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Validazione dei metodi a singolo residuo per la determinazione dei residui di fitofarmaci in
prodotti di origine vegetale
IX Convegno "Attivit dell'Amministrazione Pubblica in materia di controllo dei residui di fitofarmaci negli alimenti 17 Novembre 2011
Angela Santilio Istituto Superiore di Sanit
Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria
Reparto Antiparassitari
V.le Regina Elena, 299 00161 Roma
Email: [email protected]
mailto:[email protected]

INTRODUZIONE
Laboratorio Nazionale di Riferimento metodi a singolo residuo
ha validato in accordo alla linea guida SANCO/10684/2009
(ultimo aggiornamento 01/01/2010) i seguenti metodi a singolo
residuo:
Determinazione di residui di fenossiacidi in pomace e in ortaggi a
radice e tubero (Metodo MI03 accreditato)
Determinazione dei residui di erbicidi acidi in cereali
(programmato per laccreditamento)

INTRODUZIONE
QuEChERS metodologia con LC/MS/MS
Colture Composti
Carote
2,4-D, MCPA, MCPP, Haloxyfop, Fluazifop Mele
Sedano rapa
Segale/Avena 2,4-D, MCPA, Dichlorprop, Dichloprprop-p,
Mecoprop, Mecoprop-p, Fluazifop,
Fluroxypyr

INTRODUZIONE
Parametri di validazione secondo SANCO/10684/2009
Accuratezza Recuperi medi a due livelli di aggiunta (LOQ and
10LOQ) 70-120%
Precisione Determinazione della ripetibilit per entrambi I livelli
di aggiunta riproducibilit intralaboratorio (RSDwR)
20%
Specificit Risposta del bianco reagenti

METODO SU FRUTTA E VEGETALI (MI03)
10 g campione (mele, carote, sedano rapa)
10 mL CH3CN agitare per 1 minuto mediante agitatore
meccanico (Vortex)
Aggiungere 4g Na2SO4, 1 g NaCl, 0.1 mL H3PO4 agitare per 1 minuto con Vortex
Centrifugare per 5 minuti a 3500 rpm
Filtrare su Anotop 0.2 m in un matraccio da10 mL,
portare a volume con CH3CN
Iniettare in LC/MS/MS

(condizioni strumentali)
Varian System ProStar (HPLC) con Varian 1200L Quadrupole MS/MS
Colonna: Aquasil C18 150 x 2.1 mm, 5 m
Fase mobile: CH3CN/H2O acidificata con acido acetico 0.1%
Flusso colonna: 0.3 mL/min
2,4-D
MCPA
MCPP
Fluazifop
Haloxyfop
Cromatogramma di standard in carota a 0.5 mg/kg (rosso) e
recupero in carota at 0.5 mg/kg (verde)

(Accuratezza e Precisione)
COMPOSTI MELE CAROTE
Livello aggiunta (mg/kg) Livello aggiunta (mg/kg)
0.05
0.5
0.05
0.5
Recuperi medi (n=6) S.D.; C.V.%
2,4-D 70 12; 17 73 5; 7 80 11; 14 82 8; 10
MCPA 75 9; 12 75 4; 5 71 7; 10 81 3; 4
Mecorprop/MCPP 92 12; 13 77 5; 6 72 8; 11 84 11; 13
Fluazifop 78 6; 8 77 4; 5 89 12; 13 89 17; 19
Haloxyfop 81 8; 10 75 6; 8 75 7; 9 78 2; 3

COMPOSTI SEDANO RAPA
Livello di aggiunta 0.5 mg/kg
Recupero medio (n=3) S.D.; C.V.%
2,4-D 71 6; 8
MCPA 74 7; 9
Mecorprop/MCPP 74 5; 7
Fluazifop 84 6; 7
Haloxyfop 73 6; 8
(Accuratezza e Precisione)

(Linearit)
MCPA
transizione 199>141
y = 2E+08x - 1E+06
R2 = 0,9967
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
2,4-D
transizione 219>161
y = 2E+08x - 702942
R2 = 0,999
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
80000000
90000000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
MCPP
transizione 213>141
y = 2E+08x - 2E+06
R2 = 0,9997
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6Fluazifop
transizione 326>254
y = 3E+08x - 3E+06
R2 = 0,9969
0
50000000
100000000
150000000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Haloxyfop
transizione 360>288
y = 1E+08x - 145653
R2 = 0,9978
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
0 0,2 0,4 0,6
Soluzioni di calibrazione in solvente: 0.025 g/mL, 0.05 g/mL, 0.1 g/mL, 0.2 g/mL , 0.5 g/mL

(effetto matrice)
Cromatogrammi (TIC) di: (a) soluzione standard in CH3CN a 0.05 g/mL(mg/kg) e
(b) soluzione standard in matrice (mele) a 0.05 mg/Kg
(a)
(b)

(TIC)
Cromatogramma (TIC) di: una soluzione standard in matrice (carota) a 0.05 mg/kg (verde) e di un
bianco matrice (carota) (rosso)

(MRM)
MCPA
MCPP
2,4-D
Haloxyfop
Fluazifop
219 > 125
219 > 161
213 > 105
213 > 141
199 > 141
201 > 143
360 > 288
362 > 290
326 > 108
326 > 226
326 > 254

(incertezza estesa)
Mela Carota
2,4-D MCPA MCPP Fluazifop Haloxyfop 2,4-D
MCPA MCPP
Fluazifop
Haloxyfop
Concentrazione
(mg/kg)
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
S (mg/kg) 0.0080 0.0055 0.0070 0.0034 0.0031 0.0070 0.0048 0.0055 0.0048 0.0049
CV% 16% 11% 14% 7% 6% 14% 10% 11% 10% 10%
Gradi di libert 8 12 11 14 9 5 18 9 9 11
Fattore di copertura
(k)
2.31 2.18 2.20 2.14 2.26 2.57 2.10 2.26 2.26 2.20
Incertezza estesa
(U%)
20% 15% 16% 14% 18% 40% 12% 18% 17% 15%

(Robustezza Youden )
Approccio Youden secondo Direttiva 96/23/CE
Identificazione di 4 fattori critici nel metodo
Per ogni prova sono state condotte 5 ripetizioni ai livelli legali
(intervallo 0.05-0.5 mg/kg)
Per ciascuna prova effettuata sono stati calcolati:
Recupero medio (n=5)
Deviazione standard (s)
Deviazione standard relativa (RSD%)

1 2 3 4 5 6 7 8
A/a A A A a a a a A
B/b B B b B b b B b
D/d D d d d d D D D
G/g G g g g g G G G
Results S T U V W X Y Z
A = operatore 1
B = matrice (carota)
D = centrifuga 3500 rpm
G = CH3CN (HPLC grade)
a = operatore 2
b = matrice (sedano rapa)
d = centrifuga 3000 rpm
g = CH3CN (RP grade)
Per ciascuna prova sono state introdotte pi variazioni secondo il seguente prospetto

Leffetto di un particolare parametro stato stimato sottraendo
la media dei risultati ottenuti con la modifica alla media dei risultati ottenuti
nelle condizioni invariate secondo lequazione
Db = (S + T + V + Y)/4 (U + W + X + Z)/4
Per stabilire se la differenza Di significativamente diversa da zero
stato applicato il test di significativit con la seguente formula:
t = [(n) x /i/] /(2) x s
dove:
n il numero degli esprimenti per ciascun parametro (nel nostro caso 4)
/i/ il valore assoluto delle differenze
s scarto tipo del metodo (calcolato come lo scarto tipo della media delle
prove effettuate durante la validazione)

2,4-D FLUAZIFOP HALOXYFOP MCPA MCPP
s 11.23 6.7 7.27 6.7 8.05
ta -0.19 1.52 0.93 0.06 -0.37
tb 0.52 -0.45 0.97 1.26 1.60
td -0.42 -2.13 -1.10 -0.84 -0.52
tg -0.42 -2.13 -1.10 -0.84 -0.52
Confronto del valore sperimentale di t con il valore di t teorico 95% di probabilit
(2 code) con 7 gradi di libert t teorico = 2.36
t sperimentale < t teorico metodo robusto

Metodo validato soddisfa i requisiti del documento
SANCO/10689/2009
Partecipazione a PT Europei (EUPT CRL)
Metodo stato accreditato
(Conclusione )
EUPT/anno Coltura
Composto Risultato
(z-score)
EUPT
SRM3/2008
Carota MCPA (Acido libero) -0.7
Fluazifop (Acido libero) -0.8
EUPT SRM5/2010 Mele Fluazifop (Acido libero) -0.9

METODO SU CEREALI
(idrolisi alcalina - segale) 5 g ( 0.01g) un campione omogeneo di segale in un tubo PTFE da 50mL,
aggiungere 10 mL of H2O fredda (+4 C) e agitare su vortex
Aggiungere 300 L di 5N NaOH agitare e lasciare per 30 minuti,
agitare occasionalmente (e.g. 10 minuti)
Aggiungere 300 L di 5N H2SO4 e agitare; aggiungere 10 mL di CH3CN seguito da 100 L di Nicarbazin a 20 g/mL (IS); agitare il tubo mediante
vortex per 1 minuto
In un tubo da 15 mL PTFE miscelare, 4 g MgSO4 anidro, 1 g of
NaCl, 1g Na3C6H5O7*2H2O, 0.5 g C6H6Na2O7*5

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