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Lezione 3

Test - Sreening - Acondroplasia

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Cos’e’ l’analisi analisi genetica

L’analisi individua il genotipo di individui a rischio per ben definite patologie. Oggi possono essere identificate anche prima della nascita piu’ di 300 malattie genetiche.

La maggior parte sono rare e l’analisi viene fatta solo quando c’e’ una indicazione precisa

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Cos’e’ lo screening

Lo screening genetico si effettua su una popolazione osu un gruppo di individui non imparentati.

Non si possono fare screening per tutte le possibili malattie: si effettua su una popolazione in cui una particolare patologia ha un’incidenza significativa: es.Tay-Sachs nei canadesi francofoni o negli ebrei orientali. L’anemia falciforme nel bacino mediterraneo, latalassemia.......

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Quando eseguire i test genetici I

Rischio noto di una particolare malattia in un feto o in sospetti portatori

Se la mutazione e’ gia’ nota perche’ si e’ studiato il precedente affetto e’ relativamente semplice. Se la patologia e’ recessiva le mutazioni da ricercare potrebbero essere 2

Se la mutazione non e’ nota la strategia e’ piu’ complessa e potrebbe non portare a dei risultati utili: come per CF. In questo caso si ricorre al linkage

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Quando eseguire i test genetici II

Screening nei neonati

La popolazione da testare e’ ben identificata

L’analisi e’ economica e rapida

E’ possibile anche nel caso degli affetti intervenire per impedire la comparsa della patologia: fenilchetonuria

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Quando eseguire i test genetici III

Confermare o smentire una diagnosi clinica: penetranza, eterogenita’ genetica, fenocopie

Identificare lo stato di portatore nel caso di patologie ad insorgenza tardiva o di suscettibilita’ a patologie tumorali

In futuro identificare geni che predispongono alla comparsa di patologie complesse

Confermare il coinvolgimento nella patogenesi di una malattia di un gene candidato clonato

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Premesse

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Premesse

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Quando non si e’ trovato niente di noto

Quando si sono testate le mutazioni gia’ note e non si e’ arrivatia definire la presenza della mutazione, prima di ricorrere alsequenziamento vero e proprio di tutto il gene, si puo’ ricorrere a tecniche per evidenziare differenze fra la sequenza normale e la mutata, anche senza conoscerne la sequenza (SSCP, DDGE....)Il principio su cui si basano e’ quello per cui una variazione anche diuna sola base modifica la conformazione del DNA in condizionisperimentali definite,o evidenziano grosse alterazioni della sequenza (delezioni, duplicazioni...) attenzione pero’ a variazioni polimorfiche

Polimorfismo: variazione la cui frequenza sia maggiore di 0,01(1%)

Eterozigosi media per il DNA genomico umano:~ 0,0037 (0,37%). Cio’ significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse

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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)

Prerequisiti: 1) Malattia mappata per poter identificare in banca dati marcatori il piu’ strettamente associati. 2) la struttura della famiglia e la disponibilita’ dei campioni devono permettere di ricostruire la fase.Tre fasi:

1) Distinguere i due cromosomi(aplotipi) del(i) gentore(i) che possono aver trasmesso il gene malattia2) Determinare la fase3) definire quale aplotipo ha ereditato il probando dai genitori

Questa logica si applica a fenotipi con qualunque tipo di ereditarieta’. L’informativita’ dei marcatori non e’ piu’ un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente informativi mappati su tutto il genoma. Il limite piu’ grosso e’ dato dalla struttura della famiglia

Non si puo’ fare l’analisi diretta della mutazione: gene non clonato o non sisono individuate mutazioni nella sequenza del gene

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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)Patologia dominante (espressivita’ variabile,

penetranza risotta, insorgenza tardiva)

1) richiesta del test

2) identificato un marcatore per cui II3 e’ eterozigote

I1 I2

II3 II4

III1 III2

2-1

3) identificare con quale allele segrega il fenotipo (fase)

I1 I2

II3 II4

III1 III2

2-1

2-4

4) identificare il genotipo di III2, analizzando lei e II4

I1 I2

II3 II4

III1 III2

2-1

2-4

1-3

Quali sono i risultatipossibili?

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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)

Risultati possibili

I1 I2

II3 II4

III1 III2

2-1

2-4

1-3

III2: 2-1 o 2-3 NON e’portatrice, perche’ in questa famiglia la regione mutata e’ identificata dall’allele 1

III2: 1-1 o 1-3 E’ portatrice, perche’ in questa famiglia la regione mutata e’ identificata dall’allele 1

ATTENZIONE: e’ importante la segregazione all’interno della famiglia e nonil particolare genotipo: se III2 avesse 2-1 cioe’ lo stesso genotipo della madre malata, non sarebbe portatrice

Patologia dominante (espressivita’ variabile, penetranza risotta, insorgenza tardiva)

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Strategie per seguire le tracce del gene (gene tracking)

L’informativita’ dei marcatori non e’ piu’ un problema: ci sono oggi microsatelliti altamente informativi mappati su tutto il genoma il limite piu’ grosso e’ dato dalla struttura della famiglia

Stesso fenotipo recessivo e segregazione in 4 famiglie diverse

Impossibile il test perche’ non c’e’ il DNA di riferimento dell’affetto

2-1 2-1

2-12-1

50%N, 50% affetto:non si puo’ definire di chi sono gli alleli ereditati dal feto. L’allele 2 del feto e’ lo stesso della sorella?

Nessuna previsione come prima

1-1 2-2

2-12-1 Normale 1-1Portatore 2-1

Affetto 2-2

L’errore diagnostico puo’ venire dalla ricombinazione che deve esserela piu’ bassa possibile

2-1 2-1

2-2

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Diagnostica I

le informazioni sulle malattie sono reperibili oltre che come PDF

anche direttamente al sito http://www.genetests.org: cliccare su

laboratory directory nella barra

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il sito

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il sito

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il sito

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Acondroplasia

Velazquez

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Acondroplasia IIl gene coinvolto in questa patologia e’ FGFR3 (Fibroblast

growth factor receptor-3), che mappa in 4p16.3 (telomero del

cromosoma 4), contiene 19 esoni, e’ lungo 16.5 Kb ed e’ l’unico le cui mutazioni siano state collegate all’acondroplasia.

Sembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo’ configurare come aumento di funzione

Il recettore ha 3 domini Ig-like, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico tirosinochianasico

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considerazione importanteSembra che il ruolo fisiologico di questo recettore sia quello di controllare

negativamente la proliferazione e il differenziamento nel centro di ossificazione. Le mutazioni avrebbero come risultato di mantenere sempre attivo il recettore e quindi il loro effetto si puo’ configurare come aumento di funzione

Bisogna sempre ricordare che la dominanza attiene al fenotipo

e quindi e’ l’effetto della mutazione sulla funzione del prodotto

che provoca la dominanza del fenotipo mutato sul wildtype.

Quindi l’effetto della mutazione dipende da:

quale e’ la funzione del wt: e’ sensibile alla dose sia in piu’ che in meno? e quindi: la mutazione provoca un aumento o una diminuzione dell’attivita’ del prodotto?

Questo vale per tutti i geni e i loro

prodotti !!!

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Acondroplasia II

Nel caso di una coppia in cui uno dei partner sia affetto, il rischio di ricorrenza e’ 50%, se entrambi sono affetti: 25% non affetti, 50% affetti, 25% letali per l’omozigosi.

Perche’ la diagnosi molecolare? per confermare un sospetto diagnostico per una diagnostica prenatale ( mosaicismo germinale)

Sembrerebbe collegata con aumentata eta’ paterna, proprio per il relativamente alto tasso di nuove mutazioni. Il mosaicismo germinale sembra essere la causa delle rare famiglie con ricorrenza

L’acondroplasia e’ una patologia originata ad un anormale sviluppo osseo. E’ una patologia autosomica dominante, oltre l’80% degli affetti hanno genitori con statura normale e sono originati da una mutazione de novo, quindi il rischio di ricorrenza e’ basso (attenzione al mosaicismo germinale)

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Acondroplasia III

Analisi di mutazioni note: sono note 2 mutazioni

patogenetiche che vengono ritrovate (una sola!) nel 99% degli affetti. Entrambe sono a carico del codone 380 al nucleotide 1138 e provocano, a causa della sostituzione della prima base della tripletta, la sostituzione di una glicina con una arginina nel dominio transmembrana G380R.

Nel 98% e’ una transizione G>A nell’1% e’ una trasversione G>C il restante 1% puo’ essere dovuto ad altri alleli rari:

G>T codone 375 glicina>cisteina A>G codone 650 lisina> glutamina (letale:nanismo thanatoforo).......

Per tutte la tecnica e’ la ARMS o analoghe: la sequenza wt e mutata sono note. E se non ci sono le mutazioni note? e si deve fare una diagnosi prenatale?

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Test per mutazioni note

Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS (Amplification Refractory Mutation System): si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTEin una i primer sono entrambi per la sequenza normale, nell’altra un primer e’ un ASO specifico per la mutazione.

Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si appaiano.

Di solito il test e’ multiplex utilizzando primer che permettano di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.

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1. I multiplex

Allele A M Allele B N Allele C N F508N Allele D N Allele E N

Allele A N Allele B N Allele C N F508N Allele D M Allele E N

Reazione 1 Reazione 2

DNA+ primer

A mB mC m

F508 n

Contr

D mE m

F508 MContr.

A MF508

nContr,

D MContr.

Reazione 1 Reazione 2

PCR

1 2

AMDM

508N

Contr.

CFTR

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Acondroplasia IV

Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e’ noto): e’ presente in altri soggetti sani della famiglia?

Sequenziamento tenendo presente che se si trova una mutazione:

Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?

Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si ritiene innocuo sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia? Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e’ accertato essere innocuo sulla funzionalita’ (come?)

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Acondroplasia V

Sequenziamento: si e’ risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi non si e’ trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire?

Il probando, chiaramente malato, ha una mutazione ad un altro locus, Diagnosi errata o il prodotto del secondo ipotetico locus interagisce con il primo e quindi il fenotipo e’ ugualeIl probando, chiaramente malato, ha una mutazione non visibile perche’ si manifesta durante la maturazione dell’RNA.

E quindi che faccio?

Nel caso dell’acondroplasia l’ecografia prenatale mi aiuta e non e’ il caso di ricorrere al linkage perche’ non esistono portatori “silenti”: la penetranza e’ totale e non c’e’ espressivita’ variabile.

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Acondroplasia VI

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Acondroplasia VII