By NA

Citogenetica II

La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith

By NA

La CML è stata la prima malattia neoplastica dell’uomo in cui una specifica anomalia del cariotipo, il cromosoma Philadelphia (Ph), sia stata associata alla insorgenza della leucemia.

CML, Leucemia Mieloide Cronica

By NA

cromosoma non normale

chr Philadelphia (1961)

Nel 95% dei casi di CML

Indagini FISH E MOLECOLARI

SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE:- ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta)- BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare)

ABL

BCR

ABL/BCR

BCR/ABL

CML, Leucemia Mieloide Cronica

Traslocazione reciproca braccio lungo chr.9 e il braccio lungo chr.22: t(9;22)(q34;q11).

By NA

(Ph)

FISH nella CML 3 spot

By NA

(Ph)

FISH nella CML colocalizzazione

By NA

FISH nella CML 4 spote colocalizzazione

By NA

CML esempi

By NA

CML esempi

By NA

INVERSIONE inv(16)(p13;q22) (CBFB-MYH11)

AML, Leucemia Mieloide Acuta

By NA

AML, Leucemia Mieloide Acuta

By NA

Esempio dell’uso di librerie totali per evidenziare riarrangiamenti

Traslocazioni complesse in AML

t(8;13;14)

By NA

La traslocazione t(15;17)(q22;q21) è associata clinicamente alla leucemia acuta promielocitica (APL)

Leucemia Acuta Promielocitica (APL) geni coinvolti PML-RAR)

In verde chr17In rosso chr15

15 der15 der17 17

By NA

t(15;17)(q22;q21)

La FISH permette di trovare traslocazioni criptiche (quelle che non si vedono dall’analisi del cariotipo)

Leucemia Acuta Promielocitica (APL)

15 der15 der17 17

By NA

t(8;14)

Linfomi Non Hodgkin

by GP&NA

By NA

TRASLOCAZIONE t(14;18)(q32;q21)Linfomi Non Hodgkin

catene pesanti

immunoglobuline

oncogeneBCL2

By NA

Caso I

Paziente 38enne all’inizio della gravidanza decide di ricorrere alla diagnosi prenatale sotto indicazione del consulente genetico che l’ha informata dell’aumentato rischio di aneuploidie cromosomiche fetali nelle madri con età avanzata.

Due precedenti gravidanze dalle quali ha avuto due figli fenotipicamente normali.

Assenza di aborti spontanei.

traslocazione reciproca t (13;19) nel feto

traslocazione reciproca t (13;19) nel padre

By NA

Procedura diagnostica

ANALISI CITOGENETICA:

campione di liquido amniotico aspirato con l’amniocentesi;

allestimento del preparato citogenetico e analisi del cariotipo;

traslocazione reciproca t (13;19) nel feto

By NA

campione di sangue periferico di entrambi i genitori ;

allestimento del preparato citogenetico e analisi del cariotipo;

Procedura diagnostica

traslocazione reciproca t(13;19) nel padre

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH I

13.3

13.2

13.1

12

12

13.1

13.2

13.3

13.4

13

der(19)

19

13

12

11.2

12

13

14

21

22

31

32

33

34

13.3

13.2

13.1

12

12

13.1

13.2

13.3

13.4

19

14

21

22

31

32

33

34

13

12

11.2

12

13

14 13.3

der(13)

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH II

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH III

Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.

individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre tre segnalisegnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.

per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.  

Cy3Cy3

Fluor-XFluor-X

Cy5Cy5

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH IV

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH V

RP11-84C17

RP11-298C17

RP11-19I2

chr19:7,777,647-777,8013

chr19:9,998,865-10,195,739

chr19:11,643,368-11,816,255

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VI

Il breakpoint sul cromosoma 19 è situato tra la sonda prossimale RP11-52O9 e la sonda distale RP11-717H11.

der(13)chr 19

der(19)chr 19

chr19:6,726,912-6,917,544

chr19:7,163,629-7,377,296

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VII

13.3

13.2

13.1

12

12

13.1

13.2

13.3

13.4

RP-1152O9

RP11-717H11

RP11-717H11

13

12

11.2

12

13

14 13.3

RP-1152O9

der(13)der(19)

19

13.3

13.2

13.1

12

12

13.1

13.2

13.3

13.4

19

14

21

22

31

32

33

34

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH VIII

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH IX

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH X

La sonda RP11-976L2 emette fluorescenza sul cromosoma 13 e sul der(13) (freccia rossa).

La sonda RP11-1140C18 emette invece tre segnali : sul cromosoma 13, sul der(19) (freccia verde) e sul der(13) (freccia verde).

IL BREAKPOINT SUL CROMOSOMA 13 CADE ALL’INTERNO DEL BAC 1140C18

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH XI

13

12

11.2

12

13

14

21

22

31

32

33

34

13.3

13.2

13.1

12

12

13.1

13.2

13.3

13.4

19

14

21

22

31

32

33

34

13

12

11.2

12

13

14 13.3RP11-1140C18

RP11-1140C18RP11-976L2

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH

Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.

individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre segnalitre segnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.

per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.  

Cy3Cy3

Fluor-XFluor-X

Cy5Cy5

By NA

Evidenziare i breakpoints mediante la FISH

Dopo aver individuato la regione sul cromosoma 13 e sul 19 presumibilmente coinvolta nella traslocazione, selezionare i corrispondenti BAC da utilizzare per la FISH.

individuare i BAC che vengono tagliati dal breakpoint; in questo caso dovrei avere tre segnalitre segnali: uno sul cromosoma normale e un segnale su ciascun derivativo.

per abbreviare i tempi si puo’ eseguire una coibridazione marcando contemporaneamente due o tre sonde di DNA con diversi fluorocromi.  

Cy3Cy3

Fluor-XFluor-X

Cy5Cy5