei villi corialiCordocentesiDiagnostica genetica preimpianto

Tests non invasivi:Alfa-fetoproteina nel siero maternoScreening del siero maternoEcografiaIsolamento delle cellule fetali dal sangue materno

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AFP (alfa-fetoproteina)

E ’ una glicoproteina di origine fetale prodotta principalmente nel fegato, secreta nel circolo fetale, ed eliminata attraverso i reni nel liquido fetale

Entra nel circolo sanguigno materno attraverso la placenta, le membrane amniotiche e la circolazione materna-fetale

Puo’ essere valutata sia nel liquido amniotico (AFAFP) che nel siero materno (MSAFP)La concentrazione viene valutata mediante dosaggio immunoenzimatico (tecnica poco costosa)

Insieme all’esame ecografico a 18-19 settimane, l’esame dell’ AFAFP permette di identificare il 99% dei feti con spina bifida e tutti quelli affetti da anencefalia (il range di normalita’ va stabilito in relazione all’eta’ gestazionale)

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AFP (alfa-fetoproteina)La concentrazione di AFP viene valutata nel liquido amniotico per rilevare la eventuale presenza di difetti del tubo neurale (Spina bifida, anencefalia, ecc.)

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Amniocentesi

E ’ una procedura mediante la quale un campione di liquido amniotico viene prelevato attraverso l’addome con l’uso di una siringa

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Aspetti tecnici (sempre ostetrici) dell’amniocentesi

Esame ecografico preliminare per valutare le condizioni fetali, il periodo gestazionale, il numero di feti, la normalita’ strutturale e la posizione ottimale per l’inserimento dell’agoEpoca: tra la 15a e la 16a settimana di gestazione (eccezionalmente tra la 10a e la 14a)Esecuzione: ambulatorialePreparazione: nessunaAghi: 21-22 g (0,8-0,7 mm)Via: transaddominale

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Complicazioni:Aumento dello 0.5-1% al di sopra del normale rischio del 2-3% di aborto

Rare perdite di liquido amniotico, infezioni e danni al feto causati dalla puntura dell’ago

L ’amniocentesi precoce (10-14 settimane) ha un rischio d’aborto del 2,6% contro lo 0,8 dell’amniocentesi tradizionale

Per prevenire l’immunizzazione Rh della madre, viene somministrata di routine la globulina immune Rh alle donne Rh negative

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Analisi dei villi coriali (chorionic villus sampling o CVS)

La biopsia dei villi si effettua tra la 10a e la 12a

settimana di gestazione mediante prelievo transaddominale o transcervicale

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Vantaggi del CVS:

Dal momento che il trofoblasto é di provenienza embrionale e presenta il medesimo patrimonio genetico dell’embrione, possono essere effettuate su questo materiale le medesime indagini citogenetiche, biochimiche e sul DNA effettuate con l’amniocentesi.

I risultati delle successive indagini sono disponibili in un’eta’ gestazionale piu’ precoce rispetto all’amniocentesi, riducendo il periodo di incertezza e permettendo un’eventuale interruzione di gravidanza nel primo trimestre

Fornisce l’esito dell’analisi cromosomica in un periodo di tempo piu’ breve rispetto all’amniocentesi

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Svantaggi del CVSL ’AFP non puo’ essere valutata in questo stadio (a differenza dell’amniocentesi) e lo screening per le anomalie del tubo neurale deve essere effettuato mediante esame ecografico durante la 16a settimana di gestazione

La frequenza di aborto e’ dell’1% sopra il normale rischio del 2-5% alla 7a-12a settimana di gestazione

Il successo dell’analisi cromosomica e’ pari a quello dell’amniocentesi (>99%). Tuttavia, il 2% dei tests eseguiti da CVS danno risultati ambigui a causa del mosaicismo cromosomico (sia vero che pseudomosaicismo). Quindi si raccomanda l’esecuzione di un’amniocentesi successiva per stabilire in maniera inequivocabile se il feto presenta un’anomalia cromosomica.

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Cordocentesi (Funicolocentesi)

Con il termine funicolocentesi (o cordocentesi) si intende il prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale.La funicolocentesi viene eseguita più tardivamente rispetto alla villocentesi e all'amniocentesi (dopo la 20a settimana fino al termine della gravidanza) ed il prelievo comporta un maggiore rischio di aborto rispetto agli altri tipi di prelievo. Questo esame viene richiesto solo quando ci sono indicazioni specifiche.

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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI

Mosaicismo cromosomico: nel caso di mosaicismo cromosomico

rilevato su liquido amniotico o villo coriale può essere necessario

eseguire un esame del cariotipo su sangue fetale, allo scopo di

analizzare un tessuto diverso e ottenere maggiori indicazioni

sull'assetto cromosomico del bambino.

Malformazioni fetali evidenziate ecograficamente: le anomalie

anatomiche prendono il nome di malformazioni e colpiscono un

neonato su 40. Vengono frequentemente evidenziate intorno alla 20-

22a settimana di gravidanza, all'ecografia di secondo livello

(ecografia morfologica). Alcune di queste malformazioni possono

essere conseguenza di anomalie cromosomiche e quindi richiedere

un esame del cariotipo, che può essere effettuato su liquido

amniotico o sangue fetale, a seconda dell'epoca gestazionale. Nel

caso in cui la gravidanza sia avanzata è preferibile eseguire la

funicolocentesi, in quanto si ottiene una risposta in tempo più breve

rispetto all'amniocentesi.

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QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI

Ritardo nella crescita intrauterina: un importante ritardo

della crescita fetale è talvolta associato ad un'anomalia

cromosomica e può essere necessario un esame del cariotipo.

Diagnosi di malattie infettive: un prelievo di sangue fetale

può essere richiesto per valutare un'eventuale trasmissione

di un agente infettivo dalla madre al bambino. Oggigiorno,

comunque, questo tipo di indagini viene effettuato nella

maggior parte dei casi su liquido amniotico.

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Il prelievo di sangue fetale

Funicolocentesi: un esame rischioso? I rischi per la madre sono praticamente inesistenti, se vengono

rispettate le regole della sterilità.Per quanto riguarda il feto, viene stimato un rischio di aborto dopo prelievo di sangue fetale pari al 3-4%.

Il sangue fetale in laboratorio

Il sangue fetale viene raccolto in apposite provette con un terreno nutritivo che favorisce la proliferazione delle cellule prelevate. Sono necessari circa 3 giorni per poter analizzare al microscopio le cellule fetali.

La funicolocentesi non richiede alcuna preparazione ed è ambulatoriale, anche se sono necessari uno o più controlli ecografici dopo il prelievo.La sua esecuzione consiste nell'aspirazione, mediante un ago sottile introdotto per via transaddominale sotto guida ecografica, di una piccola quantità (circa 0.5-2 ml) di sangue fetale.E' consigliabile, dopo il prelievo, un periodo di riposo di 48 ore.

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Screening dell’AFP nel siero materno alla 16a settimana

Quando il feto presenta difetti del tubo neurale, la concentrazione dell’AFP e’ piu’ alta rispetto ai normali livelli nel siero materno.

Questo saggio combinato con l’esame ecografico risulta molto efficace per la diagnosi dei difetti del tubo neurale.

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Screening del siero materno(Triplo TEST o TRI-TEST)

AFP uE3 HCG

Rischio aumentato per sindrome di Down

Trisomia 18

NTD

non applicabile non applicabile

Individua il 70% dei bambini affetti da Trisomia 21 ed ha un 5% circa di falsi positivi, cioè di risposte allarmanti ma non veritiere. Viene definito positivo quando il rischio stimato è superiore a una probabilità su 250. Le pazienti positive al test (si stima circa il 10%) devono eseguire  l'amniocentesi per una diagnosi definitiva.

Misura la concentrazione di tre marcatori del sangue (AFP, estriolo non coniugato o uE3, gonadotropine corioniche o HCG) ed e’ disponibile alla 15a-20a settimana di gestazione per identificare i soggetti che presentano un aumentato rischio per la sindrome di Down, trisomia 18 e difetti del tubo neurale

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Il BI-TEST ha il vantaggio di poter essere eseguito più precocemente tra la 11a e la 14a settimana di amenorrea. Il risultato dipende dalla analisi dell'età materna rapportata al dosaggio di due ormoni: la Gonadotropina Corionica e la Plasma Proteina Associata alla Gravidanza (PAPP-A). La Gonadotropina Corionica aumenta in caso di malattie cromosomiche mentre la PAPP-A diminuisce. Il test viene definito positivo quando il rischio stimato è superiore ad una probabilità su 300.

L'ULTRASCREEN è una evoluzione del bi-test. L'associazione infatti del bi-test con una ecografia genetica (all'epoca in cui fu proposto veniva studiata la translucenza nucale) può aumentare la sensibilità

Screening del siero materno(Triplo TEST o TRI-TEST)

Attenzione: questo test è scarsamente attendibile in caso di gravidanza gemellare e diabete materno. L ’esame MSS rappresenta un test di screening e non un mezzo diagnostico (come l’amniocentesi)!

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L ’INDAGINE ECOGRAFICA

I feti affetti da anomalie cromosomiche presentano delle

caratteristiche anatomiche particolari individuabili con

una indagine ecografica nel corso del primo trimestre di

gestazione.

Nel 2001 un gruppo di ricercatori del King's College

Hospital di Londra ha proposto un ulteriore marker

ecografico utile per l'individuazione degli embrioni affetti

da Sindrome di Down, lo studio delle ossa nasali. Si è

infatti scoperto che il 73% dei bambini nati con Sindrome

di Down non ha ossa nasali. Si stima che questa indagine

associata all'ultrascreen può portare la predittività fino al

93% circa.

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L ’INDAGINE ECOGRAFICAUna di queste indagini è la valutazione della cosiddetta  TRANSLUCENZA NUCALE. Si è visto in effetti che molti embrioni affetti da anomalie cromosomiche hanno, per ragioni ancora non completamente conosciute, un accumulo transitorio di liquido negli strati sottocutanei della regione retronucale del collo nel periodo tra 10 e 14 settimane. Se lo spessore di questa zona supera i 3 mm si ha una probabilità di anomalie cromosomiche pari al 75% con un 5% di falsi positivi. In questi casi è consigliabile procedere quindi subito ad una biopsia dei villi coriali e se questa è negativa è consigliabile comunque ripetere un accurata osservazione del feto mediante un'ecografia di II livello tra la 20a e la 22a settimana, in 1 caso su 20 infatti possono essere presenti altre malformazioni, soprattutto cardiache.

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Tecnologie emergenti

si effettua la biopsia di un blastomero dopo IVF.

Il trasferimento degli embrioni sani e’ effettuato dopo analisi molecolari e/o cromosomiche. Non esiste attualmente alcuna evidenza di danni negli embrioni sottoposti a biopsia.

Diagnosi genetica preimpianto (PGD)

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Diagnosi genetica preimpianto (PGD)Nel caso di malattie monogeniche si applica l’analisi molecolare mediante PCR,

mentre per le anomalie cromosomiche si utilizza la FISH in interfase dopo fissazione su vetrino di uno o piu’ blastomeri.

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Cellule fetali nel sangue materno In ogni gravidanza sono presenti cellule fetali (linfociti, cellule trofoblastiche, eritrociti) nel sangue materno (1 su 103-107). Queste possono essere arricchite mediante MACS ed utilizzate per la FISH con speciali sonde di DNA per il cromosoma 13, 18 e 21, X e Y. Queste tecniche pero’ non sono ancora applicabili nella pratica clinica e devono, per il momento, essere considerate delle tecniche sperimentali.

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Test di laboratorio

Analisi citogenetica

Analisi del DNAteoricamente saggi biochimici per la diagnosi di malattie metaboliche (dosaggi enzimatici su liquido amniotico o direttamente su villi coriali)

questi ci riguardano quando si parla di diagnosi prenatale di malattie genetiche!!!!!

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Il liquido amnioticoIl liquido amniotico contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in coltura per i successivi tests diagnostici.

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Analisi citogenetica

Sia l’amniocentesi che il CVS forniscono cellule fetali per l’analisi del cariotipo.

La preparazione e successiva analisi dei cromosomi puo’ richiedere da 1 a 2 settimane.

Si possono, in alternativa, usare nuclei interfasici da cellule fetali non coltivate per diagnosticare le comuni aneuploidie dei cromosomi 13, 18, 21, X ed Y immediatamente dopo amniocentesi o CVS. Questo rapido test citogenetico deve essere ancora realmente valutato come metodo diagnostico da utilizzare di routine.

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METODICA D’INDAGINE in situ

Il liquido amniotico viene centrifugato per la raccolta delle

cellule che sono risospese in opportuno terreno e poste in

coltura. Le cellule possono essere coltivate con due metodiche:

in situ:. Essa avviene per colonie, presupponendo che

ciascuna di esse derivi da una singola cellula fetale. Tale tecnica

permette una migliore valutazione diagnostica in caso di

mosaicismo cromosomico o di contaminazione materna. I tempi

di coltura sono piu’ brevi rispetto al metodo dopo sospensione.

A crescita avvenuta, le colonie cellulari vengono trattate con

colchicina. Segue shock osmotico, fissaggio, colorazione e

bandeggio per l’analisi delle metafasi al microscopio

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Metodica d’indaginesospensione mediante enzimi proteolitici

Dopo alcuni giorni di crescita, si rispospendono le cellule nella

fiasca di

coltura mediante l’utilizzo di tripsina, si fanno riaderire e si

prosegue la

coltura.

A crescita ultimata, si esegue il trattamento con colchicina,

shock osmotico, fissaggio, colorazione e bandeggio.

Questa tecnica permette di ottenere una maggiore crescita

cellulare,

ma viene persa l’individualita’ dei cloni e quindi l’origine (singola

o multipla)

di eventuali mosaicismi.

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Villi corialicoltura

I villi sono posti in coltura previo trattamento con enzimi proteolitici per disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofoblasto.

A crescita avvenuta, si procede al trattamento con colchicina, cui segue shock osmotico, fissaggio dei preparati su vetrino e analisi delle metafase dopo colorazione.

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Villi corialimitosi spontaneeSi sfruttano le mitosi spontanee delle cellule del trofoblasto.

Si procede alla selezione dei villi idonei,eliminando eventuale sangue o decidua aspirati durante il prelievo;

I villi vengono messi in coltura per 24-48 h a cui viene poi aggiunta colchicina

Si effettua o shock osmotico con soluzione ipotonica per rompere le membrane cellulari

Si esegue il fissaggio, e lo striscio del preparato sul vetrino

Colorazione ed analisi del cariotipo

Vantaggi: tempi rapidissimi, minor inquinamento da cellule materne, costi piu’ bassi

Svantaggi: l’attivita’ mitotica e la qualita’ delle metafasi sono inferiori al metodo della coltura.

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Sangue fetale

Si effettua la messa in coltura del sangue per 72h. Dopo l’aggiunta di colchicina, centrifugazione, trattamento con sol. ipotonica (KCl), fissaggio in soluzione, preparazione del vetrino e colorazione per l’analisi del cariotipo.

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Tecniche di bandeggio cromosomico

Permettono di identificare in maniera univoca una coppia di omologhi

Le tecniche di bandeggio sono varie:

Bande Q. Si utilizza un colorante fluorescente (quinacrina). Un pattern

di bandeggio simile si può ottenere con il DAPI.

Bande G. Si trattano i cromosomi con enzimi proteolitici (tripsina) oppure con alcali o con soluzioni a elevato pH. Quindi si colorano con Giemsa. Le bande G corrispondono in larga misura alle bande Q.

Bande R. Si trattano i cromosomi con temperature elevate (87°C) e si

colorano con Giemsa o acridina orange.

Le bande che si ottengono sono complementari alle bande G.

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Tecniche di bandeggio cromosomico

Bandeggio Q Bandeggio G Bandeggio R

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MOSAICISMO

Si riferisce alla presenza di due o piu’ linee cellulari in un campione o tessuto.Si distinguono tre livelli di mosaicismo nel liquido amniotico o nelle colture CVS:MOSAICISMO VERO (elevato rischio di anomalie fetali)

MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)

PSEUDOMOSAICISMO (una singola cellula anomala): viene ignoratoLa grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali

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problemi dell’analisi cromosomica prenatale:

riarrangiamento cromosoma marker

de novo??

Analisi del cariotipo dei genitori

1. Genitori non portatori :“de novo”

2. Un genitore (sano) portatore di un riarr.bilanciato

Stesso riarrangiamento nel feto

Feto sano?

Riarrangiamento sbilanciato nel feto

Gravi anomalie fetali

Fallimento della coltura cellulare (rischio basso) Situazioni avverse inattese