By NA 1

Polimorfismi

LEZIONE 6

By NA 2

Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con

una frequenza superiore a 1%

Variazioni nell’aspetto

*

By NA 3

Polimorfismo proteicoVariazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%

che cosa mi dice questo gel?

Che nella popolazione esistono piu’ fenotipi di questo enzima: fast, medium, slow: esistono 3 alleli a questo locus. La velocita’ della corsa dipende dalla carica della molecola, quindi ci sono delle sostituzioni amminoacidiche che modificano la carica. Queste sostituzioni non coinvolgono siti importanti per la funzione della proteina perche’ a meno di fare il gel non e’ possibile individuare le molecole varianti. Cioe’ a livello del fenotipo funzione della proteina, o fenotipo salute dell’individuo gli M, gli F, o MF, MS sono indistinguibili.

By NA 4

Polimorfismo proteicoVariazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%

Perche’ non ho trovato individui solo S?

Ovviamente la sostituzione amminoacidica corrisponde ad una mutazione nel DNA e se conosco la sequenza del DNA forse riesco a individuare un fenotipo variante del DNA cioe’ un polimorfismo del DNA

Perche’ trovo individui MF, MS,?

HW: dipende dalla frequenza nella popolazione dell’allele S

By NA 5

Polimorfismo del DNA

Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR

Polimorfismi del DNA: sono mutazioni nella sequenza chemodificano il fenotipo della sequenza. Questo fenotipo none’ visibile a livello dell’aspetto dell’individuo perche’ per definizione il polimorfismo non modifica la funzione.

Una mutazione nella sequenza non viene definita polimorfismo, ma mutazione patogena quando la posso ricondurre ad un fenotipo patologico.

*

*

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By NA 6

Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR

Polimorfismo PCR&

&

By NA 7

DNA genomico digerito con Enzimi di restrizione gel di agarosio colorato con EtBr

Marker per sapere come si sonodistribuiti i frammenti

Il righello serve per calcolare lalunghezza dei frammenti in funzionedello spazio percorso (cfr.foto succ.

La luminosita’ nei pozzetti derivada DNA non ben digerito e/o daimpurita’ per una estrazione pocoaccurata

Questa banda piu’ intensa e’ data dasequenze ripetute che essendo tagliateperiodicamente e in frammenti sempre della stessa lunghezza si accumulano alla stessa altezza

La intensita’ equivalente del DNA delle diverse corsie indica che le quantita’ caricate di DNA dei campioni sono le stesse. Il DNA a basso peso verso il fondo del gel si vede male perche’ sono meno rappresentati infatti la maggior parte del DNA e’ nella parte alta del gel

By NA 8

Polimorfismo RFLPPolimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite,

microsatellite. RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima,

ma non con altri. Quindi e’ la coppia sonda-enzima che evidenzia il RFLP

A1 A2 A3B1 B2

A1 A3B1 B2mutazioneelimina il sitodi restrizione

endonucleasi Bendonucleasi A

EnzimaA

EnzimaB

Pattern di ibridazione sufiltro

*

&

By NA 9

cDNA di COL1A2Il cDNA di COL1A2

A1 A2

A1 A2

EcoR1

14Kb

A3

3.5Kb 10.5Kb

GEL filtro ibridato con cDNA

By NA 10

A1 A214Kb

A1 A2A33.5Kb 10.5Kb

Omozigoti per allele 14:14/14

A1 A2

A1 A214Kb

14Kb

A1 A2

A1 A2A33.5Kb 10.5Kb

3.5Kb 10.5KbOmozigoti per allele 10.5,3.5:10.5,3.5/10.5,3.5

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE

Eterozigoti per alleli 14 e10.5,3.5 14/10.5,3.5

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE

RFLP del cDNA di COL1A2

By NA 11

Polimorfismo RFLP esempio

Lunghezzadei frammenti

Alleli identificati dall’ibridazionesu Southern

Possibile interpretazione dei risultati

I

II

III

1 2 3 4

1 2

1 2 3 4 5 6 7 8

I1 I2 I3 I4II1 II2

III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8

&

By NA 12

due individui, tre enzimi

Gel Filtro corrispondente

La sonda viene testata sul filtro dove e’ stato trasferito il DNA di due soggetti non imparentati. Il DNA e’ stato digerito con tre enzimi in tre reazioni distinte.

B=BamHI E= EcoRI H=HindIIILe tre corsie del gel hanno un aspettodiverso: B presenta un accumulo nella parte alta del gel, E ed H sono piu’ omogenei. Questo dipende dal quantospesso l’enzima trova la sua sequenza bersaglio e quindi se i frammenti sono piu’ o meno lunghi. La digestione B di Kwa non e’ particolarmente riuscita: c’e’ una “sfrangiatura” che segnala la presenza DNA parzialmente indigerito, inoltre la quantita’ di DNA caricata e’ superiore a quella dell’altro soggetto (la luminosita’ e’ piu forte).

Dopo ibridazione si vede che la sonda si e’ legata a frammenti di lunghezza diversa:e che i soggetti hanno gli stessi siti E ed H, mentre sono diversi per B.

By NA 13

due individui, tre enzimi

Gel Filtro corrispondente

B=BamHI E= EcoRI H=HindIII

Evidentemente c’e’ un sito B polimorficoperche’ un soggetto e’ omozigote per 2.8e l’altro per 13. La lunghezza dei frammenti mi permette di costruire unamappa di restrizione e di mappare lasonda rispetto ai siti. La differente quantita’ di DNA fra i due campioni e’evidente dalle diverse dimensioni del segnale

H E B B*E H B

10KB 13KB3.7KB2.8

E’ quindi presente un polimorfismo, probabilmente frequente nella popolazione: infatti se prendendo due individui a caso nella popolazione trovo due eterozigoti e’probabile che gli eterozigoti siano frequenti. Per gli altri due siti non si puo’ dire se siano polimorfici o no: due individui sono troppo pochi per escluderlo.

By NA 14

SNPs

L’allele XT e XC sono distinguibilidopo digestione con TaqI. L’amplificato e’ di 1241 bp dopo digestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande

La sostituzione di una base puo’ provocare la perdita o l’insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell’amplificato si puo’ rapidamenteevidenziare l’avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc..

Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta1241bp

750bp

491bp

XCXC XCXT XCXC XCXC

By NA 15

SNPs

L’allele XT e XG sono distinguibili dopo digestione con PvuII. L’amplificato e’ di 1392 bp dopodigestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande: 1163 e 229

Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta

1392bp1163bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

La banda di 229 non si vede

1, 2, 4, 7, 8 sono eterozigoti X TXG

3,9, 12 sono omozigoti X TXT

5,6,10, 11 sono omozigoti X GXG

By NA 16

SNPs

L’allele YT e YC sono distinguibili dopo digestione con HgaI. YT non si digerisce e rimane di 220 bp, YC origina due bande 180bp e 40bp (che non si vede)

Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta

220bp180bp

C0 1 2 3 4 5 6 7

C0 controllo senza DNA :il bianco e’ importante nella PCR come il marker3 omozigote Y TYT - 1, 4, 6, 7, omozigoti Y CYC - 2, 5 eterozigoti Y C YT

By NA 17

VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL

1 2 3

Caricamento su gel

SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism

Omozigote W ild-type OmozigoteMutante

PCR

Eterozigote

Omo WT Omo mutetero

Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza doverricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazionidi singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb.

Denaturazione

Reverse

Forward

Reverse

Forward

CGCG

CGAT

ATAT

CG

CG

CGAT

ATA

T

C

G

A

T

By NA 18

DHPLC

By NA 19

Il materiale didattico e’ presente in rete:http://www.dipartimentodibiologiabari.it/didatticaNON sono dispense, ma un ausilio allo studio sullibro