Colorazioni, terreni e disinfezione - sunhope.it_terreni_e_disinfezione MICROBIOLOGIA L… ·...

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Diagnostica batterica

Dott.ssa Mariateresa VitielloDipartimento di Medicina SperimentaleSeconda Università degli Studi di Napoli

Identificazione dei batteri

1. esame microscopico diretto del materiale in esame

2. Caratteristiche morfologicheColorazione di GramColorazione di Ziehl-Neelsen

3. Caratteristiche colturali4. Caratteristiche biochimiche5. Tipizzazione fagica6. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)7. Antibiogramma

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esame microscopico diretto del materiale in esame

Identificazione dei batteri

TIPO DI MICROSCOPIO

MASSIMO INGRANDIME

NTO

UTILIZZAZIONE VANTAGGI SVANTAGGI

OTTICOIN CAMPO ILLUMINATO

1000X OSSERVAZIONE PREPARATI COLORATI. CONTA MICROBICA

DI FACILE USO E POCO COSTOSO; PERMETTE DI DISTINGUERE I MICRORGANISMI DOPO COLORAZIONE DIFFERENZIALE

MANCANZA DI CONTRASTO; INCAPACITA' A VISUALIZZARE VIRUS E ALCUNI BATTERI MOLTO PICCOLI; LA MAGGIOR PARTE DELLE STRUTTURE DEVE ESSERE COLORATA PER ESSERE OSSERVABILE; A SEGUITO DELLE COLORAZIONI SI FORMANO ARTEFATTI

OTTICOIN CAMPO

OSCURO

1000X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E CON STRUTTURE MORFOLOGICHE DIFFICILMENTE VISIBILI IN CAMPO ILLUMINATO

PERMETTE DI OSSERVARE MICRORGANISMI VIVENTI, NON E' RICHIESTA COLORAZIONE PER CUI NON COMPAIONO ARTEFATTI

NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI. I PARTICOLARI SUBCELLULARI NON SONO FACILMENTE INDIVIDUABILI

OTTICO CONTRASTO DI FASE

1000 X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E DI STRUTTURE INTRACELLULARI

PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI STRUTTURE INTRACELLULARI, EVIDENZIANDONE I DETTAGLI

NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI

OTTICOFLUORESCENZA

1000 X USATO IN MOLTE PROCEDURE DIAGNOSTICHE, IMPIEGANDO REAGENTI FLUORESCENTI, PER IDENTIFICARE I MICRORGANISMI E PER SVELARE REAZIONI IMMUNOLOGICHE

PERMETTE UNA RAPIDA IDENTIFICAZIONE DEGLI AGENTI INFETTIVI

CONSENTE SOLO L'OSSERVAZIONE DI PREPARATI NATURALMENTE FLUORESCENTI O MARCATI CON SOSTANZE FLUORESCENTI

ELETTRONICOTRASMISSIONE (TEM)

1.000.000 X OSSERVAZIONE DELL'ULTRASTRUTTURA DEI MICRORGANISMI, VIRUS. DIAGNOSI DI MALATTIE VIRALI. OSSERVAZIONE DI MACROMOLECOLE

PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI E STRUTTURE INVISIBILI AL MICROSCOPIO OTTICO

MOLTO COSTOSO. CONSENTE L'OSSERVAZIONE SOLO DI MICRORGANISMI UCCISI, FISSATI, DISIDRATATI E COLORATI: TALI PROCEDURE FAVORISCONO GLI ARTEFATTI. I PREPARATI NON DEVONO SUPERARE I 50-200 nm DI SPESSORE

ELETTRONICOSCANSIONE (SEM)

300.000X OSSERVAZIONI DETTAGLIATE DELLE STRUTTURE SUPERFICIALI DEI MICRORGANISMI: PRODUCE IMMAGINI TRIDIMENSIONALI

VISIONE TRIDIMENSIONALE MOLTO REALISTICA. PERMETTE DI AGEVOLMENTE DI VARIARE L'INGRANDIMENTO DEL CAMPIONE DA 1 A 40.000X

MOLTO COSTOSO. CONSENTE DI OSSERVARE SOLO STRUTTURE DI SUPERFICIE. L'INGRANDIMENTO MASSIMO E' INFERIORE A QUELLO DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE


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Microscopio Ottico Composto in Campo Chiaro

Antonie van Leeuwenhoek(1632 - 1723)

IL MICROSCOPIO

LIMITE DI RISOLUZIONE: imposto dalle proprietà fisiche della luce(0,2 µm)

PER OSSERVARE I BATTERI SENZA COLORARLI:- IN CAMPO CHIARO- OBIETTIVO 100X - OCULARE 10X- IN IMMERSIONE- CONTRASTO DI FASE

Obiettivo a contrasto di fase

e ad immersione

IL MICROSCOPIO


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MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Vengono utilizzate sostanze dette FLUORESCENTI:

Sostanze che se irradiate con luce di una determinata lunghezza d’onda , la

riemettono con lunghezza d’onda maggiore

I fluorocromi più usati sono:la FLUORESCEINA che ha un massimo

di assorbimento a 490-495 nm ed emette una luce giallo-verde

e la RODAMINA che ha un massimo di assorbimento a 550 nm ed emette luce

rossa-arancio

Pneumocystis carinii al microscopio a fluorescenza.Anticorpi specifici per questo patogeno, coniugati

con fluoresceina, hanno ricoperto la superficie dellacisti, che appare colorata in giallo-verde.


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Microscopio elettronico a trasmissione (TEM).Questo microscopio viene utilizzato per osservare sezioni di cellule molto sottili per rilevare le strutture interne.

Il TEM viene anche utilizzato per studiarei virus.

MICROSCOPIA ELETTRONICA: basata sul

principio che un campoelettromagnetico agisce su unfascio di elettroni in modo analogo ad una lente su un

fascio di fotoni

MICROSCOPIO ELETTRONICO


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Microscopio elettronico a scansione (SEM).Questo microscopio serve per fornire immagini tridimensionali delle cellule.

Salmonella typhimurium osservata al microscopioelettronico a scansione.


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TECNICA PER L'ESAME A FRESCO DA COLTURA

L'esame microscopico può essere praticato a fresco ( osservazione diretta dei microrganismi solitamente in condizioni di vitalità) o su preparati colorati (osservazione dei microrganismi dopo che sono stati essiccati, fissati e colorati).L'esame a fresco permette di studiare la forma, la disposizione, le dimensioni, la rifrangenza, la mobilità e la riproduzione dei microbi. Viene compiuto sempre in mezzo liquido per cui nel caso si abbiamateriale solido o semisolido, esso va stemperato in un liquido.I preparati a fresco sono allestiti in vario modo:

esame microscopico


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Preparati su vetrini porta-oggetto con copri-oggetto:

1) sterilizzare arroventando sulla fiamma l'ago o l'ansa fino al raggiungimento del colore rosso, si usa l'ansa per prelievi di maggiore quantità, l'ago per prelievi di piccole quantità;2) raffreddare l'ansa o l'ago;3) prelevare il materiale in esame con l'ansa o l'ago se da una coltura o con un tampone sterile se da materiale patologico;4) allestire la sospensione microbica: per l'esame è necessario un mezzo liquido, ed è preferibile utilizzare un numero limitato di microrganismi; a tal scopo si può sospendere una ansata in 5ml di soluzione fisiologica sterile ma ci si regolerà di volta in volta a seconda se il materiale iniziale è in terreno solido o liquido, se èabbondante o meno, o se il tampone è ricco di materiale oppure no;

esame microscopico

5) dispensare sul vetrino portaoggetti 2-3 gocce della sospensione microbica;

6) con un lato del vetrino coprioggetto lambirelateralmente il liquido posto sul portaoggetti e depositare il coprioggetto cercando di non formare bolle. Per osservazioni lunghe sigillare i margini del coprioggetto con un mastice (paraffina);

7) porre il vetrino preparato sul tavolino traslatoredel microscopio;

8) osservare al microscopio composto o a contrasto di fase con obiettivo a secco oppure ad immersione.

esame microscopico


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esame microscopico diretto del materiale in esame

Caratteristiche morfologiche– Colorazione di Gram– Colorazione di Ziehl-Neelsen

Identificazione dei microrganismi

Le colorazioni in Microbiologia.Perché colorare ?

La cellula batterica è trasparente contrasto insufficiente tra cellula batterica ed ambiente circostante.I coloranti debbono consentire:

forte contrasto tra i microrganismi ed il fondodifferenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram)evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule, endospore)


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Le colorazioni in MicrobiologiaI coloranti

I coloranti constano di ioni (positivi o negativi). Al riguardo, essi possono essere suddivisi in:

Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina):⌧Carica positiva Affinità per le strutture acide

(superficie cellulare, proteine, acidi nucleici) colorazione diretta

Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo):⌧Carica negativa Affinità per le strutture

basiche, si depositano attorno al microrganismo colorazione indiretta o negativa

Le colorazioni in MicrobiologiaTecniche di colorazione

Colorazioni SEMPLICI: un colorante basico (blu di metilene, fucsina fenicata) viene applicato al campione fissato per un tempo variabile. L’eccesso di colorante viene eliminato tramite risciacquo con acquaConsente di rilevare la morfologia e l’organizzazione cellulare

Colorazioni DIFFERENZIALI:due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti, differenziatori) consente di distinguere due differenti tipologie di microrganismi o 2 differenti strutture di un microrganismo


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Le colorazioni in MicrobiologiaPreparativa

Preparazione di soluzioni colorantiSoluzione alcoolica (colorante come sale):⌧10 g sostanza colorante + 100 ml alcool assoluto

Soluzione idroalcoolica 10% (colorante subisce dissociazione elettrolitica):⌧10 ml soluzione alcoolica madre colorante + 90 ml H2O

distillataReagenti per colorazioni

Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l’ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurataDifferenziatori, sostanze decoloranti: alcool-acetone, acido solforico al 20%

Le colorazioni in MicrobiologiaTipologie di colorazione

Colorazioni PROGRESSIVE: si esegue con soluzioni molto diluite di colorante, interrompendo tempestivamente la colorazioneColorazioni REGRESSIVE: si esegue una ipercolorazione e si usa poi un differenziatore la cui azione decolorante va interrotta tempestivamente


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Tecniche di colorazioneColorazioni DIFFERENZIALI

Colorazione di GramColorazione per bacilli acido-resistenti:⌧Metodo di Ziehl-Neelsen⌧Metodo a freddo di Kinyoun⌧Metodo della fluorescenza con auramina

Colorazione della capsula (inchiostro di china)Colorazione di flagelli (Leifson)Colorazione di spore

Hans Christian Joachim Gram

Batteriologo daneseed inventore dellacolorazione di Gram (nel tentativo didifferenziare Klebsiellapneumoniae dagli pneumococchi)


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Colorazione di GramTecnica

I batteri Gram+ appaiono blu

(Staphylococcus epidermidis)

I batteri Gram- appaiono rossi

(Escherichia coli)

Colorazione di GramOsservazione microscopica


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The Cell EnvelopeThe Cell Envelope

Gram PositiveGram Positive Gram NegativeGram Negative

Parete batterica: Confronto delle superfici

DUNQUE PERCHÉ I BATTERI G– PERDONO LA COLORAZIONE CON CRISTALVIOLETTO?


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Gli acidi teicoici sono legati covalentementeal gruppo 6-ossidrile dell’acido muramico

LEGAME FOSFODIESTERE

LA PARETE BATTERICA DEI GRAM +

LA PARETE BATTERICA DEI GRAM -

Escherichia coli O157 O157:H7

Antigene somatico

Antigene flagellare


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Nei batteri Gram+ il cristalviolettoe lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa per disidratazione la struttura petidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene “catturato” dalla parete cellulareNei batteri Gram- il decolorante, agendo come solvente lipidico, dissolve la membrana esterna della parete cellulare così permettendo il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.

Colorazione di GramPrincipio

Colorazione di Gram: l’eccezione

La colorazione di Gram non è applicabilea tutti i batteri.

Esempi consistono nel Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium lepraeIncapacità di colorare per la natura“cerosa” dell’involucro esterno, altamente impermeabile ai colorantiColorazione di Ziehl-Nielsen


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Mycobacterium spp.Parete cellulare

Composizione:Grosse quantità di glicolipidi:⌧acido micolico (60%)⌧complessi lipidi-

arabinogalattani⌧lipoarabinomannani

Scarso petidoglicano

Funzioni:Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano)Inibizione ingresso composti chimici⌧Crescita lenta⌧Maggiore resistenza agli

agenti chimici⌧Maggiore resistenza alla

fagocitosiInduzione sintesi citochine(TNF-α) da parte dell’acido micolico

Mycobacterium spp.Parete cellulare


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Presenza caratteristica di ceramidi e fosfolipidialla superficie cellulare di Mycobacterium spp. eNocardia spp.I coloranti ordinari non possono superare lo strato cerato.Colorazioni con la tecnica per l’acido-resistenza:

KinyounZiehl-Neelsen

Le colorazioni in microbiologiaColorazione di Ziehl-Neelsen

Step 1:Step 1:Versare la fucsina basica

Step 2:Step 2:Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 minLavare con acqua

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)


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Step 3:Step 3:Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min)Lavare con acqua

Step 4:Step 4:Contrastare con blu di metilene per 1-2 minLavare con acqua

Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)

Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rossoGli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica


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Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen

1000x

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazioni speciali

La colorazione negativa viene usata quando un organismo od una sua struttura non vienecolorata facilmente come, ad esempio, in presenza di capsula.

La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante

La colorazione dei flagelli richiede un mordenzante per ispessire la strutturaflagellare


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Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di flagelli

Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori

Le spore batteriche per la presenza di uno spesso involucro costituito da più strati vengono difficilmente colorate, viceversa una volta che hanno assunto una colorazione si decolorano con estrema difficoltà.Le tecniche di colorazione prevedono una energica fissazione, trattamenti preliminari del preparato che modificano l’impermeabilità delle spore (cloroformio e acido cromico), facilitano l’attraversamento del colorante, l’utilizzo di mordenzanti fisici (calore) o chimici (acido fenico, FeCl2, borato), utilizzo di decoloranti (acidi, sostanze riducenti,, alcool assoluto) che evidenziano la resistenza della spora alla decolorazione.

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di spore


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1) distensione,essiccazione ed energica fissazione del preparatobatterico;

2) distendere sul preparato blu borace (blu di metilene 2% + 5grborato di sodio in acqua distillata); con la fiamma delbecco bunsen riscaldare per 2-3 min. direttamente il vetrinonella parte sottostante fino a che non si ottiene la comparsa divapori;

3) decolorare con acido nitrico (10%) per 20 sec.;4) allontanare l'eccesso di decolorante;5) lavare e trattare per 1 min. con una soluzione acquosa di cosina

1%;6) lavare ed asciugare con carta bibula;7) osservare con obiettivo ad immersione

Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di spore


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Identificazione dei microrganismi

1. esame microscopico diretto del materiale in esame

2. Caratteristiche morfologicheColorazione di GramColorazione di Ziehl-Neelsen

3. Caratteristiche colturali


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Coltivazione dei batteri

COLTIVAZIONE DEI BATTERI: processo mediante il quale si cerca di ottenere la riproduzione dei microrganismi in un ambiente artificiale fornendo loro le sostanze nutritizie necessarie e adatte condizioni ambientali:

-Temperatura-Acidità (pH)

-Pressione osmotica-Luce ecc.

La coltivazione dei batteri ci permette di:-studiarne le caratteristiche biologiche-isolarli ed identificarli da un campione biologico a scopo diagnostico

Terreni di colturaTerreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo

Classificazione dei terreni di coltura


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Terreni selettivi: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione diuno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi.


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Cetrimide Agar: Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.

MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+.

Terreni selettivi: esempi

Mannitol Salt Agar:Terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di stafilococchi presunti patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. Indicatore: rosso fenolo. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.

Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):Terreno selettivo (Sali biliari) e differenziale per l’isolamento di Salmonella e Shigella dalle

feci. Zucchero: lattosio. Indicatore: rosso neutro. Tiosolfato di sodio e citrato ferrico.

Terreni differenziali: rendono possibile alle colonie di un dato microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto

tale da essere riconosciuto a prima vistaEsempi


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TERRENI DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici.

Preparazione dei terreni di coltura


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La semina dei terreni di coltura

Semina di terreno solido

Striscio Spatolamento

Inclusione

Inoculo in terreno liquido

Trasferimento insterilità di cellule nelterreno liquido con

ansa o pipetta

Lavorare in Sterilità

Si lavora con fiamma ossidante(azzurra, più calda, più

stabile), NON riducente (gialla)

Becco Bunsen

Pipette Spatola

Ansa


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Tecniche di semina per isolamento

Semina per isolamento


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Tecniche di semina per isolamento

Incubazione dei microrganismiI brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad unaTEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali perpermettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando

Bacillus stearothermophilusG+, anaerobio facoltativo, termofilo

Incubazione a 60°C per 8-12 h

Bifidobacterium bifidumG+, anaerobio stretto, mesofiloIncubazione a 37°C per 36-48 h

Giara per anaerobiosi


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Cappa (camera) anaerobica

Anaerobiosi

Figure 6.6

Giara per anaerbiosi

Anaerobiosi

Figure 6.5


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Candle jar

CO2-packet

Carbossifilia

Figure 6.7

Concetto di Sterilità

Sterilizzazione:Sterilizzazione:Impiego di procedure Impiego di procedure

chimiche e/o fisiche per la chimiche e/o fisiche per la completa eliminazione o completa eliminazione o distruzione di qualsiasi distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, forma di vita microbica,

incluse le spore (forme di incluse le spore (forme di resistenza).resistenza).

Disinfezione:Disinfezione:Processo che riduce o elimina completamente Processo che riduce o elimina completamente

tutti i microrganismi patogeni unicellulari (solo tutti i microrganismi patogeni unicellulari (solo allo stato vegetativo) presenti nellallo stato vegetativo) presenti nell’’ambiente.ambiente.


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MICROBIOTAMICROBIOTA

AmbienteNORMAL HUMAN NORMAL HUMAN


Agricoltura

Industria

AnimaliMicrobiota capace di

causare malattienell’uomo

AreeAree in cui in cui ilil controllocontrollo deidei microrganismimicrorganismi èènecessarionecessario (a (a differentidifferenti livellilivelli))


AmbienteNORMAL HUMAN NORMAL HUMAN


Agricoltura

Industria

Animali

PPercherchéé èè necessario il controllo dei necessario il controllo dei microrganismi: microrganismi: alcuni esempialcuni esempi

Cibo,

farm

aceu

tici,

carb

uran

te,

cosm

etici

, etc

Animali, pollame, (conservazione, produzione), etc

Sanitizzazionedelle aree

Malattie di alberi, raccolto, piante, etc

PrevenzionePrevenzione didi infezioniinfezioniiatrogeneiatrogene, , infezioniinfezioni

chirurgichechirurgiche, , infezioniinfezioni crociatecrociate, , diffusionediffusione didi microrganismimicrorganismi e e

genigeni associatiassociati ad ad antibioticoantibiotico--R, R, etcetc


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Quali sono i mezzi a nostra Quali sono i mezzi a nostra disposizione ?disposizione ?

DisinfezioneDisinfezionemetodi chimicimetodi chimici

SterilizzazioneSterilizzazionemetodi fisicimetodi fisicimetodi chimicimetodi chimicimetodi metodi chimicochimico--fisicifisici

TTecnicheecniche di di sterilizzazionesterilizzazione

From: PR Murray et al Medical From: PR Murray et al Medical Microbiology 3rd edition, Microbiology 3rd edition, MosbyMosby, , 19981998


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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche FISICHETecniche FISICHE

CaloreCalore⌧⌧UmidoUmido⌧⌧SeccoSecco

FiltrazioneFiltrazioneRadiazioni UVRadiazioni UVRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzantiUltrasuoniUltrasuoni

Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisica

CALORESECCO - Esposizione diretta alla fiamma (flambaggio)

- Incenerimento- Stufa a secco

UMIDO - Vapore fluente*- Vapore sotto pressione - Tindalizzazione- Pasteurizzazione

*L’impiego di acqua in ebollizione e di vapore fluente sono da proscrivere: a t° <110°C non si ha una sterilizzazione efficace


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TRAMITE CALORE UMIDO

TEMPERATURA TEMPO

100°C oltre 1200 min.108°C 420 min.110°C 120 min.113°C 30 min.125°C 1 min.135°C 30 sec.

Si definisce sterilizzazione a calore umido il procedimento che utilizza vapore acqueo saturo a T° non minore di 110°C

TRAMITE CALORE UMIDO

TEMPERATURA TEMPI PRESSIONE

115°C 20 min. 0,7 atm121°C 15 min. 1,0 atm134°C 3 min. 2,0 atm

VANTAGGI•Rapidità di penetrazione del calore nei materiali

•Distruzione dei microrganismi in breve tempo

•Facile controllo della sterilità•Atossicità•Economia di esercizio

SVANTAGGI•Degradazione del materiale termolabile

•Corrosione dei metalli•Impossibilità di sterilizzare grassi e polveri anidre


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore umido (autoclaveCalore umido (autoclave))

Tecnica piTecnica piùù comunemente impiegatacomunemente impiegataMateriali Materiali termostabilitermostabili, terreni di coltura, , terreni di coltura, rifiuti infettivirifiuti infettiviNon adatta per: chimici Non adatta per: chimici toxtox e/o volatili, e/o volatili, radioisotopi radioisotopi Camera a pressione che utilizza vapore Camera a pressione che utilizza vapore saturo per ottenere elevate temperature. saturo per ottenere elevate temperature. LL’’aria viene rimossa dalla camera per gravitaria viene rimossa dalla camera per gravitàào tramite o tramite prevuotoprevuotoCiclo Ciclo ““classicoclassico””: 121: 121°°C, 15 C, 15 minmin, 1 , 1 atmatm

Diversi cicli in base alla tipologia di materialeDiversi cicli in base alla tipologia di materiale

Calore umido - Autoclave


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AutoclaveAutoclave

From: AD Russell et al.From: AD Russell et al.Principles & Practice of Principles & Practice of Disinfection, Preservation Disinfection, Preservation & Sterilization, Blackwell, & Sterilization, Blackwell, 19991999

Killing Killing takes timetakes time

1 log reduction

Note:Note:•• Uccisione richiede Uccisione richiede

tempotempo•• ““SterilitSterilitàà”” non non èè

assolutaassoluta•• II protocolli si basano su protocolli si basano su

““overkilloverkill”” calcolatecalcolate


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TINDALIZZAZIONE

Tindalizzazione o sterilizzazione frazionata (calore umido) viene utilizzata per sterilizzare terreni contenenti sostanze termolabili.

- 73÷80°C per 30’- raffreddare a temperatura ambiente- ripetere il trattamento dopo 24 h a 73÷80°C per 30’- raffreddare a temperatura ambiente- ripetere il trattamento dopo 24 h a 73÷80°C per 30’

PASTORIZZAZIONE

Tecnica utilizzata per la bonifica e la conservazione di alimenti.

- 63°C per 30’ (pastorizzazione bassa)- 72°C per 15’’ (pastorizzazione alta)- 90°C per 1’’ (pastorizzazione ultra alta

UHT)


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TRAMITE CALORE SECCO

Materiale non sterilizzabile-Tessuti-Soluzioni acquose-Farmaci organici-Oggetti smaltati-Materiale termosensibile

Materiale sterilizzabile-Vetreria-Strumentazione metallica-Polveri farmaceutiche-Preparazioni non acquosedi sostanze termostabili

(olii)-Materiale termoresistente

SVANTAGGI•Deterioramento materiale termosensibile•Durata eccessiva del processo

VANTAGGI•Apparecchiatura ubiquitaria•Sterilizzazione strumenti all’interno dei contenitori, se metallici

•Non corrode i metalli

Caldo secco Caldo secco –– Forno PasteurForno Pasteur


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore secco (forno Calore secco (forno PasteurPasteur))

Utilizzato per materiali danneggiati Utilizzato per materiali danneggiati dal vapore o perchdal vapore o perchéé impermeabili al impermeabili al vaporevapore⌧⌧OliiOlii, polveri, oggetti taglienti, vetreria, , polveri, oggetti taglienti, vetreria,

rifiuti infettivi (alternativa al calore umido)rifiuti infettivi (alternativa al calore umido)Meno efficace del calore umido e Meno efficace del calore umido e

richiede tempi e temperature maggioririchiede tempi e temperature maggioriDistruzione Distruzione ossidativaossidativa

Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaCalore seccoCalore secco

TEMPERATURA TEMPO180°C 30 min.170°C 60 min.160°C 120 min.150°C 150 min.140°C 180 min.120°C 360 min.

Il tempo di sterilizzazione deve essere conteggiato a partire dal momento in cui il materiale ha raggiunto la temperatura prefissata


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaFiltrazioneFiltrazione

Rimozione di microrganismi e particelle Rimozione di microrganismi e particelle microscopiche dalle soluzioni, aria ed altri microscopiche dalle soluzioni, aria ed altri gasgas

Filtri a membrana (nitrato di cellulosa, acetato di Filtri a membrana (nitrato di cellulosa, acetato di cellulosa)cellulosa)Filtri 1.2 Filtri 1.2 µµm: m: prefiltroprefiltro per chiarificare la per chiarificare la soluzionesoluzioneFiltri 0.45 Filtri 0.45 µµm: rimozione batteri, lieviti e funghi m: rimozione batteri, lieviti e funghi da liquidi biologici e farmaceuticida liquidi biologici e farmaceuticiFiltri 0.22 Filtri 0.22 µµm: rimozione m: rimozione pseudomonadipseudomonadi ed altri ed altri casi particolaricasi particolari


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FiltrazioneFiltrazione

Sistemi filtranti

Microfotografia filtro

FiltrazioneFiltrazione

Enterococchi su membrana


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazione ultravioletta (Radiazione ultravioletta (U.VU.V.).)

Agiscono efficacemente sugli acidi nucleici Agiscono efficacemente sugli acidi nucleici cellulari per diretta esposizione a 254 cellulari per diretta esposizione a 254 nmnmApplicazioni:Applicazioni:

decontaminazione aria, acqua, superficidecontaminazione aria, acqua, superficisterilizzazione fredda di composti chimici e sterilizzazione fredda di composti chimici e plastiche per uso farmaceutico, siero per TCplastiche per uso farmaceutico, siero per TC


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazione ultravioletta (Radiazione ultravioletta (U.VU.V.).)

Fattori critici:Fattori critici:CapacitCapacitàà di penetrazione (generalmente scarsa)di penetrazione (generalmente scarsa)Distanza della sorgente UV dal materiale Distanza della sorgente UV dal materiale esposto a trattamentoesposto a trattamentoIntensitIntensitàà della luce (sostituzione dopo 8.000 h)della luce (sostituzione dopo 8.000 h)UmiditUmiditàà relativarelativaSpecie microbicaSpecie microbica

Radiazione U.V.


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzanti

Radiazioni dello spettro elettromagnetico Radiazioni dello spettro elettromagnetico (microonde, raggi (microonde, raggi γγ, raggi X, elettroni), raggi X, elettroni)Sterilizzazione fredda (a basse temperature)Sterilizzazione fredda (a basse temperature)Effetto letale risultante da unEffetto letale risultante da un’’azione diretta azione diretta (trasferimento di energia alle molecole (trasferimento di energia alle molecole bersaglio) ed indiretta (diffusione di radicali) bersaglio) ed indiretta (diffusione di radicali) sulla molecola bersaglio (DNA)sulla molecola bersaglio (DNA)


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Onde elettromagnetiche a bassa frequenza (3x108-3x1010 Hz)- Meccanismo d’azione: Aumento della temperatura per attrito

interno• P. aeruginosa, E. coli, S. aureus distrutti dopo 90 secondi• B. subtilis, B. stearothermophilus distrutti dopo 150 secondi

MICROONDE

VANTAGGI•Velocità•Mancanza di vapori o gas tossici

•Economia di esercizio•Elevata sterilizzazione•Non scalda i materiali plastici

•Bassa T° a fine ciclo•Maneggevolezza

SVANTAGGI•Difficoltà controllo T°•Impossibile sterilizzare metalli

Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaRadiazioni ionizzantiRadiazioni ionizzanti

Applicazioni:Applicazioni:microonde:microonde:⌧⌧Sterilizzazione Sterilizzazione ““flashingflashing”” di terreni di colturadi terreni di coltura

raggi raggi γγ::⌧⌧prodotti da cobaltoprodotti da cobalto--6060⌧⌧alto potere di penetrazionealto potere di penetrazione⌧⌧non applicabile (costi elevati) in laboratorionon applicabile (costi elevati) in laboratorio⌧⌧dispositivi medici, (siringhe ipodermiche, suture, dispositivi medici, (siringhe ipodermiche, suture,

terreni di coltura, contenitori)terreni di coltura, contenitori)fascio elettronico:fascio elettronico:⌧⌧Trattamento di rifiuti infettiviTrattamento di rifiuti infettivi⌧⌧Non applicabile in laboratorio (scarso potere di Non applicabile in laboratorio (scarso potere di

penetrazione) penetrazione)


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Sterilizzazione fisicaSterilizzazione fisicaUltrasuoniUltrasuoni

Energia ultrasonica a bassa frequenza inattiva per cavitazione i microrganismi in sospensioni acquoseSonicatori usati per pulizia di strumenti ma non vengono considerati sterilizzatori,tuttavia:

Combinazione ultrasuoni + trattamento chimico può avere effetto letale


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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICHETecniche CHIMICHE

Acido Acido peraceticoperaceticoGlutaraldeideGlutaraldeide

Sterilizzazione chimicaAcido peracetico, glutaraldeide

Acido peraceticoimmersione (0.2% per 20’ - acqua sterile - aria sterile)industrie alimentari, strumenti chirurgici (micronizzato)efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti finali non tox (ac. acetico + O2)

Glutaraldeide2% per materiale medico e chirurgico, in alternativa a trattamento termico o irraggiamentopreparazione di vaccini


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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICOTecniche CHIMICO--FISICHEFISICHE

Ossido di etilene (ETO)Ossido di etilene (ETO)Formaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)

Sterilizzazione chimico-fisicaOssido di etilene (ETO)

Tecnica piTecnica piùù usata nelle strutture sanitarie per usata nelle strutture sanitarie per sterilizzare materiale sterilizzare materiale termosensibiletermosensibileAlchilazioneAlchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, fenolici, idrossiliciidrossilici))12% ETO + 88% Freon (oppure CO12% ETO + 88% Freon (oppure CO22, N, N22))Fattori critici:Fattori critici:

Concentrazione ETOConcentrazione ETOTemperaturaTemperaturaUmiditUmiditàà relativarelativaTempo di esposizioneTempo di esposizioneNatura del materialeNatura del materiale

ETO ETO èè carcinogenocarcinogeno, mutageno. Impiego regolamentato., mutageno. Impiego regolamentato.


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SterilizzazioneSterilizzazioneTecniche CHIMICOTecniche CHIMICO--FISICHEFISICHE

Ossido di etilene (ETO)Ossido di etilene (ETO)Formaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)

Sterilizzazione Sterilizzazione chimicochimico--fisicafisicaFormaldeide (vapori)Formaldeide (vapori)

Reagisce con proteine cellulari, DNA, RNAReagisce con proteine cellulari, DNA, RNAVaporizzazione 2Vaporizzazione 2--5% formaldeide in 5% formaldeide in presenza di vapor acqueo a 60presenza di vapor acqueo a 60--8080°°CCFormaldeide Formaldeide èè carcinogenacarcinogena, residui trovati , residui trovati in materiale polimerico (cellulosa, gomma)in materiale polimerico (cellulosa, gomma)


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Scelta della tecnica di Scelta della tecnica di sterilizzazionesterilizzazione

AttivitAttivitàà:: battericida, battericida, tubercolicidatubercolicida, fungicida, , fungicida, sporicidasporicida, , virucidavirucidaRapiditRapiditàà di azione:di azione: sterilizzazione raggiunta in breve sterilizzazione raggiunta in breve tempotempoPenetrazione:Penetrazione: forte penetrazione allforte penetrazione all’’interno del interno del confezionamento e della strumentazioneconfezionamento e della strumentazioneCompatibilitCompatibilitàà:: non causa rilevanti cambiamenti non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti cicli di sterilizzazionecicli di sterilizzazioneAtossicitAtossicitàà:: non produce rischi per lnon produce rischi per l’’operatore e per operatore e per ll’’ambienteambienteResistenza a materiale organico:Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in efficacia invariata in presenza di materiale organicopresenza di materiale organicoCostoCosto--efficaciaefficacia:: costi ragionevoli per attrezzatura, costi ragionevoli per attrezzatura, installazione e operazioniinstallazione e operazioni

… in altre parole:

non esiste una tecnica di sterilizzazione IDEALE !


53

DISINFEZIONE

ANTISETTICO sostanza che, applicata sui tessuti umani, espleta azione batteriostatica o battericida sulle forme vegetative di molti patogeni (e alcuni virus)

DISINFETTANTE composto chimico antimicrobico ad azione aspecifica e non selettiva in grado di agire su superfici ed oggetti inanimati con effetto decontaminante sulle forme vegetative (e alcuni virus) fino a livello di sicurezza

TecnicheTecniche dididisinfezionedisinfezione

From: PR Murray et al From: PR Murray et al Medical Microbiology Medical Microbiology 3rd edition, 3rd edition, MosbyMosby, , 19981998


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DISINFEZIONEAldeidi

Formaldeide, glutaraldeideAlchilazione dei gruppi polari (aminici, idrossilici, fenolici) delle proteineFormaldeide

37%, formalina (sterilizzazione)3-8%, disinfenzione (tox, carcinogenico)

Glutaraldeide2%, battericida, fungicida, virucidaNo disinfezione superfici (vapori irritativi)Disinfezione per immersione di strumentazione ospedaliera: 2% glutaraldeide per 2-10 min(3-10 h per sporicidia)

DISINFEZIONEDISINFEZIONEAgenti ossidantiAgenti ossidanti

Perossido dPerossido d’’idrogeno (Hidrogeno (H22OO22), acido ), acido peraceticoperaceticoBattericidi, fungicidi, Battericidi, fungicidi, virucidivirucidiFormazione di radicali Formazione di radicali ossidriliciossidrilici in in grado di ossidare sistemi enzimatici grado di ossidare sistemi enzimatici critici per il microrganismocritici per il microrganismoUtilizzo principalmente industriale, per Utilizzo principalmente industriale, per la disinfezione di apparecchiature e la disinfezione di apparecchiature e materialimateriali


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DISINFEZIONEAlcooli

Etanolo, isopropanolo (60-85%)Danneggiano membrana citoplasmatica:

denaturazione (coagulazione) proteinesolubilizzazione lipidi

Battericidi, fungicidi, tubercolicidiEtanolo esibisce ampio spettro virucida (HIV, adenovirus, herpesvirus, virus influenzale, coxsachie B1 virus, poliovirus 1)

Disinfezione superfici in zone ben ventilate e lontano da fiamme

DISINFEZIONEFenoli e derivati fenolici

Fenolo: tossico, corrosivo, carcinogenicoDerivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H del ring aromaticoDistruzione membrana e parete cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione proteicaBattericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi

2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi)O-phenylphenol (Lysol), IrgasanEsaclorofene (Phisohex):

HLD per cocchi Gram+Strumenti chirurgici


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DISINFEZIONEAlogeni

Bromuri, fluoruri, cloruri, ioduriBattericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati per ridurre tox, instabilità e corrosivitàEliminazione di gruppi S-H:

Ossidazione: form. di ponti di-sulfidrilici inattiviCombinazione: ione metallico sottrae SH liberi

CloruriCl + p-toluene-sulfonamide (chloramine T)1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischi ematogeni (soluzione “recente”, cute pulita)

IoduriPVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico

DISINFEZIONEComposti ammonio quaternario

Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH4

+

Distruzione membrana cellulare, inattivazioneenzimatica, denaturazione (coagulazione) proteicaBatteriostatico (-cida ad elevate concentrazioni), fungistatico, virustaticoFrequenti infezioni da Gram- QUATs-associate(Pseudomonas spp. è QUATs-resistente)Non corrosivi, non tossici, economiciNeutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici


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DISINFEZIONESurfattanti

Saponi e detergentiSaponi e detergentiRimozione meccanica dei microrganismi Rimozione meccanica dei microrganismi (flora transitoria: (flora transitoria: GramGram--, 80%) per , 80%) per sfregamentosfregamentoI saponi degradano la pellicola I saponi degradano la pellicola idrolipidicaidrolipidica sopracutanea sopracutanea ((emulsificazioneemulsificazione))

DisinfezioneDisinfezione

-- SensibilitSensibilitàà relativarelativa-- LimitazioniLimitazioni


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ApplicaziApplicazione delle tecniche di one delle tecniche di disinfezionedisinfezione

Un Un approccioapproccio convenienteconveniente èè quelloquello suggeritosuggeritodada Spaulding, Spaulding, applicatoapplicato nellenelle lineelinee--guidaguida U.S.U.S.GliGli oggettioggetti cheche necessitanonecessitano didi essereesseredisinfettatidisinfettati o o sterilizzatisterilizzati sonosono classificaticlassificaticome:come:

criticicriticisemisemi--criticicriticinon non criticicritici

I I livellilivelli richiestirichiesti didi disinfezionedisinfezione sonosono::alto alto livellolivellointermediointermediobasso basso livellolivello

LivelliLivelli didi disinfezionedisinfezione

Alto Alto livellolivelloPer Per strumentazionistrumentazioni ““critichecritiche”” cheche sonosono a a contattocontatto con con tessutitessuti corporeicorporei e non e non possonopossonoessereessere sterilizzatisterilizzati ((laparoscopilaparoscopi, , artroscopiartroscopi, etc), etc)

IntermedioIntermedioPer Per strumentazionestrumentazione ““semisemi--criticacritica”” cheche puòpuò venire venire a a contattocontatto con con mucosemucose o cute, ma non o cute, ma non penetranopenetranoneinei tessutitessuti ((termometritermometri, etc), etc)

Basso Basso livellolivelloPer Per oggettioggetti ““non non criticicritici””, , disinfezionedisinfezione ambientaleambientale, , etcetc


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Spaulding’s scheme

AAltolto livello di livello di disinfezionedisinfezione

BBassoasso livello livello di di

disinfezionedisinfezione

IIntermediontermediolivello di livello di


Resistenza Resistenza dei dei

microrganismi microrganismi alla alla



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DISINFEZIONEFattori critici

Ambiente:temperatura (20-37°C)pH del mezzo in cui deve agire il disinfettante

Materiale:natura del materiale (porositàpresenza di materiale organico (sangue, pus)⌧Inattivazione principio attivo⌧Rivestimento superficie batterica⌧Adsorbimento (eliminazione) del principio attivo

Disinfettante:concentrazione del principio attivotempo di applicazione (contatto con materiale)qualità acqua per diluizione disinfettante

Microrganismo:tipologiacarica microbica

Il fenolo è il disinfettante più attivo

Coefficiente fenolicoRapporto tra la concentrazione minima di fenolo, capace di uccidere un germe test

(Salmonella typhimurium) in 10 minuti ma non in 5, e quella del composto in esame

DISINFEZIONEValutazione del potere disinfettante


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Scelta di un disinfettanteScelta di un disinfettante

AttivitAttivitàà:: esteso spettro di azione (battericida, esteso spettro di azione (battericida, fungicida, fungicida, tubercolicidatubercolicida, , virucidavirucida))RapiditRapiditàà di azione:di azione: breve breve ““tempo minimo di tempo minimo di applicazioneapplicazione””: 1: 1--10 minuti10 minutiAtossicitAtossicitàà:: non irritante per occhi, mucose, cutenon irritante per occhi, mucose, cuteNo colorazioniNo colorazioniNon corrosivoNon corrosivoStabilitStabilitàà:: per diluizioni e tempi consigliati (anche in per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico)presenza di materiale organico)Buona capacitBuona capacitàà di penetrazione e di penetrazione e detersionedetersioneCosti:Costi: ragionevoli (ragionevoli (economiciteconomicitàà))

Fenoli (superfici, oggetti)

Aldeidi (superfici, oggetti, strumenti

Cloro (oggetti, superfici, biancheria

Ammonio quaternario (pelle, ferite, oggetti)

Ossigeno attivo (ferite, strumenti)

Iodio (pelle, mani, ferite)

Clorexidina (pelle, mani, ferite)

Alcool (pelle, mani, ferite)

PseudomonasSporeB. kock

LievitiFunghiVirusGram-Gram +Principio attivo e (suo impiego)

Attivitànessuna

Solo su alcuneforme

Attivitàmedia

Attivitàbuona

LA DISINFEZIONE


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