METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e...

METODI IMMUNOMETRICI

• I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse.

campione +complesso antigene-anticorpo

anticorpo

quantificazione del complesso

antigene-anticorpo

LA NASCITA DEI METODI IMMUNOMETRICI

1942. Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluoresceina.

1959. Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977.

1960. Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche.

1969. Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide.

1969. Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA).

1971. Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida.

1972. Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT).

1975. Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione

Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab

Campioni fluidi (siero, urina, latte)

ANALISI DIRETTA

Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti)

OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE

ANALISI

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI


Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa

Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)

Piccoli volumi di campione Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi) Diagnosi precoce Determinazione di sostanze in tracce



Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti

Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica

Rapidità di esecuzione (poche ore)

Analisi di numerosi campioni per giorno



Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici

Ottimizzazione delle fasi analitiche

- errori precisione e accuratezza

- tempi di esecuzione rapidità


Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio:

dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka e kd sono le costanti di

velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la

costante di equilibrio

Ab An+ An-Abka

kd

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

ka

kd

=

ASPETTI TERMODINAMICI

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve

avere una Keq = 109-1012 M-1

Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico.

COME SI OTTIENE UN ANTICORPO

Mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità.È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma.

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II)

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI

Vantaggi Svantaggi

Caratteristiche (affinità e specificità) note e costanti

Spesso caratterizzati da bassa affinità

Solitamente caratterizzati da elevata specificità

Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene)

E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata

Non sempre reagiscono con la proteina A

Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare

Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene

Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione

Tecniche di produzione più sofisticate

Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier” (es. BSA o KLH) che ne aumenta la massa complessiva.

In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene.

ANTIGENI ED APTENI

braccio spaziatore

aptene

carrier

anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di

braccio spaziatore

anticorpi che riconoscono il carrier

anticorpi che riconoscono l’aptene

SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI

Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). La tendenza dell’anticorpo a legare altre molecole, strutturalmente simili all’analita, viene quantificata attraverso la sua reattività crociata.

Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici

posizione di coniugazione con la proteina carrier utilizzata per la sintesi dell’immunogeno

BaP

100% 40% 100% 100%100%

STRATEGIE DI SINTESI DELL’IMMUNOGENO

La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dell’immunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse applicazioni

immunogeno immunogeno

Anticorpo specifico per

l’analita

Anticorpo specifico per la

classe

Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio:

Ab An+ An-Abka

kd

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

ka

kd

=

ASPETTI TERMODINAMICI

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard.

Riprendendo l’equazione:

[An-Ab]eq

[An]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

SCATCHARD PLOT (I)

si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene:

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

ka

kd

=

[An-Ab]eq

[An]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero,

cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di

Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e

l’intercetta sull’asse x è Abt.

SCATCHARD PLOT (II)

High affinity

Low affinity

Abt

Keq

SCATCHARD PLOT (III)

[An-Ab]

[An

-Ab

]/[A

n]

Retta 1

Retta 2

Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima.

EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO

La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo:

• eterogeneità (differenza tra le due Keq);

• specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

SCATCHARD PLOT (IV)

TRACCIANTI

An + Ab An-Ab

La formazione del complesso An-Ab non è in genere facilmente misurabile. Viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto (non viene infatti rivelato direttamente l’analita) introducendo un tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità.

Il tracciante viene ottenuto legando un “label” opportuno (specie facilmente rivelabile con una opportuna tecnica analitica) all’antigene, ad un derivato dell’antigene o ad un anticorpo.

Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato

rapporto segnale/massa.

Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche

in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di

rivelazione del metodo.

LABEL

• Isotopi radioattivi (125I, 3H)• Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina)• Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio)• Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con

substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

SCELTA DEL LABEL

Tracciante: limite di rivelazioneIl tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10-12-10-20 g) e facilmente rivelabile

TRACCIANTE SEGNALE MASSA (moli/tubo)

125I ≈ 10.000 dpm 0.1 – 10 x 10-15

Enzima Assorbanza 10-15 – 10-16

Luminescenza 10-16 – 10-18

Fluorescenza 10-15 – 10-18

Amplificazione ciclica enzimatica

10-20 – 10-21

Molecola fluorescente

I fluorescenza 10-18 – 10-19

Molecola chemiluminescente

mV 10-16 – 10-18

Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante?

L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori.

E

S

La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante

L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

Vantaggi relativi all’uso di enzimi:

• sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili;

• sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica;

• una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto;

• è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei.

Svantaggi relativi all’uso di enzimi:

• l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti;

• la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica;

• si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

TRACCIANTI ENZIMATICI

Chemiluminescenza2-naphthyl--D-galactopyranoside

Fluorimetria4-metilumbelliferone

Spettrofotometria2-nitrofenolo-galattosidasi

ChemiluminescenzaAMPPD

Fluorimetria4-metilumbelliferone-fosfato

Spettrofotometria4-nitrofenilfosfatoFosfatasi alcalina

ChemiluminescenzaH2O2/luminolo

SpettrofotometriaH2O2/cromogenoPerossidasi

METODOLOGIA ANALITICA

SISTEMA DIRIVELAZIONE

ENZIMA

METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO(DELFIA)

•Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi (10-100 s)

•Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA

Può essere considerata una chemiluminescenza attivata per via elettrochimica anziché chimica.

Ru(bpy)32+

electrode

TPA

TPA

TPA

TPA

Ru(bpy)32+: ECL label

TPA: tripropylamine

TPA

products

photon

Ru(bpy)32+

Ru(bpy)32+*

Ru(bpy)33+

e-

TPA TPA+

e-

TPA●

- H+

CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA

VANTAGGI:•E’ una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato•Può essere “accesa” e “spenta” (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente)•Non ha segnale di fondo

Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con l’usi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche

magnete

Fasi di reazione e lavaggio:microsfere in sospensione

Fasi di eliminazione della soluzione:microsfere trattenute dal magnete

Elettrodi per la produzione del segnale ECL

METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV)

Sono a tutt’oggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys:

METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V)

COMPETITIVI

ETEROGENEI

NON COMPETITIVI

ETEROGENEI

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI

COMPETITIVI

OMOGENEI

NON COMPETITIVI

OMOGENEI

La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante

An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab).

L’equilibrio che si instaura è:

An + Ab An-Ab

+An*

An*-Ab

KAn

KAn*

Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono:

[An*]i = costante

[Ab]i = costante

[Ab]i < [An]i + [An*]i

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI

Aggiunta del campione

Aggiunta del tracciante

Incubazione

Lavaggio

Aggiunta del substrato

Misura del segnale

Fase solida

Anticorpo immobilizzato

Antigene

Tracciante

Enzima

Substrato enzimatico

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

segn

ale

log concentrazione analita

Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.

segn

ale

concentrazione analita


log [analita]

Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo.

1 2 3

aggiunta reattivi

reazione

separazione liberolegato

analita

tracciante

Conc. analita

Tracciante legato

0 4 16

24

1


B/B

0


La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.

La curva viene prodotta rappresentando B/B0 in funzione del logaritmo della concentrazione di analita.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita

B è il segnale a concentrazione x di analita

B/B

0


PARAMETRI QUANTITATIVI

Sensibilitàpendenza della curva

Intervallo dinamicoConvenzionalmente compreso fra

B/B0 90% e B/B0 10%

Limite di rivelazioneCalcolato in funzione della deviazione

standard di B0

MidrangeConcentrazione corrispondente

a B/B0 50%


a

c

a+d2

y

x

d

b = fattore di pendenza(*)

FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI

x = dose y = B

L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose

infinita) rende inutile la

sottrazione del segnale di fondo N

c

a

a/2

y

x

b = fattore di pendenza(*)

FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI

x = dose y = B-N

(*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

“FITTING” DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE

b

cx

1

ay

db

cx

1

day

erroriPROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE

SI ASSUME ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI

B/B

0log concentrazione analita

Ridurre la concentrazione del tracciante

Diminuire la quantità di anticorpo immobilizzato e riottimizzare il metodo (se la rivelabilità del tracciante è adeguatamente elevata, si sposta verso il basso il range dinamico)

Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo e riottimizzare il metodo

La rivelabilità assoluta del tracciante ha un effetto solo indiretto, permettendo di lavorare a concentrazioni minori.

Riduzione del limite di rivelazione:

La specificità di un anticorpo è la sua capacità di discriminare tra antigeni con struttura simile.Tra i vari modi per misurare la specificità di un anticorpo, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto.

SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO[A

n-A

b]/[

An]

0

50

100

[An]a b

100xb

a%CR

LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO

TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG

)B/B(1

B/Bln)B/B(itlog

0

0o

La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.


Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa.

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

Quanto costa un’analisi immunometrica?- Kit immunometrico per analisi del progesterone: 80 € (permette di effettuare 40 analisi in duplicato → 2 €/analisi)- Spettrofotometro per micropiastre con filtri per le adeguate lunghezze d’onda: 7500-10000 €- Altra attrezzatura indispensabile per l’analisi (micropipette, vortex, ecc.): 2000-3000 €- Materiali “disposable” (provette, puntali, ecc.): 10-20 € per ogni kit utilizzato- Tempo richiesto per l’analisi, includendo i tempi necessari per la preparazione dei campioni ed i tempi di incubazione: 3-4 ore per 40 campioni


• Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti

enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo,

mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria

attività catalitica.

• I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima

lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima

glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD)

è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior

capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito

all’interazione con l’anticorpo.

METODI COMPETITIVI OMOGENEI

EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

S

S

P

• Il tracciante in soluzione è attivo• Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita.

Sono stati proposti due sistemi.

conc. analita

attiv

ità e

nzim

atic

a


1° sistema:


S

SP

conc. analita

attiv

ità e

nzim

atic

a

• Il tracciante in soluzione è inattivo• Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.

2° sistema:



• L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola.

• Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, il piano di polarizzazione della luce emessa sarà parallelo a quello della luce assorbita.

luce assorbita luce emessa

fluoroforo

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)


• Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola.

• Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione.

fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare

La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa




Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa 10-100 ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns.

In condizioni di eccitazione costanti l’emissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. L’analita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato all’anticorpo in fase omogenea.

Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo.


METODI IMMUNOMETRICI NON COMPETITIVI

Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*)

[Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag]

L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi

Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei


Incubazione


Lavaggio


Misura del segnale

Fase solida

Anticorpo di cattura immobilizzato

Antigene

Tracciante

Enzima

Substrato enzimaticoAnticorpo dirivelazione

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”


Incubazione


Lavaggio


Misura del segnale


METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH”

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

DIRETTI INDIRETTI

DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo

Ab anti-ferritinamarcato con HRP

+ +

+

30 min25 °C

Lettura del segnale a 492 nmColorazione giallo-arancione

60 min37 °C

DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

CARATTERISTICHE DEL METODO

• Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml

• Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

Fase solida

Antigene di cattura immobilizzato

Anticorpo

Tracciante

Enzima

Substrato enzimatico

Anticorpo specie-

specifico


METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale


METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO

Marcatura diretta

Rivelazione mediante un anticorpo secondario

marcatoAb ottenuto nella

specie X

Ab anti-specie Xmarcato

Ab ottenuto nella specie X

Ab anti-specie Xbiotinilato

Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile

con un opportuno reagente

Streptavidina marcata


La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.La curva ideale è lineare.

Seg

nale

Concentrazione analita

In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione.

Seg

nale

Concentrazione analita

aspecifico

saturazione

Seg

nale


PARAMETRI QUANTITATIVI

Sensibilitàpendenza della curva

Intervallo dinamico

Limite di rivelazioneCalcolato in funzione della deviazione

standard del bianco

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI

Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo (l’antigene viene catturato più efficacemente dell’anticorpo) Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) ottimizzando le condizioni di rivelazione, utilizzando principi di rivelazione maggiormente sensibili o sistemi di rivelazione amplificati.

B/B

0


Riduzione del limite di rivelazione:

• Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi).

• Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono

sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale.

• In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso

enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence

resonance energy trasfer), ecc...

substrato

prodotto intermedio prodotto

finale

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

SISTEMA INDICATORI

i1/i2

SUBSTRATI PRODOTTI

P1/ P1

Enzimi

vicinali

Esochinasi/

GPDasi

ATP/glucosio

NAD+

Glucosio 6-fpsfato

Gluconolattone-6-fosfato + NADH

Enzimi

vicinali

GOasi/

POasi

Glucosio/

Donatore H

ossidato

Perossido/

Donatore H

ossidato

METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)

Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato)

alta %P

anticorpo analitamarcato(in eccesso)

bassa %P

[analita]

%P

METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI

Metodi eterogenei

Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione

Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione

Ampio ambito dinamico del metodo

Ambito dinamico del metodo inferiore

Bassi limiti di rivelazioneLimiti di rivelazione più elevati

Difficili da automatizzarePossono essere automatizzati facilmente

Esecuzione del metodo più complicata

Esecuzione semplice e rapida

Metodi omogenei

CARATTERISTICHECARATTERISTICHE

Test Tecnica Range Tempi analisi

FT4 Competizione 0-7 ng/ml 90’

T3 Competizione 0-6 ng/ml 60’

T4 Competizione 0.25µg/dl 60’

Ig-E Sandwich 0-500 IU/mL 180’

Prolattina Sandwich 0-400 ng/ml 60’

FSH Sandwich 0-150 mIU/ml 150’

Cortisolo Competizione 0-50 µg/dl 60’

ESEMPI DI TEST COMPETITIVI E NON COMPETITIVI

INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI

I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono:

- la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc;

- la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

•Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi (10-100 s)•Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO(DELFIA)

APPLICAZIONI: ESEMPI

Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica

clinica riguardano la determinazione di:

• ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva)

• farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi,

immunosoppressivi, antibiotici, ecc...)

• droghe d’abuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi,

cocaine)

• Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero,

proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine

• Interleuchine

• diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma,

Epatite

SENSIBILITA’ DEI METODI IMMUNOMETRICI

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay

Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) e fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

S S

TTCC

Negativo Positivo

Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura: - da negativo a 20 mg/l - da 20 a 50 mg/l - da 50 a 100 mg/l - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test: - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza: - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002 Conformità direttiva 98/79/CEE

LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY

DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter

In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: analizzatori automatici

Laboratori di grosse dimensioni utilizzano analizzatori automatici che, una volta inserito il campione, eseguono automaticamente le procedure di calibrazione, analisi del campione ed elaborazione dei dati.

Abbott TDx

REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI

In opportune condizioni la formazione del complesso antigene-anticorpo dà luogo ad una reazione di precipitazione: essendo le molecole di anticorpo bivalenti e possedendo spesso l’antigene due o più epitopi, si ottengono comunemente precipitati con legami reticolati (cross-linked). In un sistema ideale abbiamo tre zone:-(A) Eccesso di anticorpo (Ab)-(B) Zona di equivalenza (zona più interessante a fini analitici).-(C) Eccesso di Ag

Ag

Ab precipitato

A B C

REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE

La “composizione” del precipitato varia fortemente nelle tre zone.La precipitazione degli aggregati antigene-anticorpo (reazione di immunoprecipitazione) rappresenta una tecnica molto utilizzata per l’analisi qualitativa e quantitativa di componenti relativamente abbondanti nel siero, in particolare delle proteine sieriche.

Nell’ambito delle tecniche basate su reazioni di immunoprecipitazione abbiamo:-Tecniche basate sulla diffusione-Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida-Tecniche di tipo elettroforetico

In senso lato, anche le tecniche immunometriche propriamente dette (es. tecniche immunoenzimatiche) si possono considerare tecniche di immunoprecipitazione.

Ag

Ab

pre

cip

itato

A B C


Diffusione monodimensionale semplice: la soluzione contenente (potenzialmente) l’antigene in esame viene stratificata sopra un gel di agar contenente un opportuno antisiero. L’antigene migra nel gel, determinando la formazione di una o più bande di “precipitato” (complesso antigene-anticorpo) nelle zone ove si raggiungono rapporti ottimali di concentrazione (poiché queste zona variano nel tempo, le bande migrano verso il basso).

Diffusione monodimensionale doppia: fra le due soluzioni viene interposto un ulteriore stato di gel di agar (“zona neutra”). Le bande si formano quindi dove la diffusione di entrambe le specie porta al raggiungimento dei rapporti ottimali di concentrazione antigene/anticorpo.

Tecniche di diffusione monodimensionale

Soluzione contenente l’antigene

Gel di agar contenente l’antisiero

Diffusione

Zonaneutra Diffusione


Nelle tecniche di diffusione bidimensionale si utilizza uno strato di gel di agar, nel quale sono stati ricavati pozzetti nei quali vengono poste le soluzioni in esame e la soluzione di anticorpo. A seguito della diffusione radiale dei vari componenti, ove possibile si formano “archi” di precipitato che identificano l’avvenimento della reazione antigene-anticorpo.

Con opportune modificazioni questa tecnica è applicabile anche a fini quantitativi (es. tecniche di immunodiffusione radiale: usando solo l’antigene nei pozzetti, mentre l’anticorpo è disciolto nel gel di agar, l’area delle bande che si formano è proporzionale alla concentrazione dell’antigene).

Tecniche di diffusione bidimensionale

Soluzioni contenente l’antigene

Soluzione contenente l’anticorpo

Diffusione

Reazione antigene-anticorpo

Nessuna reazione


Nelle tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida il precipitato formatosi a seguito della reazione antigene-anticorpo viene di solito quantificato attraverso l’effetto Tyndall, ovvero la dispersione della luce incidente.

Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida

La quantificazione del precipitato può avvenire mediante turbidimetria o nefelometria (la seconda è nettamente più sensibile, permettendo di raggiungere limiti di rivelazione nettamente minori di quelli ottenibili con le tecniche di diffusione).

Luce incidente

Misura della luce “assorbita”:

turbidimetria

Misura della luce diffusa: nefelometria


Rivelazione

USO DI PARTICELLE DI POLISTIRENE PER METODI IMMUNOMETRICI(es:PACIA - Particle Counting Immunoassay o misure di diffusione)

METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e...

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