By NA 1 Diagnosi Prenatale II. By NA 2 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome)...

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Diagnosi Prenatale II

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CROMOSOMI MARCATORI(Extra Structurally Abnormal Chromosome)

• Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza

• Frequenza alla nascita 0.14-0.72/1000• Difficile correlazione genotipo-fenotipo

in diagnosi prenatale• Importante il rilievo della

caratterizzazione molecolare

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In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette:

• Invdup15 (50% ESAC)

• Cromosomi sessuali

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Amniocentesi paziente di 41 aa

Presenza di un ESAC in tutti i cloni

de novo piccole dimensioni

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CBG positivo DA/DAPI positivoFISH centromero 15 positiva

Invdup(15)

Definizione del tipo

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FISH sonde pericentromeriche(D15S11; GABR3) NEGATIVA

Invdup(15) tipo I

Assenza di anomalie del fenotipo

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Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine

postzigotica del marcatoreMaterna Paterna

s. Prader/Willi s. Angelman

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D15S130 D15S165

P F M P F M

Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE

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ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE

CON MARCATORI POLIMORFICI DEL

CROMOSOMA 15

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Amniocentesi paziente di 35 aa

Presenza di un ESAC

de novo piccole dimensioni

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CBG positivo DA/DAPI negativoFISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa

Rischio alterazioni fenotipiche 5%

Ecografia/Ecocardiografia

Riduzione rischio di 1/3

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Paziente in gravidanza di 31 aa

Riscontro ecografico NT aumentata

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Toshiba Instruments

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NT aumentata

rischio aneuploidie

Prelievo villi coriali a 11 settimane

Presenza di ESAC de novo piccole dimensioni, bisatellitato

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FISH 13,14,15,21,22

Positiva per centromero 22

invdup(22)

Cat/Eye syndrome

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Cat Eye syndrome

Malf. orecchio 86%Malf.anorettali 81%Malf. urogenitali 71%Coloboma occhio 61%

Altre Malformazioni

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Cat Eye syndrome

Malformazioni cardiache62%

di cui 1/3 Anomalie del Ritorno Venoso Polmonare

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Cat Eye syndrome

RITARDO MENTALE ??

Severo 7%Moderato/lieve 47%

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Cat Eye syndrome

Assenza di correlazioni tra estensione/regioni geniche presenti nel cromosoma invdup(22) ed anomalie del fenotipo

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Cat Eye syndrome

CES Tipo I vs CES Tipo II non ha utilità dal punto di vista clinico

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Mosaicismo

• Amniocentesi cellule dall’epiblasto della massa cellulare interna.

• Villocentesi – Coltura a breve termine cellule del trofoblasto.

• Villocentesi – Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario).

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MOSAICISMO

• I Livello: singola cellula

• II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone

• III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni

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Liquido Amniotico Mosaicismi

• Livello I 2.5-7 %

• Livello II 0.7-1.1 %

• Livello III < 0.2 %

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MOSAICISMO

• PSEUDOMOSAICISMO

• MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion)

• MOSAICISMO VERO

La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali

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Mosaicismo trisomia 11

Paziente di 29 anniIndicazione: familiarità s. Down

Cariotipo fetale

46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone)

Mosaicismo II livello

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Linee Guida work-upModerato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni.

Flask

• Cr. Sessuale sovra-numerario (SC,MC)

• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SC, MC)

• 45,X - Monosomie (MC)

• Alt. bilanciate (MC)

• Marcatore (SC)

In situ

• Cr. Sessuale sovra-numerario (SCo,MCo)

• Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SCo, MCo)

• 45,X - Monosomie (SCo, MCo)

• Alt. bilanciate (MCo)

• Marcatore (SCo)

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Estensione analisi a 41 cloni

Cariotipo 46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni)

Mosaicismo III livello

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Liquido AmnioticoMosaicismi - Livello III

• Conferma sino al 40 % alla cordocentesi ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e 90% (cr. sessuali) al follow-up

• Tipo di Cromosoma (es. ESAC)

• Utilizzo e limiti della Cordocentesi

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• Solo 2 casi in letteratura, con bassa frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche

• Rischio s. Beckwith-Wiedemann da disomia uniparentale 11

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Meccanismi UDP

• Complementazione gametica

• Recupero dello zigote trisomico

• Duplicazione mitotica

• Errore post-zigotico

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DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11

Regione 11p15.5 eterodisomia paterna

Alterata espressione di geni da imprinting genomico

2 casi di s. Beckwith-Wiedemann

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DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11


P F M P F M P F M

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• Esame citogenetico:Cariotipo 46,XY (150 metafasi)

Attesa Fenotipo nella norma(follow-up a 24 mesi)

• Screening molecolare con microsatelliti cromosoma 11:

Esclusione UDP

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Paziente di 40 anniIndicazione: età

Cariotipo fetale

46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni)

Mosaicismo III livello

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Solo 3 casi in letteratura:- 2 con bassa frequenza ( 10%),

apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche

- 1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno buon follow-up

- Problema UPD

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Mosaicismo trisomia 4Counselling

• Ecografia/Ecocardiografia fetale• Prelievo sangue funicolare per esame

cariotipo ed esclusione UPD

In caso di interruzione:Esame citogenetico su tessuti diversi

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• Ipoplasia cerebellare

• Ventricolomegalia borderline

Fetal MRI

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CAV completo

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• Micrognazia• Ipotelorismo

• Deformità rachide (emivertebre)

• s. atresia esofagea

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Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA UNIPARENTALE


D4S243 D4S175

P CF M P CF M

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Diagnosi Malattie DNA

• Numero elevato malattie• Numero elevato di mutazioni (es.

Fibrosi cistica)• Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite

pigmentosa)

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Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti

Conoscenza gene/i

• Identificazione della specifica mutazione

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Conoscenza geni

Mendeliane

• Talassemia• Fibrosi cistica• Chorea di Huntington• Distrofia di

Duchenne

Complesse(loci suscettibilità)

• ApoE Alzheimer• 19p13;Xq24 Cefalea• 12q;2q Diabete NID• 3q21 Psoriasi

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Conoscenza geni

8000 malattie

geni noti 30%

(60-70% pazienti)

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Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti

• Conoscenza gene/i implicati

Identificazione della specifica mutazione

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Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)

•Una delle più comuni malattie genetiche dell’infanzia

•Ubiquitariamente diffusa nel mondo

•Colpiti pressochè esclusivamente maschi

•Ereditata come malattia recessiva X-linked

Si manifesta con debolezza muscolare progressiva. I muscoli mostrano una pseudo-ipertrofia, molto evidente nel polpacci: in realtà le fibre muscolari sono rimpiazzate da tessuto grasso/adiposo.

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DIAGNOSI DMD

• Progressiva perdita muscolare e debolezza.

• Ridotta contrazione muscolare.

• Incurvamento della colonna vertebrale.

• Posizionamento doloroso delle articolazioni.

• Difficoltà nei movimenti quotidiani.

livelli CK

Biopsia muscolare

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DIAGNOSI DMD • ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi):

– PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene.– Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi– Si diagnostica la delezione quando un prodotto di amplificazione è assente in due separate reazioni di amplificazione.

• ANALISI COMPLETA DEL GENE:– Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche, sino al sequenziamento diretto.– Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.

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MULTIPLEX P.C.R.

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DIAGNOSI DMD

Paziente di 27 anni in gravidanzacon fratello affetto da DMD

Analisi Fratello

Delezione degli esoni 45-52

Studio familiare di linkage

(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

Paziente Portatrice della Mutazione

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DIAGNOSI DMD

Paziente 27 anni portatrice in gravidanza

Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane

90% dei villi 10% dei villiESTRAZIONE DNA (se possibile)

Analisi molecolare Analisi cariotipocon PCR multipla

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DIAGNOSI DMD

Paziente di 23 anni in gravidanza

con due nipoti deceduti per DMD

Studio familiare di linkage

(Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

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DIAGNOSI DMD

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DIAGNOSI DMD

Paziente non Portatrice dell’Aplotipo associato alla DMD

DIAGNOSI PRENATALE

NON NECESSARIA !!!

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DIAGNOSI DMD

Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane)con due figli affetti da DMD

Analisi Figli

No Delezione degli esoni

Studio di linkage

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DIAGNOSI DMD

Aplotipo fetale ricombinante

Rischio DMD

per il feto: 14%(62/79 esoni derivano

dal materno normale)

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Fibrosi cistica

1000 variazioni di sequenza

- 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi

Caucasici 70% F508

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31 Mutazioni

più frequenti

D.R. = 80%

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Caratterizzazione clinica complessa

Ragazza 17 anni

Alla età di 12 anni:

Iridi stellateRitardo mentale s. WilliamsPersonalità cocktail party

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SINDROME DI WILLIAMS

• Dismorfismo faciale (“elfin facies”)

• Ritardo di crescita pre e postnatale

• Deficit cognitivi (alt. integrazione spazio-visiva); lieve RM

• Stenosi aortica sopravalvolare, s. polmonare, difetti di setto, prolasso mitrale

• Ipercalcemia infantile

DELEZIONE 7q11.23 gene ELN

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