Citogenetica 2

La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Analisi del cariotipo

sangueperiferico

terreno dicoltura

48-96h

proliferazione

colchicina(ultimi 30’)

centrifugazione

pelletrisospeso

Ipotonica (20’)

centrifugazione

pelletrisospeso

fissativo

centrifugazioni (2-3)

fissativorisospensionein poco fissativo

allestimento delpreparato

Allestimento del preparatofitoemoagglutinina(stimola la crescita)

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Analisi del cariotipo

Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.

Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi

C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabilidei cromosomi 1,9,16,Y

Metodi colorazione differenziale

1-3 gruppo A 4-5 gruppo B

X-6-12 gruppo C

13-15 gruppo D 16-18 gruppo E

19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G

Cariotipi a confronto

utilizzando la mostarda di quinacrina......QM-banding pattern

DAPI e QM

C-bande

G-bande

G QM G QM

HSA1HSA1

HSA14HSA14

R-bande

1) Allestimento della coltura

2) Preparazione dei vetrini

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Analisi del cariotipo

by GP&NA

Ottimama…..

by GP&NA

Puo’essere anche cosi’...Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche dacontare.Scartare! (potendo)

by GP&NA

.. O cosi’ Troppo contrattipero’ si puo’ usareper contarli.Scartare! (potendo)

by GP&NA

Selezione delle metafasi

Sufficiente Si possono contarePuo’ essere utile peranalizzare i cromosominon sovrapposti

Discreta

by GP&NA

Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,si possono analizzare

Selezione delle metafasi

by GP&NA

Selezione delle metafasi

Buona Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,la morfologia deicromosomi e’buona

1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO

2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’

3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE

by GP&NA

Come si fa il cariotipo?

10

1611

9

46

by GP&NA

Fare il cariotipo

CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio)

by GP&NA

Cariotipo ordinato

Diagramma

46,XX - cariotipo normale Femminile

46,XY - cariotipo normale Maschile

Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:- numero totale dei cromosomi (46)- sesso dell’organismo

47,XY,+21Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)

46,XX,del(14)(q23) del=delezione

46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione

46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)

Terminologia

doppia elicadi DNA

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T

osservazionedel vetrino

A T C G G T A T C C T A

T A GG C A T A G G A T

denaturazione

cromosomasul vetrino

sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo

ibridazione della sonda suicromosomi denaturati sul vetrino

ATC G G

TAT C C T A

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A TTT A GG C A T A G G A

FISH

A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T

A T C G G T A T C C T A

T A GG C A T A G G A T

denaturazione

Principio della fluorescenza

by GP&NA

filtro di emissione

specchio dicroico

filtro

di e

ccitazio

ne

obiettivo/condensatore

fotografiaCCD camera

Lampada a vaporidi mercurio

Elaborazione alcomputer

FISH : microscopio a fluorescenza

Osservazioneal microscopio

Cromosomi 1. denaturati2. colorati con DAPI

by GP&NA

FISH: metafase in DAPI

Sonde puntiformifluorescenti

FISH: segnali

Sovrapposizione dell’immagine della sonda sull’immagine del DAPI

FISH: merge

SONDE PER FISHSONDE PER FISH

DAPIDAPI

SONDASONDA

MERGEMERGE

WCWCPPWCWCPP

PCPCPPPCPCPP

DAPIDAPI

SONDASONDA

MERGEMERGE

BAC chr1BAC chr1 BAC chrXBAC chrX

SONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMI

COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE

PUNTIFORMI PUNTIFORMI

COIBRIDAZIONE DI 3 SONDECOIBRIDAZIONE DI 3 SONDE

PUNTIFORMIPUNTIFORMI

COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE

PUNTIFORMI CON WPCPUNTIFORMI CON WPC