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LINEE GUIDA LINEE GUIDA PER LA CITOGENETICAPER LA CITOGENETICA

Dicembre 2005Dicembre 2005Dicembre 2005Dicembre 2005

INDICAZIONI ALL’ANALISIINDICAZIONI ALL’ANALISI

Età materna >/= 35 anniEtà materna >/ 35 anniPrecedente figlio affetto da anomalia cromosomicaGenitori portatori di anomalia strutturale dei cromosomi geneticamente bilanciatageneticamente bilanciataGenitori con riscontro citogenetico di mosaicismo cellulareAnomalie fetali osservate in ecografiaTest biochimici indicanti un aumento del rischio cromosomicoMalattia genetica

Situazioni particolari devono essere valutate singolarmente con appropriata consulenza multidisciplinare che valuti i rischi generici del caso in oggetto ed i rischi connessi con il prelievo di celluledel caso in oggetto ed i rischi connessi con il prelievo di cellule fetali

Il completamento dell’iter diagnostico può richiedere l’estensione d li i i it idegli esami ai genitori

ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICOCELLULE DA LIQUIDO AMNIOTICO

Per ogni liquido amniotico vanno allestite non meno di tre colture primarie, da mantenere in due diversi incubatori

E’ buona norma usare due diversi tipi di terreno o due lotti diversi dello stesso terreno, per eliminare i rischi di contaminazione delle lt / it ll lcolture e/o scarsa crescita cellulare


L t di d l i ti it li d ll l i ti dLo studio del cariotipo va eseguito analizzando cellule provenienti da un minimo di due colture primarie

Per il metodo in fiasca vanno esaminate almeno 16 cellule derivanti da due colture indipendenti ed in cui sia cresciuto un minimo di 10 colonie in totalecolonie in totale

Per il metodo in situ vanno esaminate almeno 10 metafasi, una per colonia, provenienti da 2 o più colture indipendenti


Indipendentemente dal metodo di coltura utilizzato devono essere li l 4 f i li ll di i l i i f ianalizzate almeno 4 metafasi, con un livello di risoluzione non inferiore

alle 320 bande per il riconoscimento degli omologhi e con ricostruzione del cariotipo, di cui 2 su stampa fotografica o con sistema di analisi dell’immagine

In caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero diIn caso di mosaicismo è necessario aumentare il numero di metafasi/colonie analizzate esaminando altre colture ed eseguire un cariotipo per ogni linea cellulare trovata


I di b d i it ll l è bilitàIn caso di scarso bandeggio e scarsa crescita cellulare è responsabilità di chi firma il referto dare le adeguate spiegazioni sui limiti del referto

Si consiglia di non processare tutte le colture allestite per la diagnosi ma mantenere in vitro come riserva una piccola aliquota di cellule da utilizzare per ulteriori indagini Ciò evita la ripetizione del prelievoutilizzare per ulteriori indagini. Ciò evita la ripetizione del prelievo

ANALISI DA CELLULE ANALISI DA CELLULE DIDI VILLO CORIALEVILLO CORIALE

L’analisi citogenetica dei villi coriali può essere eseguitaL analisi citogenetica dei villi coriali può essere eseguita

Con metodo diretto

Le cellule del citotrofoblasto, che sono in divisione spontanea, vengono analizzate dopo una breve incubazione

Con metodo della coltura

Il villo viene disgregato con tecniche meccaniche o enzimatiche g gper permettere il rilascio di cellule dal mesenchima

Queste proliferano in coltura e vengono utilizzate dopo circa una settimana di colturasettimana di coltura

Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le g ppmetodiche


Per una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodichePer una diagnosi affidabile è opportuno utilizzare entrambe le metodiche

Possono, infatti, verificarsi situazioni di discrepanza tra

Il cariotipo osservato da metafasi ottenute con metodo diretto e quello osservato in metafase ottenute con metodo da coltura

Il cariotipo osservato su villo coriale e quello osservato su altri tessuti fetali

Se la quantità di villo coriale è inferiore a 10 mg, insufficiente per entrambe le metodiche è preferibile optare per il metodo diretto perchéentrambe le metodiche, è preferibile optare per il metodo diretto perché esclude il rischio di analizzare cellule di origine materna


MODALITA’ DI ANALISI (METODO SINGOLO)MODALITA DI ANALISI (METODO SINGOLO)

Nell’analisi del cariotipo si contano almeno 16 metafasi e analizzando 4 metafasi per riconoscimento degli omologhi e ricostruzione cariotipo, di cui due su stampa fotografica o con analisi di immagine

L’eventuale presenza di un mosaico richiede l’esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare

Nel caso del metodo da coltura si consiglia di analizzare metafasi provenienti da più aree di crescita ottenute da almeno due coltureprovenienti da più aree di crescita ottenute da almeno due colture indipendenti


MODALITA’ DI ANALISI (COMBINAZIONE DEI METODI)MODALITA DI ANALISI (COMBINAZIONE DEI METODI)

Per l’analisi del cariotipo vanno analizzate 4 metafasi, con un livello di risoluzione non inferiore alle 320 bande, mediante l’appaiamento degli omologhi, 2 di queste con ricostruzione del cariogramma su stampa fotografica o con sistema di analisi di immagineg g

Per la definizione del cariotipo si devono analizzare in totale almeno 16 f i i i d i i b l di hmetafasi provenienti dai preparati con entrambe le metodiche

L’eventuale presenza di un mosaico richiede l’esecuzione di almeno unL eventuale presenza di un mosaico richiede l esecuzione di almeno un cariotipo per linea cellulare ed il confronto dei risultati ottenuti con entrambe le metodiche

ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA SANGUE FETALECELLULE DA SANGUE FETALE

L’indagine citogenetica prenatale su sangue fetale viene eseguita l i di i l i i di i isolo in presenza di particolari indicazioni

Riscontro tardivo di condizioni ad alto rischio diRiscontro tardivo di condizioni ad alto rischio di anaomalia cromosomica

Malformazione fetale evidenziata ecograficamente

Controllo di mosaicismo cromosomico e/o anomalieControllo di mosaicismo cromosomico e/o anomalie strutturali riscontrati su amniociti o su cellulee di villi coriali

ANALISI ANALISI DIDI CELLULE DA SANGUE FETALECELLULE DA SANGUE FETALE

Per l’analisi del cariotipo del feto vanno contate almeno 16 metafasi, 4 devono essere analizzate con appaiamento degli omologhi duedevono essere analizzate con appaiamento degli omologhi, due delle quali con ricostruzione del cariotipo su stampa fotografica o con sistema di analisi computerizzata.

Nel caso di controllo di mosaicismo precedentemente riscontrato su amniociti o cellule di villi coriali devono essere contate almeno 100amniociti o cellule di villi coriali devono essere contate almeno 100 cellule

Se il numero di metafasi analizzabili non fosse elevato, per la diagnosi citogenetica si dovrebbe fare riferimento alla tabella di esclusione di mosaicismo cromosomico ed al relativo grado di confidenza (Hook 1977)

La risoluzione del bandeggio non può essere inferiore a 550 bandeLa risoluzione del bandeggio non può essere inferiore a 550 bande

MOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALEMOSAICISMO IN DIAGNOSI PRENATALE

Il mosaicismo cromosomico rappresenta uno dei principali problemiIl mosaicismo cromosomico rappresenta uno dei principali problemi diagnostici nella determinazione del cariotipo fetale sia da villi coriali che da liquido amniotico

Mosaicismo fetale vero

Mosaicismo confinato alla placenta (CPM)Mosaicismo confinato alla placenta (CPM)

Pseudomosaicismo

Possono avere origine da

Errore mitotico postzigotico precoce in un embrione diploide normalenormale

Un fenomeno di ricostituzione della disomia da un concepimento trisomico


VILLI CORIALI

Il mosaicismo cromosomico può presentarsi in tre distinte situazioni

I. L’anomalia cromosomica a mosaico risulta presente solo nel citotrofoblasto, cioè osservata nelle metafasi ottenute con il metodo diretto e non in quello da coltura

II Il cariotipo anomalo a mosaico si osserva solo nella componenteII. Il cariotipo anomalo a mosaico si osserva solo nella componente mesenchimale del villo, indagabile con il metodo colturale e non nel citotrofoblasto

III. La line a cellulare anomala è presente sia nel citotrofoblasto che nel mesenchima


VILLI CORIALI

Il riconoscimento di una condizione di mosaicismo nei villi corialiIl riconoscimento di una condizione di mosaicismo nei villi coriali richiede generalmente una conferma nel secondo trimestre

Nel caso in cui la linea cellulare anomala sia confermata si è in presenza di un mosaicismo vero, nel caso contrario si ha un CPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziatoCPM o un mosaicismo a basso livello non evidenziato

Differenze nel cariotipo delle diverse componenti nell’unità feto‐placentare vengono osservate nell’1‐2% dei prelievi di villi coriali


LIQUIDO AMNIOTICOQ

Si possono evidenziare tre livelli di mosaicismo

I. Presenza di singola cellula con anomalia numerica e strutturale osservabile con una frequenza che varia dal 2,5 a 7 % nelle colture di amniociti

II. Due o più cellule con la stessa alterazione provenienti da una l i fi i l l i iù l i lcoltura in fiasca oppure singola colonia o più colonie anomale

osservate in una singola coltura in situ. Si è stimata una frequenza pari allo 0,7 – 1,1 %

III. Più metafasi o colonie osservate in almeno due preparati provenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture inprovenienti da due colture in fiasca diverse o da due colture in situ indipendenti


LIQUIDO AMNIOTICO

I livelli I e II sono comunemente definiti come pseudomosaicismo

Il livello III mosaicismo fetale vero

La condizione di mosaicismo fetale vero osservata in prelievi di liquido amniotico è un fenomeno raro

DISOMIA UNIDISOMIA UNI--PARENTALE (UPD)PARENTALE (UPD)

E’ l’ereditarietà di due cromosomi omologhi da un solo genitore

E’ causata generalmente da eventi di non‐disgiunzione, seguiti da meccanismi di correzione di trisomie o monosomie

E’ associata, sembrerebbe, all’età materna e può venire individuata inizialmente in forma di trisomia a mosaico durante la diagnosi

t l i l di li i di illi i li h l diprenatale, sia nel caso di prelievi di villi coriali che nel caso di liquido amniotico

Traslocazioni Robertsoniane e cromosomi marcatori soprannumerari sembrano associate ad un rischio aumentato di UPD

DISOMIA UNIDISOMIA UNI--PARENTALE (UPD)PARENTALE (UPD)

INDICAZIONI PER LO STUDIO DI UPDINDICAZIONI PER LO STUDIO DI UPD

Estensione dell’indagine citogenetica a più tessuti fetali nei casi di osservato mosaicismo per escludere un mosaicismo fetale vero

Esecuzione del test in tutti i casi in cui sia evidenziata la presenza

Trisomia a mosaico per il cromosoma 15, in quanto è stata dimostrata la correlazione tra UPD materna e paterna e l’espressione di fenotipi patologici come sindrome di Prader‐Willi e la sindrome di Angelmanpatologici come sindrome di Prader Willi e la sindrome di Angelman

Trisomia a mosaico per i cromosomi 7, 11 e 14 per la provata esistenza di regioni di questi cromosomi sottoposte all’imprinting correlata alla manifestazione di fenotipi patologicimanifestazione di fenotipi patologici

Traslocazione coinvolgente i cromosomi 14 e 15

REFERTAZIONEREFERTAZIONE

1. L’intero referto deve essere scritto su carta intestata del laboratorio in cui è stata eseguita l’analisi

2. Deve essere riportata la data del prelievo e di arrivo in2. Deve essere riportata la data del prelievo e di arrivo in laboratorio del campione

3. La data del referto deve essere quella in cui si chiude e si firma l’ li i NO f ti li i il’analisi. NO referti preliminari

4. Identificazione del paziente con cognome, nome, data di nascita e numero di accettazione, codice paziente nel laboratorio

5. Indicare il tipo di tessuto

6 L’i di i ll’ li i ò f lt ti6. L’indicazione all’analisi può essere facoltativa

7. Il cariotipo fetale deve essere scritto secondo ISCN 95 e sue successive modifiche

REFERTAZIONEREFERTAZIONE

8. La formula del cariotipo sia normale che patologico deve essere accompagnata da una descrizione comprensibile anche ai non specialisti

9. Il referto deve contenere una descrizione dei metodi utilizzati. In particolare per analisi su villi coriali va chiaramente indicato l’eventuale utilizzo di entrambe le metodiche (diretta ol eventuale utilizzo di entrambe le metodiche (diretta o coltura)

10. Va segnalato il numero di colonie, aree, metafasi e il numero delle colture indipendenti analizzate. Per i villi coriali deve essere specificare la provenienza del preparato. Il numero delle metafasi è facoltativo

11. Ogni analisi va firmato dallo specialista responsabile diretto dell’analisi, con nome stampato.

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