Selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, Metodi altamente specifici...
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• Selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo,
Metodi altamente specifici
METODI IMMUNOMETRICI
complesso analita-anticorpocomplesso analita-anticorpo
analitaanalita + anticorpoanticorpo
quantificazione delcomplesso analita-anticorpo
quantificazione delcomplesso analita-anticorpo
L’avidità del legame analita-anticorpo si misura con la costante di
affinità Kaff. Un anticorpo idoneo per lo sviluppo di metodi
immunometrici deve avere una Keq >109-1012 M-1
CH2HN CH2
CH2
CH2
NH
CH2
CH2
HOOC
HOOC
COOH
COOH
EDTA: acido etilendiaminotetracetico
KM-EDTA
AgEDTA3-
CaEDTA2-
FeEDTA2-
HgEDTA2-
107 M-1
1010 M-1
1014 M-1
1022 M-1
Complesso
METODI IMMUNOMETRICI
Per confronto, si riportano le costanti termodinamiche di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante poliamminocarbossilico, che forma complessi chelati molto stabili con numerosi ioni metallici
1942 Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluorescina.
1959 Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977.
1960 Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche.
1969 Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide.
1969 Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA).
1971 Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida.
1972 Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT).
1975 Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.
METODI IMMUNOMETRICI: STORIA
Caratteristiche fondamentali di un
anticorpo sono l’affinità (misurata in
termini chimico-fisici dalla costante di
equilibrio K) e la specificità (capacità di
riconoscere l’analita, distinguendolo da
molecole a struttura simile).Gli anticorpi
più comunemente utilizzati per lo sviluppo
di metodi immunometrici sono le
immunoglobuline G (IgG).
La regione variabile Fab è responsabile
del legame altamente specifico con
l’antigene; la regione costante Fc
CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI
catena pesante
catena leggera
variabile
costantelegam
e Ag
sito legam
e Ag
sito
Pontidisolfuro
catena L
catena H
Digestione con Papaina
Digestione con
Pepsina
Riduzione con Mercaptoetanolo
catena L
catena H
frammenti Fc
Fab Fab
Fc
F(ab’)2
Sono stati messi a punto
diversi protocolli di
digestione delle IgG che
permettono di ottenere
specifiche porzioni della
immunoglobulina.
CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI
epitopo
paratopo
CDR
antigene
ponte disolfuro intracatena
ponte disolfuro intercatena
frammento Fab
frammento Fc
frammento Fab
Catena H
Catena L
In dettaglio è mostrata la
porzione Fab dell’anticorpo,
con il sito di legame con
l’antigene.
CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI
macrofago
AntigeneT-dipendente
T linfocita
B B
IgM IgE IgG
B linfocita
IgG
AntigeneT-indipendente
CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE
IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita;IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene;IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari;IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi;IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.).
INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
L’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole.
Antigene Anticorpo
INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
ANTIGENE ANTICORPO
Ponti idrogeno
Legamiionici
Interazioniidrofobiche
Interazionidi Van der Waals
Legami ionici
INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
Forze non covalenti
Forze elettrostatiche
Legami idrogeno
Forze di Van der Waals
Forze idrofobiche
Origine
Attrazione tra cariche opposte
Lo ioni idrogeno condiviso tra gruppi diversi crea parziali cariche opposte
Le fluttuazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole generano polarità opposte su atomi vicini
I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevol-mente con l’acqua e tendono a raggrupparsi insieme per escludere le molecole di acqua. L’attrazione coinvolge anche forze di Van der Waals
Si tratta di polimeri con tasche di legame selettive per l’analita.
I polimeri sartoriali sono stati utilizzati per diverse applicazioni: metodi immunometrici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi, ecc..
POLIMERI “SARTORIALI” (I)
MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS
La scelta dei monomeri è critica per l’ottenimento di un polimero in
grado di legare con buona selettività ed affinità l’analita.
analita
monomerifunzionali
cross-linkercomplesso di
pre-polimerizzazioneanalita-monomeri
POLIMERI “SARTORIALI” (II)
MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS
POLIMERI “SARTORIALI” (III)
MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS
Vantaggi:
• Avidità e selettività di legame confrontabili con quelle
degli anticorpi;
• Elevata stabilità fisica
• Disponibili in quantità illimitate e stabili per lunghi periodi di
conservazione;
• Possibilità di utilizzare le particelle per impaccare delle
colonne per cromatografia di affinità.
POLIMERI “SARTORIALI” (IV)
MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS
Svantaggi:
• sono preparati in un solvente organico
• condizioni di polimerizzazione
• il processo di triturazione e setacciatura per ottenere particelle di
polimero nell’intervallo dimensionale desiderato è lungo e
laborioso e comporta una grossa perdita di polimero (circa 50%);
• rimozione dell’analita
POLIMERI “SARTORIALI” (V)
MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS
Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da) e in questo caso viene chiamato antigene, altrimenti deve essere coniugato con una macromolecola. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico.
COME SI OTTIENE UN ANTICORPO
L’antigene viene somministrato
Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)
• Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi,
mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si
ottiene un antisiero contenente anticorpi “eterogenei”
detti: policlonali.
• È possibile ottenere anticorpi “omogenei” detti:
monoclonali. Per questo occorre, dopo avere
immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di cellule B
attraverso la creazione di ibridomi.
ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI
PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI
Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali
IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma.
ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI
CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI
Vantaggi Svantaggi
Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti
Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene)
Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione
Tecniche di produzione più sofisticate
E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata
Non sempre reagiscono con la proteina A
Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare
Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene
Solitamente caratterizzati da elevata specificità
Spesso caratterizzati da bassa affinità
Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio:
ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del
complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura
dell’affinità dell’anticorpo per l’analita.
Anticorpi con Keq 108-109 L mol-1 sono adatti per lo sviluppo di metodi
immunometrici.
Ab An+ An-Abka
kd
Keq =[An-Ab]eq
[An]eq[Ab]eq
ka
kd
=
ASPETTI TERMODINAMICI
INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
Riprendendo l’equazione:
[An-Ab]eq
[An]eq
= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
SCATCHARD PLOT
si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq
Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene:
Keq =[An-Ab]eq
[An]eq[Ab]eq
ka
kd
=
[An-Ab]eq
[An]eq
= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero,
cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di
Scatchard,
SCATCHARD PLOT
anticorpi monoclonali
High affinity
Low affinity
Abt
Keq
SCATCHARD PLOT
anticorpi policlonali
[An-Ab]
[An
-Ab
]/[A
n]
Retta 1
Retta 2
Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima.
La retta 1 viene estrapolata per [An-Ab]eq che tende a zero.
La retta 2 viene estrapolata per [An-Ab]/[An]eq che tende a zero.
EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO
La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo:
• eterogeneità
• specificità
SCATCHARD PLOT
Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”.
In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi.
ANTIGENI ED APTENI
anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di
braccio spaziatore
anticorpi che riconoscono il carrier
anticorpi che riconoscono l’aptene
Sintesi derivato aptene
braccio spaziatore
aptene
carrier
+a) +
naphtalene antracenefenantrene
acenaphtene
acenaphtylene
fluorene
pyrenecryseneBenzo[a]anthracene
Benzo[a]pyrene dibenzo[a,h]anthracene
fluorantene
Benzo[e]pyrene
Benzo[k]fluoranthene
Benzo[b]fluorantene Indeno[1,2,3cd]pyrene Benzo[g,h,i]perylene
ANTIGENI ED APTENI
Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici
Specificità e struttura immunogeno
Posizione e tipo di
derivato utilizzato per la produzione dell’anticorpo
100% 40% 100% 100%100%
Scarsa specificità per mancanza anche dell’anello aromatico
L’anticorpo è molto specifico per il BaP e gli altri IPA
non interferiscono
[BaP μg/L
Seg
nal
e
0.001 0.01 0.1 1 10
Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). Si definisce reattività crociata la tendenza dell’anticorpo a legare gli interferenti.
Tipo di derivato e specificità dell’Anticorpo
Braccio spaziatore
aptene
proteina
HO
O
estrone
estrioloHO
OH
OH
HO
OH
C16
C17
Esempio: 17β-Estradiolo
proteina
Esempio: produzione di un anticorpo anti-estradiolo.
estradiolo
HO
OH
C6
C16
C17
SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI
estrioloHO
OH
OH
HO
O
estrone
3,8 1,2 %
5,6 2,0 %
48 8 %
Reattività crociata
40 10 %
5,0 1,8 %
0,48 0,27 %
estrone estriolo
C6
C16
C17
Derivatizzazione
La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno.
Metodi immunologici per ioni metallici
• Si produce un anticorpo contro un chelate metal-ion -protein: per esempio Me-EDTA-BSA
L’anticorpo non riconosce il metallo ma l’intero complesso Me-EDTA
MeҮ
Me + EDTA
proteina
GSH
Me
Ү• Si produce un anticorpo contro un
complesso Me-Proteina o Me-Molecola organica:
Il GSH , i suoi gruppi tiolici liberi legano fortemente il Hg(II).L’Anticorpo riconosce il complesso Me-GSH
Me + GSH
proteina
TRACCIANTI
La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile
Per esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore
E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile
An + Ab An-Ab
TRACCIANTI
La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità.
1 2 3
aggiunta reattivi
reazione
separazione liberolegato
analita
tracciante
Conc. analita
Tracciante legato
0 4 162
41
Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare:
• un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA)
• un enzima (enzyme immunoassay, EIA)
• un substrato enzimatico
• un coenzima o un inibitore enzimatico
• una molecola fluorescente o un quencher
Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato
rapporto segnale/massa.
TRACCIANTI
SCELTA DEL TRACCIANTE
Amplificazione enzimatica:1 molecola di enzima
1000 molecole di prodotto
Aumenta con:- attività enzimatica- rivelabilità del prodotto- amplificazione ciclica
Luminescenza
Analita—Enzima
Substrato
Prodotto
FotometriaFluorescenza
Analita—125I
emissione
1 disintegrazione/sec
molecole (106)
Analita—Chemilum.
Reaz. chimica
Ic h
Ic aumenta con: cl (resa quantica)f (rapporto molecole chemilum/analita)
Ic = f ccl cl
Analita—Fluoroforo
I0 h
If h’
If aumenta con: I0 (intensità del raggio di eccitazione) (coefficiente di estinzione)c (concentrazione)
If = I0 F cd
Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10-12-10-20 g) e facilmente rivelabile
TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONETRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE
SCELTA DEL TRACCIANTE
10-16 – 10-18I emissioneMolecola chemiluminescente
10-15 – 10-16I fluorescenteMolecola fluorescente
10-20 – 10-21Amplificazione ciclica enzimatica
10-15 – 10-18Fluorescenza
10-16 – 10-18Luminescenza
10-15 – 10-16AssorbanzaEnzima
0.1 – 10 x 10-15≈ 10.000 dpm125I
MASSA (moli/tubo)SEGNALETRACCIANTE
SCELTA DEL TRACCIANTE
TRACCIANTI LUMINESCENTITRACCIANTI LUMINESCENTI
10-20 moli (Bronstein et al. 1989)Fosfatasi alcalina/ adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato
10-18 moli (Tsuji et al. 1986)Glucosio 6-fosfato deidrogenasi / perossidasi / isoluminolo
< 10-15 moli (Kricka et al. 1987)
8x10-17 moli (Motsenbocker 1988)
Perossidasi / luminolo / enhancer
Enzima: chemiluminescenza
10-13 moli (Woodhead et al. 1982)Fluorescina
2x10-17 moli (Soini e Kojola 1983)Ioni europio (III)Fluorescenza
10-19 moli (Geiger e Miska 1987)
10-19 moli (Tanaka e Ishikawa 1986)
Luc / luciferina con amplificazione enzimatica
5.6x1016 fotoni/min/mg luciferasi (attività specifica) (Wulff et al. 1982)
10-18-10-19 moli (Schram et al. 1981)
Luciferasi da lucciola (Luc) / luciferina
Bioluminescenza
Limite di rivelazioneEsempiTipo di tracciante
Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante?
L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori.
E
S
La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante
L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante
METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Perché è possibile utilizzare un enzima come marcatore?
Occorre ottimizzare la strategia di preoarazone del tracciante, cioè
dell’antigene marcato.
La sintesi dell’immunogeno viene eseguita in modo da ottenere un
elevato rapporto di coniugazione aptene/proteina.
La sintesi del tracciante enzimatico viene condotta in modo
da ottenere un basso rapporto di coniugazione
aptene/proteina.
E
METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Un enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere:
• sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione
• sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o
l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA.
METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica
dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente
si esprime in unità per mg (U/mg).
Vantaggi relativi all’uso di enzimi:
• sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili;
• sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica;
• una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto;
• è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei.
Svantaggi relativi all’uso di enzimi:
• l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti;
• la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica;
• si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.
METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un
substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene
poi misurato tramite fotometria. L’uso di substrati fluorescenti o luminescenti
permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.
TRACCIANTI ENZIMATICI
Luminescenza2-naphthyl--D-galactopyranoside
Fluorimetria4-metilumbelliferone
Fotometria2-nitrofenolo-galattosidasi
LuminescenzaAMPPD
Fluorimetria4-metilumbelliferone-fosfato
Fotometria4-nitrofenilfosfatoFosfatasi alcalina
LuminescenzaH2O2/luminolo
FotometriaH2O2/cromogenoPerossidasi
METODOLOGIA ANALITICASISTEMA DI RIVELAZIONEENZIMA
ENZIMA
SUBSTRATO
PRODOTTO
L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile.
L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile.
I0 I
b
0I
IT bc
T
1logA
c
A
FOTOMETRIA
ENZIMA
SUBSTRATO
PRODOTTO
o-fenilendiammina 2,3-diamminofenazina (DAP)arancio max=492 nm
perossidasi
H2O2
FOTOMETRIA
Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare è il rapporto tra il
numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di
molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti):
dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di
rilassamento non-radiativo.
ENZIMA
SUBSTRATO
PRODOTTO
L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente.
L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente.
La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate
dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate,
successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in
eccesso sotto forma di fotoni.
RrRf
Rf
FLUORESCENZA
Assorbimentomolecolare
l1 l5
En
erg
ia
l1’ l5’
Conversioneinterna
Rilassamentovibrazionale
Fluorescenza
Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica
(diagramma di Jablonski)
FLUORESCENZA
La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da
potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato.
Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto
esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni.
CHEMILUMINESCENZA
Reagenti Intermedio [ Prodotti ]* Prodotti + hstadio 1 stadio 2 stadio 3
L'efficienza di un processo di chemiluminescenza, CL, è definita dalla relazione:
CL = fotoni emessi
molecole reagenti
Se Int = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio),
SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato)
Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni)
l' efficienza del processo di chemiluminescenza è: CL = IntSEEm
CHEMILUMINESCENZA
Ossidazione del luminolo (3-aminoftalidrazide) in ambiente alcalino mediante perossido d’idrogeno o altri agenti ossidanti, quali i perossidi organici.
+ N2 + H2O + h
NH2
COOH
COO-catalizzatore
H2O2, OH-
NH2
NHNH
O
O
La reazione può essere catalizzata da enzimi quali la perossidasi, la
microperossidasi e le catalasi, nonché da altre sostanze quali emoglobina,
citocromo c, ione Fe3+ e vari complessi di metalli di transizione. Il prodotto di
ossidazione del luminolo é l'anione amminoftalato nello stato eccitato, che é
responsabile dell’emissione (max = 420 nm).
Si possono usare "enhancer" quali il p-iodofenolo
CHEMILUMINESCENZA
La reazione del luminolo può essere utilizzata per la misura dell’attività del tracciante enzimatico perossidasi, operando in eccesso di substrato.
+ N2 + H2O + h
NH2
COOH
COO-catalizzatore
H2O2, OH-
NH2
NHNH
O
O
In alternativa, è possibile utilizzare il luminolo come tracciante. Sono stati sintetizzati derivati isoluminolo-antigene o isoluminolo-anticorpo.
NHNH
NH
O
O
CONH
NHHN
O
OHS
NNH
NH
O
O
(CH2)6CH2CONHOCH2NHCOProtein
Biotina-isoluminolo
Proteina-isoluminolo
Generalmente è preferibile utilizzare l’enzima come marcatore, ottenendo così:
• l’amplificazione del segnale• una cinetica di emissione
caratterizzata da uno stato stazionario.
CHEMILUMINESCENZA
Decomposizione dell'adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato (AMPPD) catalizzata dall'enzima fosfatasi alcalina (AP) in ambiente acquoso.
L'AMPPD, che contiene un anello di tipo diossietano, viene defosforilato in presenza dell'enzima. Il prodotto della reazione si scinde in due frammenti carbonilici, uno dei quali é in uno stato eccitato e può dare luogo a luminescenza.
+
O-
COOMeOO O
OMe
O-
AP
O OOMe
OPO3--- HPO4--
*
*
O-
COOMe
+ AE
O-
COOMe
+ AE* + AE + h
O-
COOMe
CHEMILUMINESCENZA
I metodi immunometrici possono essere classificati in:se
gnal
e
log concentrazione analita
Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del
segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle
del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico
diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione,
la curva dose-risposta ha forma sigmoidale.
segn
ale
concentrazione analita
Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel
campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico
è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la
curva dose-risposta è lineare.
CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
I metodi immunometrici possono essere distinti in:
Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di
distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero.
Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta
o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione
della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase
liquida.
CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
CARATTERISTICHE DEIMETODI OMOGENEI ED ETEROGENEI
CARATTERISTICHE DEIMETODI OMOGENEI ED ETEROGENEI
CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
Metodi eterogenei
Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione
Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione
Ampio ambito dinamico del metodo
Ambito dinamico del metodo inferiore
Bassi limiti di rivelazioneLimiti di rivelazione più elevati
Difficili da automatizzarePossono essere automatizzati facilmente
Esecuzione del metodo più complicata
Esecuzione semplice e rapida
Metodi omogenei
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I)IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I)
Fisica (adsorbimento)Chimica
Biotina-avidina Proteina A Anticorpo
IgG anti-coniglio (Fc specifico) da
capra
IgG anti-analita da coniglio
METODI ETEROGENEI
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO
Fisica (adsorbimento)
L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH
forza ionica; temperatura; tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica
le interazioni aspecifiche possono essere notevolmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP).
METODI ETEROGENEI
Proteine legate
g/sfera
Aspecifici
%
Riproducibilità
mediaDS
Capacità legante
%
polistirene 1.5 < 2 800 68 50-60
idrazide 2.6 14 700 150 25-30
alchilammina 2.8 15 860 165 28-38
METODI ETEROGENEI
METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE
METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO
Anticorpi di cattura Fc specifici
Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per
legare l’antigene
Anticorpi di cattura Fab specifici
Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene
METODI ETEROGENEI
I metodi immunometrici possono essere distinti in:
Competitivi (modulazione di attività)
Non competitivi (amplificazione di attività)
CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
Anticorpo immobilizzato
Antigene
Tracciante
Substrato enzimatico
DIRETTIDIRETTI
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTIDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTIDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTIDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTI DIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTIDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
DIRETTIDIRETTI
1 2 3
aggiunta reattivi
reazione
separazione liberolegato
analita
tracciante
Conc. analita
Tracciante legato
0 4 162
41
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo.
Analita liberoAnalita
immobilizzatoAnticorpo anti-analita
EAnticorpoanti-IgG marcato
EE
Aggiunta antigene e anticorpo
E
E
Aggiunta dell’anticorpo marcato
E
E
E
Substrato Segnale
Competizione per il sito anticorpale
Separazione
Misura del segnale
E
E
E
E E
Separazione
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
INDIRETTIINDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
Anticorpo immobilizzato
Antigene
Tracciante
Substrato enzimatico
DIRETTIDIRETTI
METODI ETEROGENEI COMPETITIVI
Enzima:Enzima: ELISA (Enzyme Linked immunoassorbent assay)ELISA (Enzyme Linked immunoassorbent assay)
Per sviluppare un metodo competitivo per un aptene occorre coniugare
l’aptene:
• ad una proteina carrier per la produzione dell’immunogeno
• ad un enzima per la produzione del tracciante.
Occorre quindi sintetizzare un derivato dell’aptene, in modo da:
• introdurre nell’aptene un gruppo reattivo in grado di reagire con le
proteine
• introdurre il gruppo reattivo sull’aptene al termine di un braccio
spaziatore, in modo che l’aptene venga poi inserito ad una certa
distanza dalla superficie della proteina e possa liberamente essere
riconosciuto e legato dall’anticorpo.
SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI
• Nei sistemi omologhi lo stesso derivato dell’aptene viene utilizzato
per la sintesi dell’immunogeno e del tracciante.
• Nei sistemi eterologhi immunogeno e tracciante sono sintetizzati
utilizzando:
due apteni simili ma non identici, con lo stesso ponte inserito
nella stessa posizione (eterologia di aptene);
lo stesso aptene, ma con un diverso ponte che unisce l’aptene
alla proteina (eterologia di ponte);
lo stesso aptene e lo stesso ponte, ma inserito in una posizione
differente dell’aptene (eterologia di posizione).
• I sistemi eterologhi permettono di ottenere anticorpi con affinità
maggiore per l’analita rispetto al tracciante, quindi di migliorare il
limite di rivelazione del metodo.
SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI
• Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti
enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo,
mostravano una variazione della propria attività catalitica.
• I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima
lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima
glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD)
è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior
capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito
all’interazione con l’anticorpo.
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I)
S
S
P
• Il tracciante in soluzione è attivo• Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita.
Sono stati proposti due sistemi.
conc. analita
attiv
ità e
nzim
atic
a
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II)
1° sistema:
S
SP
conc. analita
attiv
ità e
nzim
atic
a
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III)
• Il tracciante in soluzione è inattivo• Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.
2° sistema:
• L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola.
• Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, la luce emessa sarà parallela a quella assorbita.
luce assorbita luce emessa
fluoroforo
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I)
• Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola.
• Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione.
fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare
La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II)
Per eseguire la misura, il campione viene eccitato alternativamente con luce polarizzata orizzontalmente e verticalmente.
Il grado di polarizzazione (P) viene calcolato come:
HVVV
HVVV
II
IIP
dove:
IVV = segnale quando si misura l’emissione sul piano parallelo a quello di
eccitazione (si eccita sul piano verticale, si misura sul piano verticale).
IHV = segnale quando si misura l’emissione sul piano perpendicolare a quello di
eccitazione (si eccita sul piano orizzontale, si misura sul piano verticale).
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III)
A valori costanti di (tempo di emivita dello stato eccitato) il grado di
polarizzazione della radiazione emessa dipende solo dal tempo di rilassamento
rotazionale della molecola ().
= 3vM / RT
dove è la viscosità del mezzo, v è il volume specifico parziale (mL/g) ed M è il
peso molecolare del fluoroforo, R è la costante dei gas e T è la temperatura.
Maggiore è il peso molecolare del fluoroforo, maggiore sarà il suo tempo di
rilassamento rotazionale (~ 4,3 nsec per la fluorescina e ~ 100 nsec per una
immunoglobulina).
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV)
La relazione che lega il grado di polarizzazione (P) al tempo di rilassamento
rotazionale della molecola () ed al tempo di emivita dello stato eccitato () è:
(1/P – 1/3) = (1/P0 – 1/3)(1 + 3/)
dove P0 è il valore di polarizzazione limitante, cioè il massimo grado di
polarizzazione che si ottiene quando tutte le molecole sono ferme nello spazio.
Combinando questa equazione con la precedente:
1/P = 1P0 + {1/P0 – 1/3} x RT/vM x
Il valore di polarizzazione misurato fornisce quindi una misura diretta delle
dimensioni del fluoroforo a temperatura e viscosità costanti.
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V)
Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di rotazione di circa 100 ns,
mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 1 ns.
Metodi immunometrici competitivi omogenei sono stati sviluppati.
Il tracciante legato all’anticorpo
mantiene un grado di
polarizzazione maggiore rispetto
al tracciante libero. Si può quindi
ottenere una curva dose-risposta
senza la necessità di separare la
frazione di tracciante libero da
quello legato prima della misura.
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI)
S
S
P1
P1
P2
In presenza di piccole quantità di
analita, il tracciante interagisce
con l’enzima immobilizzato
sull’anticorpo, che trasforma P1
in un prodotto misurabile (P2).
S
S P1Q
P1
In presenza di elevate quantità di
analita, il tracciante, che non si lega
all’anticorpo, interagisce con un
enzima in soluzione che trasforma
P1 in un prodotto non misurabile (Q).
Questo riduce il segnale di fondo.
L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad
un enzima.
METODI OMOGENEI COMPETITIVI
ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay)ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay)
La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante
An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). Riducendo la concentrazione
dell’anticorpo e del tracciante è possibile ottenere un limite di rivelazione più basso.
Tuttavia, per la legge di azione di massa, a basse concentrazioni di reagenti la
velocità di formazione del complesso si riduce, quindi l’accuratezza del metodo
sarà inferiore.
L’equilibrio che si instaura è:
An + Ab An-Ab
+An*
An*-Ab
KAn
KAn*
Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono:
[An*]i = costante
[Ab]i = costante
[Ab]i < [An]i + [An*]i
PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI
segn
ale
log concentrazione analita
Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.
segn
ale
concentrazione analita
PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI
Ab An+ An-AbKa
KdDove:
[Ab]eq = concentrazione di anticorpo libero all’equilibrio
[An]eq = concentrazione di analita libero all’equilibrio
[An-Ab]eq = concentrazione di complesso analita-anticorpo all’equilibrio
Si indica con:
Abt = concentrazione totale di anticorpo = [Ab]eq + [An-Ab]eq
T = concentrazione totale di analita = [An]eq + [An-Ab]eq ovvero = [An]i + [An*]i
(dove An è l’analita nel campione e An* è l’analita marcato)
R = [An-Ab]eq/T, cioè frazione di analita legato. Questa è la variabile che viene
di solito determinata nei metodi immunometrici.
PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO
che può essere risolta per R (frazione di analita legato) in funzione di [An]i,
[An*]i, Abt e K. Se tre di queste variabili sono costanti, è possibile osservare
l’effetto della quarta sull’andamento di R.
PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO
si può scrivere come:
Keq =[An-Ab]eq
[An]eq[Ab]eq
Keq =[An-Ab]eq
(Abt-[An-Ab]eq) (T-[An-Ab]eq)
dividendo per T e sapendo che [An-Ab] = RT:
Keq =R
(Abt-RT) (1-R)
poiché T = [An]i+[An*]i
e riarrangiando:Keq (1<-R) (Abt-R[An]i-R[An*]i) = R
R2 - R + = 0([An]i+[An*]i+Abt+1/K)
([An]i+[An*]i)
Abt
([An]i+[An*]i)si ricava l’equazione:
EFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPOEFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPO
• Una riduzione di Abt sposta la curva a concentrazioni di analita più basse (confronto tra curve verde e blu).
• Un aumento di K aumenta la sensibilità (confronto tra curve blu e rossa).
K=1010 L mol-1
Abt=10-10M
K=1010 L mol-1
Abt=10-9M
K=1010 L mol-1
Abt=10-10M
K=1010 L mol-1
Abt=10-9M
K=1011 L mol-1
Abt=10-10M
K=1011 L mol-1
Abt=10-10M
K=1010 L mol-1
Abt=10-10M
Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M)
Curve teoriche di legame per un metodo
immunometrico competitivo
10-11 10-10 10-9 10-8 10-7
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
R,
fraz
ione
di a
ntig
ene
lega
toPARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO
R,
fraz
ione
di a
ntig
ene
lega
to
Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M)
An*=0
An*=10ng/mL
An*=30ng/mL
An*=100ng/mL
K=1010Lmol-1
Abt =3X10-10M
10-11 10-10 10-9 10-8
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Una riduzione di An* aumenta la sensibilità del metodo.
EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An*EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An*
PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)
PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)
yA
yB
yC
xA xB xC
xA
xB
xC
xA xB xC
y = 10%
RIS
PO
ST
A
DOSE
Le reazioni analita-anticorpo sono caratterizzate da elevata specificità,
definita come la capacità dell’anticorpo di legare selettivamente l’analita e non
altre specie (interferenti) simili.
La specificità dell’anticorpo non è sempre assoluta. Si definisce reattività
crociata la sua tendenza a legare gli interferenti. Tra i vari modi per
misurarla, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la
concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la
concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto.
[An-
Ab]
/[A
n]
0
50
100
[An]a b
100xb
a%CR
SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPOSPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
B/B
0
log concentrazione analita
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione
su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.
La curva viene prodotta rappresentando B/B0 (rapporto tra segnale dello
standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in
funzione del logaritmo della concentrazione di analita.
B0 è il segnale ottenuto in assenza di
analita
B è il segnale a concentrazione x di
analita
B/B0 rappresenta quindi la frazione di
tracciante che è stato spiazzato in
presenza della concentrazione x di
analita 1.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
c
a
a/2
y
x
b = fattore di pendenza(*)
FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRIFUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI
b
cx
1
ay
x = dose y = B-N
a
c
a+d2
y
x
d
b = fattore di pendenza(*)
db
cx
1
day
x = dose y = B
L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N
FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRIFUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI
(*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO
LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO
TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG
)B/B(1
B/Bln)B/B(itlog
0
0o
La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Si utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da
ottenere il massimo segnale dall’analita.
Determinazioni anche a basse concentrazioni di analita.
Seg
nale
Concentrazione analita
La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con-centrazione di analita.
METODI NON COMPETITIVI
Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*)
[Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag]
L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi
Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*
Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei
METODI NON COMPETITIVI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
Anticorpo di cattura immobilizzato
Antigene
Tracciante
Enzima
Substrato enzimaticoAnticorpo dirivelazione
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
DIRETTI INDIRETTI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
Fase solida
Antigene di cattura immobilizzato
Anticorpo
Tracciante
Enzima
Substrato enzimatico
Anticorpo specie-
specifico
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
Aggiunta del campione
Aggiunta del tracciante
Incubazione
Lavaggio
Aggiunta del substrato
Misura del segnale
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
• Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi).
• In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso
enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence
resonance energy trasfer), ecc...
substrato
prodotto intermedio prodotto
finale
METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI
METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI
SISTEMA INDICATORI
i1/i2
SUBSTRATI PRODOTTI
P1/ P1
Enzimi
vicinali
Esochinasi/
GPDasi
ATP/glucosio
NAD+
Glucosio 6-fpsfato
Gluconolattone-6-fosfato + NADH
Enzimi
vicinali
GOasi/
POasi
Glucosio/
Donatore H
ossidato
Perossido/
Donatore H
ossidato
METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)
Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato)
alta %P
anticorpo analitamarcato(in eccesso)
bassa %P
[analita]
%P
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione
su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.
La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard
in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è
lineare.
Seg
nale
Concentrazione analita
Seg
nale
Concentrazione analita
aspecifico
saturazione
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Seg
nale
concentrazione analita
PARAMETRI QUANTITATIVI
Sensibilitàpendenza della curva
Intervallo dinamico
Limite di rivelazioneCalcolato in funzione della deviazione
standard del bianco
EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI
Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo
Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa)
B/B
0
concentrazione analita
Riduzione del limite di rivelazione:
CARATTERISTICHECARATTERISTICHE
Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita.
L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità
Specificità intrinseca superiore
Limite di rivelazione più basso
Amplificazione di attività (AA)(Metodi non competitivi)
Modulazione di attività (MA)(Metodi competitivi)
METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)
I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per
quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale.
Le cause più comuni sono:
• la presenza nel campione di molecole che danno reazione
crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del
complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo
per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc;
• la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA),
di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione
spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può
essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo,
grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.
INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI
• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione
Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab
Campioni fluidi (siero, urina, latte)
Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti)
VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione
Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa
Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)
Piccoli volumi di campione Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi) Diagnosi precoce Determinazione di sostanze in tracce
VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione
Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti
Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica
Rapidità di esecuzione (poche ore)
Analisi di numerosi campioni per giorno
VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione
Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici
Ottimizzazione delle fasi analitiche
- errori precisione e accuratezza
- tempi di esecuzione rapidità
VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
POSSIBILI FORMATI ANALITICIIn commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)
Piastre microtiter
Analizzatori automatici
Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua
Fase pre-analitica:
1 -diluire il campione d’acqua 1/10-1/100 v/v con tampone
2 –si aggiunge un eccesso di EDTA
Dosaggio immunoenzimatico
Si utilizza un anticorpo monoclonale che riconosce il complesso Cd-EDTA
Metodi immunologici per ioni metallici
Curva di calibrazione
Incubazione: 60 min. at 37°C
Rivelazione Chemiluminescente del tracciante HRP: H2O2/luminolo/enhancer
CampioneTracciante:Cd(II)-EDTA-HRP
Anticorpo immobilizzato
Lavaggio
Microtiter96-384 pozzetti
[Cd(II)], μg/L
Sig
nal
e C
L
Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua
0.01 0.1 1 10 100
Metodi immunologici per ioni metallici
GS
HG
SH
GS
HG
SH
campioneG
SH
GS
-Hg
GS
HG
S-H
g
GS
HG
S-H
gG
SH
GS
-Hg
GS-Hg anticorpo
Ү Ү
GS
HG
S-H
gG
SH
GS
-HgAdd
HRP-Ab anticorpo
Ү ҮҮ ҮHRPHRP
HRPsubstrato
Segnale
Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale
Campioni liquidi : Analisi diretta (solo diluizione)Campioni solidi : Estrazione di Hg(II) con HCl/HNO3 poi si tampona a pH=7
The extract is added to the microtiter wells where the BSA-GSH is immobilized: the Hg ions bind the glutathione
This complex is detected using an antibody anti-BSA-glutatione-Hg and with a secondary HRP labeled antibody
Metodi immunologici per ioni metallici
:
Limite di rivelazione: 0.4 μg/l
Specificità: altamente specifico per Hg(II):
Quantità richiesta per dare un ‘interferenza (ppm)
Mercurio 0.36 Piombo >150,000 Arsenico >55,000 Nichel >43,000 Bario >100,000 Argento > 79,000 Cadmio >82,000 Sodio >17,000; Cromo > 38,000 Stronzio >64,000 Rame > 47,000 Tallio >150,000 Oro > 144,000 Zinco >48,000 Ferro >41,000
Caratteristiche analitiche
Metodi immunologici per ioni metallici
Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale
DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo
Ab anti-ferritinamarcato con HRP
+ +
+
30 min25 °C
Lettura del segnale a 492 nmColorazione giallo-arancione
60 min37 °C
DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
CARATTERISTICHE DEL METODO
• Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml
• Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata
Production Of Monoclonal AntibodiesImmunisation with antigen
Cell line –myeloma
P3– NSI/I – Ag4 – 1
X63 – Ag8 - 653
Ab1 Ab2 Abn Ab titre from serum
Spleen suspension
Fusion with P.E.G.
Selection with H.A.T.
Screen for Ab – secreting hybrids
Clone Ab secreting hybrids
Clone 1 Clone 2 Clone n
Serum/ascitic fluid containing Abn
In vivo
Ab1 Ab2 Abn
Production of Stable Antibody Secreting Hybrid
1st Cloning
Hybrid Ab Hybrid Abn Hybrid Non Secretor
Cell division
Hybrid Ab1
Hybrid Non-Secretor
2nd Cloning
Stable antibody secreting hybrid