IMMUNOISTOCHIMICA§branca dell’istochimica in cui si ottiene la localizzazione di sostanze nelle cellule e nei tessuti con l’impiego di reazioni tra antigene e anticorpo

§Antigene è qualsiasi sostanza che, introdotta in un organismo, è capace di stimolare la produzione di anticorpi da parte dell’organismo stesso e di reagire specificamente con questi anticorpi

§Gli anticorpi sono molecole che un organismo produce in risposta ad un antigene e sono capaci di reagire specificamente con esso

ANTIGENE§ Perché una molecola funga da antigene occorre

che:§ contenga una porzione con struttura chimica diversa dalle

molecole proprie dell’organismo § abbia una massa sufficientemente grande

§ Aptene (o determinante antigenico) : § è la porzione caratteristica dell’antigene riconosciuta come

estranea dall’organismo e con cui reagiscono gli anticorpi specifici

§ aptoforo o “carrier’:§ la parte rimanente della molecola, aspecifica e in grado di

conferire all’antigene una dimensione sufficiente a stimolare la risposta anticorpale

§ Solo quando l’antigene è completo (aptene più aptoforo) è in grado di stimolare la risposta anticorpale

ANTICORPI§gli anticorpi constano di:

1) una porzione capace di legarsi all’aptene§ diversa per struttura a seconda dell’aptene

medesimo (frammento legante l’antigene o, ‘antigen binding fragment’, in sigla Fab)

2) una porzione costante per gli anticorpi di una medesima classe (in sigla Fc)

§gli anticorpi sono glicoproteine: i residui glicidici sono legati al frammento costante

CARATTERISTICHE DELLE CLASSI PRINCIPALI DEGLI ANTICORPI NELL’UOMO

Classe anticorpaleCaratteristiche IgM IgD IgG IgA IgECatene pesanti µ d g a eCatene leggere K o l K o l K o l K o l K o lNumero di unità costituite da 4 catene 5 1 1 1 o 2 1Percentuale del contenuto totale di Ig nel sangue 10 < 1 75 15 < 1

Attivazione del complemento ++++ - ++ - -Passaggio attraverso la barriera ematoplacentare - - + - -Stabilisce legami con macrofagi e neutrofili - - + - -Stabilisce legami con mastociti e basofili - - - - +

MATURAZIONE DEI LINFOCITI B

REAZIONE ANTIGENE ANTICORPO§ la reazione tra antigene e anticorpo avviene grazie a:§ congruenza della superficie molecolare tra i siti

attivi di entrambe le molecole § legami di tipo debole (ponti di idrogeno, forze di

van der Waals, attrazione tra dipoli)

§ la reazione tra antigene e anticorpo è specifica§ un antigene reagisce solo con gli anticorpi

prodotti in risposta ad esso e diretti contro di esso

§ un anticorpo reagisce solo con l’antigene dal quale è stato evocato e contro il quale è diretto

§La specificità della reazione tra antigene e anticorpo è paragonata a quella tra una chiave e la sua serratura.

PRODUZIONE DI ANTICORPI

§Per quanto riguarda la produzione degli anticorpi impiegati in immunoistochimica, si hanno a disposizione due possibili metodi:§produzione di anticorpi policlonali

§produzione di anticorpi monoclonali

§ Monoclonal antibodies for cancer. ADEPT, antibody directed enzyme prodrug therapy; ADCC, antibody dependent cell-mediated cytotoxicity; CDC, complement dependent cytotoxicity; MAb, monoclonal antibody; scFv, single-chain Fv fragment

MARCATURA DEGLI ANTICORPI

§ gli anticorpi contro un determinato antigene devono essere marcati con un composto riconoscibile al microscopio

§ si possono utilizzare: 1) fluorocromi (isotiocianato di fluoresceina o

di rodamina)

2) perossidasi di rafano, (HRP)

3) fosfatasi alcalina

4) ferritina

5) oro colloidale

6) Altro..

ALLESTIMENTO DI PREPARATI IMMUNOISTOCHIMICI

§i procedimenti da eseguire sui tessuti per dimostrare le molecole desiderate, possono essere:

§ Metodo diretto

§ Metodo indiretto

Varianti:

§ Metodo con immunocomplessi

§ metodo diretto con avidina biotina

§ Metodo indiretto con avidina biotina

§ Metodo indiretto con avidina biotina ABC

• La biotina (o vitamina H o vitamina B8) venne scoperta a seguito di alcuni studi riguardanti le alterazioni cutanee e della crescita che si verificavano in animali nutriti esclusivamente con albume d'uovo crudo o proteine da esso estratte.

• Il fattore responsabile della comparsa della "malattia da bianco d'uovo" venne individuato nel 1931

• Oggi è noto il fenomeno alla base di tale patologia: il legame tra la biotina e l'avidina (una glicoproteina dell'albume d'uovo).

• L'avidina è resistente all'azione proteolitica dell'appartato gastrointestinale per cui il legame con la biotina rende quest'ultima non assorbibile.

§L'avidina è una glicoproteina tetramerica che lega specificamente la biotina.

§L’avidina è un fattore antinutrizionale poiché agisce chelando la biotina che è presente negli alimenti costituiti da proteine di deposito, come uova e semi.

§Nell’uovo crudo la biotina è chelatadall’avidina; per rompere questo legame bisogna denaturare la glicoproteina con un'azione termica, la cottura, in questo modo viene liberata la biotina.

§L’avidina è cosi chiamata per l’avidità con cui tiene la biotina.

CONTROLLI DELLE REAZIONI IMMUNOISTOCHIMICHE§Alcuni esempi di controllo

§ trattamento del tessuto con il solo agente marcante§ trattamento del tessuto solo con il primo anticorpo§ trattamento del tessuto solo con il secondo

anticorpo (nel metodo indiretto)§ preadsorbimento dell’anticorpo con l’antigene

prima del trattamento del tessuto

§Solo nel caso che le reazioni di controllo della specificità siano negative si può accettare come specifico il risultato positivo di una reazione inimunoistochimica.