By NA Lezione 2 Multicolor labeling - CGH. By NA.
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Lezione 2
Multicolor labeling - CGH
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Aberrazioni numeriche
Aberrazioni strutturali traslocazioni, inserzioni
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Sistema combinatoriale:
n=3 fluorocromi
2n-1=7 combinazioni
Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da Ried e coll. con l’impiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a sette sonde genomiche.
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MARCATURA COMBINATORIALE
RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi)
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• Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande colorate (Muller et al 1997);• MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per pseudobandeggio (Chudoba et al 1999);
• cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al 2001);
• M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000).
• M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996);SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996);COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi (Tanke et al 1999);
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M-FISH, SKY & COBRA (Multiplex-FISH,
Spectral KarYotyping & COmbined Binary RAtio labelling) :
finalità•analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un
approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R):
un singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo;•sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti
i riarrangiamenti cromosomici;•strumento di screening per l’identificazione di nuovi
riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio.
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M-FISH, SKY & COBRA:
applicazioni• Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e
double minutes;
• Corretta identificazione di traslocazioni quando il
pattern di bandeggiatura non è ottimale, o
in metafasi di scarsa qualità;
• Caratterizzazione di traslocazioni complesse.
• Identificazione di inserzioni cromosomiche.
• Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’.
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- Non e’ possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune pericentriche
- E’ difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei
telomeri
- Necessita’ di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti
perche’ possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole
duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono
regioni di dimensioni >3Mb
M-FISH, SKY & COBRA:
limiti
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Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma
A = RodaminaB = Texas RedC = Cy 5
D = FITCE = Cy 5.5 Esempio
Sistema combinatoriale: n=5 fluorocromi
2n-1=31 combinazioni
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M-FISHmethodology
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Si ottiene infine l’immagine totale combinando le informazioni delle acquisizioni effettuate con i sei filtri.
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Cariotipo complesso
Cariotipo con M-FISH
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Cariotipo con SKY
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Marker cromosomico
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Traslocazione complessa
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RATIO IMAGE FIRST BINARY IMAGE
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riarrangiamenti intracromosomici
marcatori con neocentromeri o privi di centromero
risoluzione: 3Mb
riarrangiamenti intracromosomici
riarrangiamenti tra più cromosomi
identificazione piccoli marcatori (<17p)
Limiti
risoluzione: riarrangiamenti submicroscopici telomerici
identificazione piccoli marcatori (<17p)
riarrangiamenti tra più cromosomi
due esperimenti sequenzialisingolo esperimentosingolo esperimentoVantaggi
M-TEL-FISHcen-M-FISHM-FISH/SKY/COBRA
conclusioni
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Conventional CGH
Rat
io
Position on Chromosome
Test Genomic DNA Reference
Genomic DNACot-1 DNA
gain deletion
TumourNormal
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RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO
10.8 1.2
Software per l’analisi delle immagini digitali
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Small cell lung carcinoma
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Array CGH
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Espressione genica
G3PDH
Sequenza ibridatata su mRNA
Northern Blot
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30,000 Geni30,000 Northerns
Northern Blot
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Test Genomic DNA
(Tumour DNA)
Reference
Genomic DNA
Rat
ioPosition on Sequence
Cot-1 DNA
Rat
io
Position on Chromosome
gain deletion
CGH su microarrays
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Chip fabrication
Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e con precisione.
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AA * *
AB * * *
BB * *
Chromosome
SNP 1 2 3 4 5 6 7
SNP array
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SNP array genoma maschile normale
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SNP array genoma esempio patologico?
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SNP array 3 delezioni?
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genitore - figlio 1/2
fratelli 1/2
zio - nipote 1/4
cugini primi 1/8
cugini secondi 1/16
Condivisione genoma
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Ricombinazione mitotica(MR)
Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936)
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Ricombinazione mitotica(MR)
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Ricombinazione mitotica(MR)
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Ricombinazione mitotica(MR)
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Ricombinazione mitotica(MR) origina una popolazione a mosaico
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UPD segnalata in alcuni tumori:
Breast Cancer
Retinoblastoma
Ulveal melanoma
Wilms tumour
Myeloproliferative disorders (9p)
Haematopoietic malignancies
SNP array nei tumori
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SNP array AML
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SNP array AML
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+ +
UPD