Significato dell’analisi citogenetica e citogenetico ... · di citogenetica convenzionale...

Gennaio 2006 Volume 6 Numero 1 Trends in Medicine 33

Rassegna

Significato dell’analisi citogenetica e citogenetico-molecolare nella diagnosi e nella prognosi delle

neoplasie ematologiche

Maria Ciccone, FrancescoCavazzini, Gianluigi CastoldiSezione di Ematologia, Dipartimento diScienze Biomediche e Terapie AvanzateUniversità degli Studi di Ferrara

Maria CicconeSezione di Ematologia, Dipartimento diScienze Biomediche e Terapie AvanzateUniversità degli Studi di FerraraVia Savonarola 944100 FerraraTel +39.0532203091e-mail: [email protected]

Cytogenetics and molecular cytogenetics in diagnosis and prognosis ofhematologic malignancies

SummaryConventional Cytogenetic Analysis along with molecular cytogenetics techniques (e.g. Fluorescence in situHybridization, FISH) greatly contributed to the identification of recurrent chromosomal abnormalities in hema-tologic malignancies, often related to clinical and pathological features. Thus, cytogenetic analysis could beconsidered an essential tool to correctly define the diagnosis and the prognostic risk in many tumors. Theknowledge of chromosomal and molecular abnormalities led to the elucidation of ethiopathogenetic mecha-nisms which cause a loss of control in self-renewal, apoptosis and proliferation and gave the basis for thedevelopment of gene-targeted therapy .

Ciccone M, Cavazzini F, Castoldi G. Cytogenetics and molecular cytogenetics in diagnosis and prognosis ofhematologic malignancies. Trends Med 2006; 6(1):33-47.© 2006 Pharma Project Group srl

Key words:cytogeneticsFISHhematologic malignancies

Lo studio delle aberrazionicromosomiche nelle malat-

tie oncoematologiche rappre-senta ancor oggi il modello at-traverso il quale può essere rag-giunta l’identificazione di un“marcatore” di malattia di altis-simo valore clinico-prognostico,spesso in grado di spiegare al-cune caratteristiche biologichedelle cellule tumorali e quindistimolare valide ipotesi per untrattamento mirato.Sono ormai descritte numerosealterazioni citogenetiche in cor-so di malattie ematologiche, al-cune delle quali hanno assuntoun preciso significato diagnosti-co-prognostico.

Aspetti Metodologici

La ricerca nell’ambito della ci-togenetica (studio dei cromoso-mi) e della biologia molecolare(lo studio, strutturale e funzio-nale, dei geni e dei loro trascrit-ti) ha fornito alcune valide me-

todiche di studio, col fine prin-cipale di identificare difetti delDNA in grado di spiegare lapatogenesi e la fisiologia dellamalattia tumorale.L’Analisi Citogenetica Convenziona-le (ACC) consiste nello studiomicroscopico dei 23 cromoso-mi umani, permettendo una va-lutazione della ploidia cellulare(alterazioni numeriche, ad es.:trisomie, monosomie) e l’even-tuale identificazione di aberra-zioni cromosomiche ricorrenti,siano esse bilanciate (cioè avven-gano senza perdita netta di ma-teriale genomico), come moltetraslocazioni, o sbilanciate (cioècon perdita netta di materialegenomico) quali le delezioni1. Ilmateriale di studio è rappresen-tato dalla popolazione del tes-suto tumorale: sangue periferi-co o midollare nel caso esistauna componente leucemica ocellule ottenute da separazionedi tessuto linfonodale (sindro-mi linfoproliferative) o altri tes-

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M. Ciccone, F. Cavazzini, G. Castoldi

suti più raramente sede di ma-lattia (cute, mucose).Il vantaggio principale dellaACC risiede nella visione adampio spettro che immediata-mente si ottiene in base alla ana-lisi della morfologia e del ban-deggio dei singoli cromosomi.Aberrazioni numeriche qualicopie aggiuntive o mancanti diun determinato cromosomavengono immediatamente iden-tificate, e più generalmente èsempre possibile stabilire il gra-do di ploidia della cellula. Inol-tre, le peculiari caratteristicheottenute per mezzo del bandeg-gio cromosomico con colora-zione citochimica (da cui deri-vano rispettivamente il bandeg-gio G, da Giemsa, e R da “Re-verse”, figura 2) o fluorescente(bandeggio Q da Quinacrina)rendono ogni coppia di omolo-ghi identificabile in maniera in-controvertibile: questo rendepossibile l’identificazione di fe-nomeni quali le traslocazioni,cioè lo scambio di parte delDNA genomico da un cromo-soma ad un altro.I limiti principali della metodicarisiedono nel fatto che l’analisidel bandeggio implica l’acquisi-zione e la lettura di un certonumero di metafasi (standardiz-zato in almeno 20), che nonsempre è possibile raggiungere.In determinate patologie, infat-ti, l’indice di proliferazione neo-plastica è estremamente basso,rendendo quasi impossibile la ri-cerca di un adeguato numero dimetafasi in tempi ragionevol-mente utili. Un esempio è for-nito dalla Leucemia Linfatica Cro-nica (Chronic Lymphocytic Leuke-mia, CLL), nella quale gli studidi citogenetica convenzionaleriportati alla fine degli anni Set-tanta rivelavano un cariotiponormale nella maggior parte deicasi, mentre l’unica anomalia ci-togenetica ricorrente, peraltro in

un numero limitato di casi, sem-brava essere un cromosoma ad-dizionale in q del 14 (14q+)2,3.L’introduzione di mitogeni spe-cifici per i linfociti B (es.: lipo-polisaccaride di E. Coli, LPS) haconsentito l’identificazione diun maggior numero di metafasicon anomalie ricorrenti4. Il ri-scontro della trisomia del cro-mosoma 12, unitamente alla de-lezione del braccio lungo delcromosoma 13, rappresentanole prime aberrazioni cromoso-miche ricorrenti per le quali ven-ne stabilito una chiara correla-zione con l’andamento clinicodella malattia5,6.La presenza di anomalie citoge-netiche ricorrenti ha condottomolti laboratori ad optare permetodi in grado di sganciarsi dalvincolo dell’analisi in metafase

e sfruttare il grande numero diinterfasi (nuclei) clonali per unacorretta stima di alcune possi-bili anomalie7,8.Tecnicamente questo è statopossibile mediante l’ibridizza-zione del DNA tumorale conoligonucleotidi di DNA ad altaomologia per determinate se-quenze bersaglio e marcati consostanze radioattive o fluore-scenti (in modo tale da poterlorendere riconoscibile all’esamemicroscopico in fluorescenzacome segnali luminosi, figura 1).L’ibridizzazione in situ con sondefluorescenti (Fluorescence In SituHybridization, FISH) è in gradodi garantire un gran numero diinterfasi analizzabili in funzio-ne di una sequenza “bersaglio”stabilita a priori. In questomodo, laddove la CCA identifi-

Figura 1. Principio dell’ibridizzazione in situ con sonde fluorescenti.Nel pannello in basso: esperimento con sonda a due colori identifi-cante il gene MLL sulla banda 11q23; le interfasi mostrano due allelidi MLL intatti (visibili come segnali di fusione). La metafasi mostra lasegregazione del segnale rosso dal segnale verde, indicante unatraslocazione del gene MLL.

DNAcellulare Sonda

denaturazione ibridazione

DNA ibrido

Ibridazione fluorescente in situ


Significato dell’analisi citogenetica e citogenetico-molecolare nella diagnosi e nella prognosi delle neoplasie ematologiche

ca un marcatore di malattia,esso, mediante FISH, può age-volmente essere monitoratosenza la necessità di valutare lemetafasi.In tempi più recenti sono statesviluppate metodiche che sfrut-tano il principio della ibridizza-zione applicato alla metafase:cioè tecnologie in cui l’analisidella metafase diviene funzionedella corretta ibridazione di de-terminate sonde fluorescenticon le loro sequenze omologhe.La “Comparative Genomic Hybri-dization” (CGH) sfrutta la com-petizione su metafasi normali dieguali quantitativi di DNA tu-morale e di DNA sano, marcatiin colori rispettivamente diver-si9. Si tratta quindi di una ibri-dizzazione che come substratoha metafasi normali e come son-de il DNA tumorale in toto incompetizione con DNA sano. Ilrapporto ottenibile fra l’intensitàdei due colori in fluorescenzariflette il rapporto fra DNA tu-morale e DNA controllo in de-terminate regioni cromosomi-che e viene misurato con unospecifico sistema di analisi com-puterizzata. In caso di sbilancia-menti quantitativi nel DNA tu-morale, l’intensità del colore del-la sonda ibridizzata sul cromo-soma indicherà una perdita o unguadagno in una determinatabanda, a seconda che vi si leghipiù o meno DNA tumorale. LaCGH si è rivelata utile nello stu-dio di perdite o guadagni di ma-teriale cromosomico, special-mente nei casi di malattie tumo-rali a cariotipo normale, ma unlimite risiede nel fatto che alte-razioni bilanciate del cariotipo(traslocazioni) non vengono ri-conosciute.La “Multicolor-FISH” (M-FISH)è un’altra metodica di ibridizza-zione fluorescente che sfrutta icriteri dell’analisi citogeneticaconvenzionale10. In questo caso,

le metafasi ottenute dal tessutotumorale vengono ibridizzatecon un pannello di sonde in gra-do di “colorare” in maniera spe-cifica ogni singolo cromosoma.La metodica riconosce trasloca-zioni a due o più vie, cromoso-mi “marcatori” non identifica-bili con il bandeggio, anomalienumeriche ed è solitamente ri-servata all’approfondimento disingoli casi a cariotipo comples-so non interpretabili con laACC.Negli ultimi anni, infine, il com-pletamento del sequenziamen-to del genoma umano ha favo-rito l’evoluzione di tecniche diibridizzazione impieganti matri-ci di cloni contenenti sequenzegenomiche determinate (arrays),allontanando lo studio delleanomalie geniche dall’osserva-zione morfologica del cromoso-ma e aprendo la strada alla co-siddetta “genomica”, lo studioglobale dell’assetto e dell’espres-sione genica nelle diverse malat-tie11.Verranno di seguito illustrati al-cuni dei più significativi esempidell’applicazione delle metodi-che di citogenetica convenzio-nale e molecolare in ambito on-coematologico.

Leucemia mieloidecronica

La Leucemia Mieloide cronica(LMC) rappresenta un disordi-ne mieloproliferativo derivantedalla trasformazione neoplasti-ca di una cellula staminale delmidollo osseo. La LMC si con-figura clinicamente come unamalattia contrassegnata da undecorso difasico, caratterizzato,nella fase iniziale (fase cronica)da elevata granulocitosi perife-rica e da un’espressione delcompartimento mieloide docu-mentato da un quadro midolla-re ipercellulare, e da una fase

terminale associata ad un incre-mento marcato degli elementiblastici (metamorfosi o crisi bla-stica) riproducente le manifesta-zioni di una forma leucemicaacuta. Il passaggio dalla fase cro-nica a quello di blastosi è annun-ciato da modificazioni clinicheed ematologiche quali l’incre-mento della splenomegalia, l’au-mento nel sangue periferico dielementi immaturi e della seriebasofila, l’occorrenza di anoma-lie citogenetiche secondarie qua-li la duplicazione del cromoso-ma Philadelphia, la trisomia delcromosoma 8, la trisomia delcromosoma 19 e l’isocromoso-ma 17q (figura 2).Nel 1960 venne per la primavolta descritta una anomalia cro-mosomica caratteristica dellaLeucemia Mieloide Cronica, de-scritta come delezione del brac-cio lungo del cromosma 22 edenominata cromosoma Phila-delphia in onore della città in cuifu scoperta12. Alcuni anni dopo,JD Rowley dimostrò come inrealtà il cromosoma Philadel-phia fosse uno dei derivativi diuna traslocazione bilanciata frail braccio lungo del cromosoma9 ed il braccio lungo del cromo-soma 22, indicata comet(9;22)(q34;q11) (figura 3)13.Questo tipo di traslocazionecomporta a livello molecolare iltrasferimento del proto oncoge-ne c-abl (un gene codificante peruna proteina ad attività tirosinochinasica normalmente localiz-zato a livello della banda q34 delcromosoma 9) in corrisponden-za di un ristretto segmento dicirca 6 kb del cromosoma 22, incorrispondenza della banda q11,designato “breakpoint clusterregion”, bcr. Il segmento bcr siviene a situare a livello della por-zione media di un gene di 130kb, denominato BCR. Per effet-to della rottura del gene BCR,la sua porzione centromerica



viene a giustapporsi alla sequen-za di DNA traslocata del geneABL, creando un gene chimeri-co BCR-ABL a livello del brac-cio lungo del cromosoma 22.Questo gene codifica per un tra-scritto di 8,5 Kb a sua volta tra-dotto in una proteina chimericadi 210 kD, dotata di una attivitàtirosino-chinasica esuberante, ingrado di sovvertire i circuiti fi-siologici di segnalazione intra-cellulare, col risultato di sposta-re l’omeostasi verso una iper-proliferazione incontrollata de-gli elementi della filiera mieloi-de. Clinicamente tale lesione ci-togenetico-molecolare corri-sponde ad un fenotipo notodalla metà del 1800 e caratteriz-zato da leucocitosi neutrofila,precursori mieloidi circolanti eneutrofili disfunzionali (la rea-zione citochimica della fosfata-si alcalina è di intensità ridotta),splenomegalia e una sopravvi-venza variabile da due a cinqueanni se non trattata14.Lo sviluppo di indagini citoge-netico-molecolari ad alta sensi-bilità e di applicazione alla rou-

tine diagnostica ha permesso dimonitorare la presenza di que-sto marcatore in funzione deltrattamento, cioè di ottenere unaprecisa quantificazione del clo-ne neoplastico in risposta allaterapia.Recentemente la sintesi di uninibitore della attività tirosino-chinasica della proteina di fusio-ne (STI571) ha reso possibile lanegativizzazione del marcatoreai test citogenetico-molecolari in

un elevato numero di casi, con-sentendo un incremento dellasopravvivenza15-18.

Sindromimielodisplastiche

La prima anomalia citogeneticaricorrente descritta in una seriedi sindromi mielodisplastiche(SDM) è stata la delezione in-terstiziale del braccio lungo delcromosoma 5 (figura 4)19. Il fat-to che sia stato possibile stabili-re una serie di correlazioni fracaratteristiche cliniche dei pa-zienti, quadro citologico e pro-gnosi (valutata come evoluzio-ne in leucemia acuta) giustifical’inserimento da parte della Or-ganizzazione Mondiale della Sa-nità (World Health Organiza-tion, WHO) di una entità deno-minata “sindrome da 5q-“ all’in-terno dei disordini mielodispla-stici20.Analogamente alla maggior par-te delle aberrazioni citogeneti-che riportate in ampie casistichedi mielodisplasie, l’aberrazionein 5q31 è rappresentata da unadelezione, cioè da perdita nettadi materiale cromosomico. Ingenere, la presenza di una dele-zione implica almeno tre consi-derazioni logicamente collegate:

Figura 2. In seguito alla traslocazione fra il braccio lungo del cro-mosoma 9 e il braccio lungo del 22 si forma il gene di fusione bcr/abl. La comparsa del cromosoma Ph segna la manifestazione clinicadella fase cronica della LMC. La comparsa di anomalie citogeneticheaggiuntive corrisponde alla evoluzione della malattia in crisi blastica.

Figura 3. Cariotipo 46, XX, t(9;22)(q34;q11).



a) selezionando un numero sta-tisticamente significativo di casi,è possibile identificare un seg-mento di DNA comunementedeleto? b) all’interno di questosegmento esistono sequenzecodificanti per geni con putati-vo potere oncosoppressore? e seè possibile identificare un talegene c) il restante allele è coin-volto in altri eventi mutazionali?Lo studio citogenetico e mole-colare delle mielodisplasie è sta-to incentrato soprattutto sull’ap-profondimento delle numerosedelezioni descritte in questi qua-dri patologici. Accanto alla sin-drome del 5q-, sono stati de-scritti altri quadri clinico-pato-

logici correlanti con specificheanomalie citogenetiche. La mo-nosomia del cromosoma 7 (o ladelezione parziale in 7q) è asso-ciata a una riduzione della so-pravvivenza e alla aumentatatendenza ad evolvere in leuce-mia acuta21-23; la delezione delbraccio lungo del cromosoma20 è stata riscontrata in circa il5% delle SMD24. Delezionimeno frequenti ma di chiaro in-teresse speculativo sono statedescritte a carico delle bande13q14 (gene RB) e 11q14-2125.La delezione in 17p13, con coin-volgimento del gene TP53, sem-bra essere più frequente nei casidi SMD secondaria26,27. Fra le

Figura 4. Cariotipo, con delezione del cromosoma 5 alla banda q31(vedi freccia) in un caso di MDS.

Aberrazioni non bilanciate Anomalie strutturali(acquisizione o perdita (traslocazioni bilanciate,

di materiale cromosomico) inversioni, inserzioni)

del(5q)-monosomia 5 Trisomia 8 t(1;3)(p36;q21)

del(7q)-monosomia 7 Trisomia 9 t(1;7)(q10;p10)

del(11q) Trisomia 19 inv(3)(q21;q26)

del(12p) Trisomia 21 ins(3;3)(q21;q21q26)

del(13q) t(3;3)(q21;26)

del(20q) t(6;9)((p23;q34)

monosomia X inv(16)(p13;q22)

monosomia Y t(16;16)(p13;q22)

del(16)(q22)

iso(17q)

Tabella 1. Anomalie citogenetiche maggiormente frequenti nelle Sindromi Mielodisplastiche.

anomalie numeriche, la trisomiadel cromosoma 8 (+8) rappre-senta quella più frequente insie-me alla monosomia del cromo-soma 728. Il significato progno-stico della +8 rimane controver-so rimanendo in un gruppo in-termedio fra la sindrome da 5q-e la monosomia del cromoso-ma 7 (tabella 1).Rappresentando evidentementeun gruppo patologico eteroge-neo, non è possibile distinguereun marcatore citogenetico dimielodisplasia. Un fattore di cuiè necessario tenere conto inol-tre è il fatto che, in casi di SMDcon andamento clinico sfavore-vole, l’area di sovrapposizionediagnostica con la leucemia acu-ta aumenta non solo a fronte dicriteri clinici, laboratoristici ecito-morfologici, ma anche afronte del maggiore riscontro dianomalie a prognosi sfavorevo-le tipiche delle leucemie acutemieloidi quali 5q-, 7q-, aberra-zioni di 11q23 e cariotipo com-plesso29.Qualora si considerino i risulta-ti della ACC, una sostanzialeporzione di casi di MDS presen-ta alla diagnosi un cariotipo nor-male. Questo può dipendere a)dalla effettiva assenza di anoma-lie cromosomiche; b) dalla pre-senza di cloni a basso indice pro-



liferativo (che cioè non garanti-scono un numero sufficiente dimetafasi analizzabili); c) dallapresenza di aberrazioni “cripti-che”, al di sotto del potere riso-lutivo del bandeggio. In questicasi, sulla base di una classifica-zione delle più frequenti aber-razioni cromosomiche nelleSMD e del loro significato pro-gnostico, metodiche in grado dieffettuare l’analisi su grandi nu-meri e di valutare l’assetto dispecifici loci sul DNA (es.: FISHcon sonde locus-specifiche)possono risultare di notevoleutilità.E’ stato dimostrato come unaparte di pazienti con SMD e ca-riotipo normale presentino, al-l’analisi in FISH, cloni di cellulecitogeneticamente anomali chepotrebbero giocare un ruoloimportante nella progressionedella malattia30.Metodiche più articolate quali laM-FISH, applicate ai casi diSMD a cariotipo complesso ealto rischio citologico, hannocontribuito ad evidenziare lapresenza di classiche anomaliead alto rischio, sottolineandocome cloni citogeneticamenteinstabili inevitabilmente evolva-no in leucemia acuta, con aber-razioni tipiche dei gruppi a pro-gnosi infausta31.

Il ruolo della citogenetica nelleSMD come indice di prognosi èstato ampiamente riconosciutosin dalla metà degli anni 80 ed èuna delle tre variabili (insieme adati cito-morfologici e clinici)del Sistema di Valutazione Pro-gnostica delle SMD (Internatio-nal Prognostic Scoring System,tabella 2)32-34.Inoltre è stato dimostrato cheanche l’evoluzione del cariotiponelle SMD (la comparsa di ano-malie secondarie nel corso dellamalattia) può avere un significa-to clinico35.

Leucemie acute

Il cariotipo rappresenta proba-bilmente il più importante indi-ce diagnostico e prognosticonelle Leucemie Acute Mieloidi(LAM)32,36,37. La World HealthOrganization (WHO) ha intro-dotto una rilevante distinzionefra due gruppi di LAM con dif-ferenti caratteristiche biologi-che: LAM insorgenti de novo eLAM secondarie a SMD o qua-dri simili (correlate a preceden-te trattamento chemioterapico),riconoscendo il valore primariodella ACC nella collocazione cli-nico-prognostica di alcuni grup-pi specifici di malattia (tabella3)20. La presenza di alcune tra-

slocazioni ben riconoscibili qualila t(15;17)(q22;q21), t(8;21)(q22;q22), t(16;16)(p13;q22)/inv(16)(p13q22) e le traslocazio-ni coinvolgenti 11q23 correlainfatti con quadri morfologici,immunofenotipici e clinici pecu-liari, tali da indirizzare con pre-cisione la corretta scelta del per-corso terapeutico. Inoltre, le di-verse aberrazioni cromosomi-che, strutturali e numeriche, e ilgrado di complessità del cario-tipo (più o meno di tre anoma-lie) sono state distribuite secon-do un ordine gerarchico in basealla correlazione con sopravvi-venza e risposta al trattamento(tabella 4)29.Il valore della analisi di bandeg-gio è in tutti questi casi diagno-stico. Metodiche semplici e ri-producibili di citogenetica mo-lecolare (FISH) e di biologiamolecolare (Polymerase Chain Re-action, PCR) sono in grado digarantire un attento monitorag-gio della massa di malattia du-rante il trattamento.Numerosi studi38-41 hanno mes-so a confronto la sensibilità diACC e FISH nel rilevamentodelle anomalie citogenetiche acarattere prognostico significa-tivo nelle LAM insorgenti de novonell’adulto. Ne è emerso che peralcune anomalie l’indagine cito-

INDICE PROGNOSTICO INTERNAZIONALE

Punteggio 0 0.5 1 1.5 2

Blasti (%) < 5 5-10 - 11-20 21-30

Cariotipo * Prognosi Prognosi Prognosibuona intermedia severa

Citopenia ** 0/1 2/3

SCORE PER GRUPPO DI RISCHIO

Basso Intermedio 1 Intermedio 2 Elevato0 0.5-1 1.5-2 2.5

* Prognosi buona (cariotipo normale, -Y, del5q, del20q); severa (anomalie del cromosoma 7 e cariotipocomplesso); intermedia (+8, coinvolgimento 1 o 2 cromosomi);** Citopenia valutata empiricamente (classi 0, 1, 2, 3).

Tabella 2. MDS International Prognostic Scoring System.



Tabella 3. Classificazione WHO delle Leucemie Acute Mieloidi e comparazione con il sistema Franco-Americano-Britannico (FAB).

WHOLeucemia Acuta Mieloide (AML)

( 20% blasti midollari)

Gruppo 1: AML con anomalie citogenetiche ricorrentiAML con t(8;21)(q22;q22), (AML/ETO)Leucemia Acuta Promielocitica cont(15;17)(q22;q12), (PML/RARá) e variantiAML con eosinofilia midollare e inv(16)(p13;q22) ot(16;16)(p13;q22), (CBF/MYH11)AML con aberrazioni di 11q23 (MLL)

Gruppo 2: AML con displasia multilinearePost-MDS o MDS/MPD (myeloprolipherative disease)Senza precedente fase MDS o MDS/MPD ma condisplasia in almeno il 50% delle cellule in 2 lineemieloidi

Gruppo 3: AML e MDS, therapy relatedAgenti alchilanti/radiazioniInibitori della Topoisomerasi IIAltre

Gruppo 4: AML, non altrimenti classificabiliAML, a minima differenziazioneAML, senza segni di maturazioneAML, con maturazioneAML, mielomonociticaAML, monoblastica/monociticaLeucemia eritroide acutaLeucemia megacarioblastica acutaLeucemia basofila acutaPanmielosi acuta con mielofibrosiSarcoma mieloide

FABAML (>30% blasti midollari)

e RAEB-t (>20% ma <30% blastimidollari)

(M2)M3, M3v

M4 eo

(M1, M2, M4, M5)

(Leucemia acuta trilineare)

M0M1M2M4M5a, M5bM6M7

Leucemia acuta bifenotipicaLeucemia acuta biclonaleLeucemia acuta indifferenziata

genetico-molecolare (FISH)possiede una sensitività netta-mente maggiore rispetto all’ana-lisi del bandeggio, essendo ingrado di individuare casi falsa-mente negativi alla citogeneticaconvenzionale. Questo in parti-colare è vero per alcune anoma-lie quali la inv(16)/t(16;16) e letraslocazioni di 11q23, special-mente nei casi in cui le metafasianalizzate dopo bandeggio pre-sentino una qualità sub-ottima-le38.Circa il 50% dei casi di LAM denovo presenta un cariotipo nor-

male alla ACC. In questi casi,l’applicazione della FISH è ingrado di rilevare anomalie geno-miche nel 3% circa dei casi38,41,permettendone la collocazionein determinate categorie di ri-schio. Lo studio dei casi a cario-tipo normale mediante metodi-che di biologia molecolare(PCR) ha inoltre dimostratocome eventi mutazionali a cari-co del gene FLT3 ricorrano nel25% circa delle LAM, spesso inassenza di alterazioni visibili alcariotipo e correlino in manieraaltamente specifica con una pro-

gnosi sfavorevole42,43. Di gran-de interesse è infine la dimostra-zione di alterazioni coinvolgen-ti il gene NUP9844.Anche lo studio dei casi di LAMsecondarie a cariotipo normaleha dimostrato come anomaliecitogenetiche al di sotto del li-mite di risoluzione della ACCpossano essere rilevate in FISHin circa il 30% dei casi45.Le Leucemie Acute Linfoblastiche(LAL) rappresentano un grup-po di patologie leucemiche, cioècon un’estrinsecazione princi-palmente a livello di midollo



osseo e sangue periferico, clini-camente caratterizzate dai sinto-mi derivati dalla occupazionedello spazio midollare (anemia,suscettibilità alle infezioni e dia-tesi emorragica). Al contrarioche per le LAM, non esistonodei reali criteri morfologici perla distinzione dei diversi tipi diLAL, che si basa invece sull’im-piego di un pannello di anticor-pi monoclonali per lo studiodell’immunofenotipo (tabella 5).

Aberrazioni cromosomiche Frequenza Prognosi

t(8;21)(q22;q22) ~12 Buona

t(15;17)(q22;q21) ~10 Buona

inv(16)(p13;q22) ~10 Buona

del(16)(q22)

t(9;11)(p22;q23) 5-6 Cattiva

inv(3)(q21;q26), t(3;3) 3-5 Non definite

t(1;3)(p36 ;q21)

del(11)(q23) Cattiva

t(6;9)((p23;q34) ~1 Cattiva

t(8;16)(p11;q13) <1 Non definita

t(1;7)(q10;p10) 1 Cattiva

t(3;21)(q26;q22) <1 Cattiva

Anomalie numeriche

+4, +11, +21 1-3 Non definita

+8, -5, -7 >40 Cattiva/pessima

Delezioni

5q, 7q, 12p, 20q >40 Cattiva/pessima

Tabella 4. Classificazione gerarchica delle anomalie citogenetiche nelle AML.

Tabella 5. Marcatori immunologici nelle Leucemie Acute Linfoblastiche.

Marcatori Citogenetica % %adulto bambino

B-ALL CD34 CD19 CD79a HLA-DR CD10 cm SIg

Pro-B + + + + _ - - t(4;11)(q21;q23) 10 8

B-common +/- + + + + - - t(9;22)(q34;q11) 25 3

t(12;21)(p12-q22) 2 22

Pre-B - + + + +/- + - t(1;19)(q23;p13.3) 3 5

B matura - + + + - - + t(8;14)(q24;q32) 4 2

T-ALL cCD3 CD3 CD7 TdT TcR CD1a CD4

Pro-T + -/+ + + + - - Traslocazioni di 9 3

Pre-T +/- + + +/- + - - 10q24 (geni HOX)

T corticale - + + -/+ + + + Traslocazioni 1p32 12 7

T matura - + + - + - + (TAL1)

Abbreviazioni: +: positività nei blasti; c: citoplasmatico

Citogeneticamente è possibiledistinguere lesioni ad alto ri-schio quali la t(9;22), le traslo-cazioni della banda 11q23 coin-volgenti il gene MLL, lesioni abasso rischio come un assettoiperdiploide del cariotipo e le-sioni a rischio intermedio comela t(1;19) (tabella 6)46. Tutte letraslocazioni portano alla for-mazione di un gene di fusione,il cui trascritto è verosimilmen-te in grado di interagire con se-

quenze geniche deputate alladifferenziazione e alla prolife-razione cellulare. Dal punto divista strettamente funzionalenella biologia del tumore, talilesioni non differiscono daquelle descritte nelle LAM e illoro monitoraggio (trattando-si del rilevamento o di un genedi fusione o di un trascritto difusione) è possibile sia in FISHsia con tecniche di biologiamolecolare. Un’eccezione è



rappresentata dalla t(12;21),un’anomalia non identificabilealla citogenetica convenzionalema rilevabile esclusivamentecon la FISH e definita quinditraslocazione “criptica”.La distribuzione delle lesioni ci-togenetiche nelle LAL del bam-bino e dell’adulto subisce alcu-ne modificazioni importanti dalpunto di vista prognostico (ta-bella 5): il 25% circa delle aber-razioni citogenetiche delle LALdel bambino è infatti rappresen-tato dalla t(12;21) con riarran-giamento dei geni ETV6 eCBFA2, mentre la traslocazio-ne t(9;22) con fusione dei geniBCR e ABL ricorre in un 6%circa dei casi; nelle LAL del-l’adulto il quadro si rovescia,con la fusione BCR-ABL pre-sente in circa il 25% dei casi e lat(12;21) in meno del 2% dei casi.Nel bambino risultano inoltrepiù frequenti il cariotipo iperdi-ploide e la t(1;19)/E2A-PBX1,mentre meno frequenti appaio-no le traslocazioni coinvolgentiil gene c-MYC sul cromosoma8 (tipiche delle forme linfopro-liferative B-cellulari ad alto gra-do denominate Linfoma di Bu-rkitt). Sia nelle LAL del bambi-no sia in quelle dell’adulto, iriarrangiamenti del gene MLL(banda 11q23) ricorrono conuna frequenza del 6-7% circa emantengono il significato pro-gnostico complessivamente ne-gativo valido anche per leLAM46.

Analogamente a quanto descrit-to per le LAM, la valutazionediagnostica delle LAL devecomprendere lo studio citoge-netico, specialmente nei casi diLAL del bambino in cui anoma-lie numeriche (iperploidia) sonopresenti in più del 20% dei casie posseggono un importantevalore prognostico. La FISH peril rilevamento dei riarrangiamen-ti di ETV6/AML1 e MLL do-vrebbe sempre essere eseguita,così come in tutti i casi in cuil’analisi del bandeggio non for-nisca risultati adeguati. Inoltre laFISH o metodiche di biologiamolecolare sono in grado di for-nire una valutazione quantitati-va del clone neoplastico nel cor-so del trattamento, in manieratale da valutare il grado di rispo-sta.

Disordinilinfoproliferativi

L’attuale classificazione dellepatologie linfoproliferative(WHO, tabella 7) si basa sul pre-supposto che ogni proliferazio-ne clonale trovi un corrispon-dente in appropriati elementi delpercorso istogenetico linfoide,nei quali il verificarsi di una le-sione genomica crea le condizio-ni per un vantaggio di crescitasulle restanti popolazioni bloc-cando il clone ad un determina-to stadio dello sviluppo20.Le anomalie citogenetiche ricor-renti nella patologia linfoproli-

Cariotipo Geni Coinvolti Prognosi

t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL Cattiva

t(12;21)(p12-13;q22) ETV6-AML1 Cattiva/Intermedia

t(4;11)(q21;q23) e altre MLL Cattivatraslocazioni di 11q23

t(1;19)(q23;p13.3) PBX1-E2A Intermedia

iperdiploidia - Buona

Tabella 6. Principali anomalie citogenetico-molecolari in corso di Leucemia Linfoblastica Acuta B cellularee loro significato prognostico.

ferativa cronica B cellulare tro-vano un esempio rappresenta-tivo nelle aberrazioni coinvol-genti la banda cromosomica14q32, dove è situato il locuscodificante per la porzione va-riabile delle catene pesanti delleimmunoglobuline (gene V

H). I

geni VH, D

H e J

H subiscono un

primo riarrangiamento a livellodi elementi B-cellulari immaturinel midollo osseo (figura 5). In-fatti, un riarrangiamento VDJ

H

funzionale è essenziale per unadifferenziazione delle cellulepro-B nel compartimento pre-B. Le cellule pro-B che non pro-ducono un riarrangiamentoVDJ

H funzionale vanno incon-

tro ad apoptosi e vengono fa-gocitate dai macrofagi. La dif-ferenziazione degli elementipro-B in pre-B è contrassegna-ta dall’espressione della TdT edalla acquisizione delle catenecitoplasmatiche mHC in più del95% delle cellule. Inoltre vengo-no “silenziate” le ricombinasi,RAG1 e RAG2, assicurandol’esclusione allelica del locus mdelle catene pesanti; le cellulevanno incontro ad una spintaproliferativa, al termine dellaquale le ricombinasi vengono ri-espresse per permettere il riar-rangiamento dei loci delle cate-ne leggere47.Questo permette l’espressionedel BCR sul linfocito B-imma-turo che viene “immesso” nelsangue periferico e può entrarenel parenchima linfonodale.



Qui, a livello di centro germina-tivo (figura 5) avviene la cosid-detta “maturazione per affinità”,nel corso della quale viene in-trodotto un certo numero di

Tabella 7. Classificazione WHO delle neoplasie linfoidi B-cellulari e comparazione con la classificazioneREAL e i criteri diagnostici FAB

WHONeoplasie B-cellulari

Linfoma/leucemiaLinfoblastica dei precursoriB-cellulari

B-CLL/Small LymphocyticLymphoma (SLL)

Leucemia prolinfocitica B(B-PLL)

LinfomaLinfoplasmocitoide

Linfoma a cellulemantellari

Linfoma Follicolare

Linfoma Splenico dellaZona Marginale (S-MZL);MZL extra-nodale, MALT;MZL linfonodale

Hairy Cell Leukemia

Mieloma Plasmacellulare/plasmocitoma

Linfomi B diffusi a grandicellule (DLBCL)

Linfoma B a grandi celluleprimitivo del mediastino

Leucemia/Linfoma diBurkitt

Primary Effusion B-cellLymphoma (PEL)

REALLinfomi B-cellulari

Linfoma/leucemiaLinfoblastica deiprecursori B-cellulari

B-CLL/ SLL

B-PLL

LinfomaLinfoplasmocitoide

Linfoma a cellulemantellari

Linfoma del CentroFollicolare:Grado IGrado IIGrado III

Linfoma della zonaMarginale (MZL):extranodaleMALTSplenico

Hairy Cell Leukemia

Mieloma Multiplo

DLBCL

Linfoma B a grandicellule primitivo delmediastino

Burkitt’s Lymphoma

DLBCL Burkitt-like

Citogenetica

t(9;22)(q34;q11)t(1;19)(q23;p13.3)t(4;11)(q21;q23)t(12;21)(p12-13;q22)

del(13)(q14)+12del(11)(q22-23)del(17)(p13)

t(9;14)(p13;q32)

t(11;14)(q13;q32)

t(14;18)(q32;q21)

del(13)(q14)traslocazioni 14q32

traslocazioni 3q27

t(8;14)(q24;q32)t(2;18)(p12;q24)t(8;22)(q24;q11)

Geni coinvolti

BCR-ABLPBX1-E2AMLL-AF4ETV6-AML1

Marker D13S25MDM2?ATMTP53

PAX5-IgVH

BCL1-IgVH

BCL2-IgVH

Rb

BCL6

c-Myc

mutazioni (<98% di omologiacon la sequenza germinale è co-munemente considerato il livel-lo di soglia per distinguerle dapossibili polimorfismi) nel gene

immunoglobulinico codificanteper la porzione variabile dellecatene pesanti (denominato V

H).

Dunque il riscontro di un geneV

H “ipermutato” (>2% di mu-



tazioni somatiche riscontrabili)indica che la cellula è andata in-contro ad una selezione antige-nica positiva nell’ambito di unarisposta immunitaria classica, T-dipendente. Un analogo proces-so di “ipermutazione somatica”riguarda anche i geni V

L48.

L’assenza di mutazioni somati-che del gene V

H indica che la

cellula non è passata attraversoil centro germinativo e quindi a)rappresenta un linfocito “vergi-ne”, b) è un elemento presen-tante un BCR già ad alta affinitàper un antigene, c) è un elemen-to selezionato attraverso l’incon-tro con antigeni che non preve-dono l’interazione con cellule T(es.: superantigeni).Risulta chiaro che una regionecromosomica altamente utilizza-ta sia nelle fasi di maturazioneprecoce (passaggio da linfocitopro-B a linfocito pre-B) che piùtardiva (centroblasto-centroci-

favorendone la trascrizione ab-norme; nel caso del LinfomaFollicolare, come risultato dellatraslocazione si ottiene una giu-stapposizione del gene BCL2, ilcui trascritto ha un potente ef-fetto antiapoptotico, con il pro-motore del gene V

H. In entram-

bi i casi, attraverso percorsimolecolari differenti (una pre-valente spinta iperproliferativanel primo caso e una prevalen-te resistenza all’apoptosi nel se-condo), si ottiene un vantaggiodi crescita del clone neoplasti-co.Le traslocazioni coinvolgenti14q32 nei linfomi sono state ini-zialmente studiate attraverso letecniche di citogenetica conven-zionale applicate a colture lin-focitarie da linfonodo. Lo stu-dio citogenetico del midollo os-seo raramente si rivela utile, inquanto la componente linfoma-tosa rimane prevalentemente li-

Figura 5. Linfopoiesi B e Linfomi B-cellulari. Nella parte inferiore del pannello sono illustrate le tappe didifferenziazione del linfocito B da elemento immaturo a plasmacellula; nella parte intermedia sonoillustrati i processi di uso e ipermutazione dei geni delle immunoglobuline; nella parte superiori i princi-pali tipi istologici di linfoma B sono posti in relazione con la loro controparte linfocitaria normale.

to) è significativamente piùesposta ad eventi mutazionali ingrado di sovvertire la fisiologiacellulare e promuovere l’indi-pendenza biologica di un clone.Anomalie della banda 14q32 siriscontrano con frequenza signi-ficativa in neoplasie linfoproli-ferative derivanti sia da elemen-ti precoci nella linfogenesi (Leu-cemia Linfoblastica Acuta e Linfo-ma di Burkitt) e sono rappresen-tate dalla traslocazionet(8;14)(;q32) con coinvolgimen-to dell’oncogene c-myc, sia de-rivanti da elementi linfoidi a li-vello di centro germinativo (Lin-foma Follicolare con traslocazio-ne fra la banda cromosomica14q32 e la banda 18, a livello delgene BCL2). Nel caso del Lin-foma di Burkitt, la sequenza diDNA derivante dalla trasloca-zione pone c-Myc in vicinanzadi un forte promotore (quellodel gene immunoglobulinico),



mitata alle stazioni linfonodali.L’analisi citogenetica su sangueperiferico e su midollo viene fa-cilmente eseguita qualora la pa-tologia linfoproliferativa posseg-ga una importante estrinsecazio-ne leucemica (Leucemia LinfaticaCronica, Linfoma a Cellule Mantel-lari, Hairy Cell Leukemia e piùraramente Linfoma Follicolare leu-cemizzato e Leucemia Plasmacellu-lare).Le tecniche di citogenetica mo-lecolare (FISH) si sono rivelateutili sia nella diagnosi di linfomiin cui la traslocazione di 14q32è considerata marcatore di ma-lattia (Linfoma Follicolare e Linfo-ma Mantellare), sia nello studiodi patologie in cui tali trasloca-zioni posseggono un significa-to prognostico importante (Mie-loma Multiplo, figura 6).Inoltre, l’analisi del locus V

H at-

traverso metodiche di biologiamolecolare (PCR) ha permessodi valutarne il grado di ipermu-tazione somatica e cioè di stabi-

lire se una determinata cellula èandata o no incontro a selezio-ne antigenica T-dipendente a li-vello del centro germinativo lin-fonodale. Secondo questo mo-dello, ogni patologia linfoproli-ferativa B può venire classifica-ta a seconda della percentuale dimutazioni somatiche del geneV

H in “pre-centro germinativo”

(<2% mutazioni somatiche) o“post-centro germinativo”(>2% mutazioni somatiche). Aldi là del valore speculativo-no-sografico, tale indagine ha per-messo di individuare, all’internodella Leucemia Linfatica Cronica(LLC), due sottogruppi, comu-nemente definiti “mutato” e“non-mutato” in riferimentoalla sequenza del gene V

H, con

comportamenti clinici estrema-mente divergenti. Il grado mu-tazionale del gene V

H è quindi

un marcatore prognostico indi-pendente nell’individuare LLC aprognosi severa (“non-mutate”)e LLC ad andamento clinico in-

dolente (“mutate”) e pertanto sene deve tenere conto unitamen-te alla valutazione citogeneticadi rischio nella pianificazione ditrattamento e monitoraggio deipazienti49,50.

Lo studio del genomanelle neoplasieematologiche

L’attivazione di percorsi mole-colari con un ruolo chiave nellaproliferazione e nella differen-ziazione cellulare determina ilcomportamento di ogni cloneneoplastico. Da quanto discus-so sinora, appare chiaro comele traslocazioni cromosomichee gli eventi mutazionali a caricodi determinati geni possano al-terare l’espressione di una innu-merevole serie di altri geni.Una delle più importanti con-seguenze di questa considerazio-ne è la possibilità tecnica di ana-lizzare l’intero genoma di untumore, al fine di chiarirne al-cuni aspetti della fisiologia mo-lecolare ed identificare in talmodo percorsi critici che po-trebbero rappresentare poten-ziali obiettivi per una terapiamirata.Il completamento della sequen-za del genoma umano e la regi-strazione dei cloni di DNA cor-rispondenti a specifici loci inbanche dati consultabili in reteha permesso lo sviluppo di tec-nologie innovative che, mante-nendo come principio basel’ibridizzazione di sequenze diDNA omologhe, sono in gradodi fornire informazioni circal’espressione genica nel cloneneoplastico.Nei “microarray” a DNA, le son-de sono rappresentate da fram-menti di cDNA generati permezzo di amplificazioni in PCRdi inserti cDNA in vettori qualiad esempio cloni artificiali bat-terici (Bacterial Artificial Clones,

Figura 6. FISH su preparato di midollo osseo. Segale rosso: 13q14,segnale verde: controllo, centromero chr. 10. Le plasmacellule sonoidentificate mediante immunofluorescenza con siero monoclonaleanti-catene leggere. Gli elementi plasmacellulari sono caratterizzatidalla presenza di un singolo segnale rosso (delezione 13q14). L’unicoelemento mieloide presente (nucleo reniforme) non presenta tale di-stribuzione anomala dei segnali.



BAC), che vengono fatti aderi-re all’interno di un pozzetto didimensioni microscopiche me-diante braccia robotiche. Que-sti cDNA risultano quindi“schierati” in file ordinate su unasuperficie di pochi centimetriquadrati.Il campione di studio può esse-re rappresentato virtualmenteda qualsiasi tessuto: risulta in-tuitivo che, occorrendo una cer-ta quantità di materiale con unabassissima percentuale di con-taminazione, neoplasie con unaestrinsecazione a livello di san-gue periferico siano un model-lo ideale. Dal campione si ottie-ne l’mRNA patologico, che do-vrà essere confrontato con ilmessaggero di un secondo cam-pione scelto come controllo.Entrambi i mRNA vengonotrascritti in cDNA (medianteuna transcriptasi inversa), mol-to più stabile dal punto di vistamolecolare, e quindi i cDNAvengono amplificati e ri-tra-scritti in cRNA e marcati conbiotina. In questo modo si con-sente un’efficiente ibridazionee rilevazione del segnale. I duemessaggeri marcati vengonoibridizzati sull’”array” contenen-te le migliaia di sequenze geni-che in file ordinate. Il preparatoè quindi sottoposto alla letturada parte di uno “scanner” ingrado di valutare le variazionidella fluorescenza emanata daciascun pozzetto e quindi di tra-durla in informazioni riguardan-ti il grado di espressione di queldeterminato trascritto. La com-parazione fra i livelli di espres-sione del campione in esame edel controllo consentirà di va-

lutare se singoli geni sono iper-espressi o down-regolati.Il numero di geni analizzati inquesto tipo di esperimenti su-pera comunemente i 20000, percui si rende necessario l’uso disofisticati programmi statistici ingrado di distribuire i dati secon-do algoritmi statisticamente si-gnificativi e riproducibili. Gene-ralmente i dati possono venireordinati secondo un’analisi “su-pervisionata” (“supervised lear-ning”), nel quale classi genichenote vengono delineate in mododa identificare precisamentegeni che correlano con caratte-ristiche quali il tipo di malattia oil decorso clinico, oppure secon-do un’analisi “non supervisiona-to” (“unsupervised learning”), in cuii campioni vengono raggruppatiunicamente in funzione del pro-filo di espressione senza tenereconto di qualsiasi informazionea priori11. Il metodo di analisisupervisionata è comunementeutilizzato per l’individuazione digeni che correlino con classi dimalattia note (es.: il gene ZAP70nelle LLC con geni V

H non

mutati)51, mentre l’analisi nonsupervisionata è usata per la di-stinzione di entità clinico-pato-logiche (es.: il profilo genico dif-ferente del Linfoma B-cellulareMediastinico a grandi cellule all’in-terno dei Linfomi B-cellulari Dif-fusi a grandi cellule)52,53 o l’identi-ficazione di una nuova tassono-mia basata sulla struttura diespressione genica di un grup-po di patologie (es.: gli studi di“arrays” applicati alle LeucemieAcute dimostrano come LAL eLAM con traslocazioni di MLLposseggano un profilo di

espressione genica simile tale dapoterle considerare una classe dimalattia omogenea)54,55.

Conclusioni

Nonostante lo sviluppo di me-todiche di analisi altamente so-fisticate, lo studio del cariotiporappresenta tuttora uno dei car-dini della diagnostica oncoema-tologica. Lo studio del bandeg-gio dei cromosomi, corretta-mente interpretato, affiancatoalla valutazione morfologica de-gli elementi patologici e ad unacorretta valutazione dell’immu-nofenotipo, risulta infatti indi-spensabile per l’identificazionedi molte entità clinico-patologi-che. Inoltre, esso fornisce infor-mazioni indispensabili circa l’in-quadramento prognostico ed iltipo di approccio terapeutico dautilizzare in ogni singolo caso.L’approfondimento con studi dicitogenetica molecolare (FISHe PCR) ha inoltre rappresenta-to un utilissimo strumento peril monitoraggio della rispostaalla terapia e della malattia mi-nima residua in gran parte dellemalattie oncoematologiche(LLC, Leucemie Acute)I numerosi recenti studi nell’am-bito della genomica hanno datorisultati incoraggianti e talvoltamolto importanti per la caratte-rizzazione di entità patologichecritiche (es.: LLC). Nonostantequesto, la complessità della va-lidazione dei risultati in questicasi, i costi e la riproducibilitàrappresentano ancora grossiostacoli all’introduzione di que-ste metodiche nella routine cli-nica.

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Significato dell’analisi citogenetica e citogenetico ... · di citogenetica convenzionale...

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