UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Scuola di Specializzazione in Endocrinologia e Malattie del Ricambio

ad Indirizzo Malattie del Ricambio e Diabetologia

Direttore: Prof. Stefano Del Prato

Tesi di Specializzazione

Espressione genica del tessuto adiposo

nella gravidanza fisiologica

Relatore: Candidata:

Chiar.mo Prof. Stefano Del Prato Dr.ssa Veronica Resi

Anno Accademico

2010/2011

1

Sommario

Indice............................................................................................................................. 1

Riassunto ....................................................................................................................... 3

Introduzione ................................................................................................................. 5

Fisiologia del Metabolismo in Gravidanza ....................................................................... 6

Metabolismo Glucidico .........................................................................................................6

Insulino Resistenza ............................................................................................................7

Significato Adattivo dell’Insulino Resistenza……………………………………………………………8

Secrezione Insulinica…………………………………………………………………………………..……..8

Ormoni associati alle variazioni di secrezione ed azione insulinica .................................. 12

Prima Fase di Gravidanza............................................................................................... 15

Fase Finale di Gravidanza .............................................................................................. 17

Impatto Sulla Concentrazione dei Nutrienti Materni ...................................................... 19

Metabolismo Lipidico .................................................................................................... 20

Metabolismo Proteico ................................................................................................... 22

La Composizione Materna Riflette i Cambiamenti Omeostatici ....................................... 24

Funzione Endocrina e Metabolica del Tessuto Adiposo .................................................. 25

Rimodellamento del Tessuto Adiposo ................................................................... 27

Lo Scopo dello Studio .................................................................................................... 28

Soggetti e Metodi .......................................................................................................... 29

Caratteristiche Metaboliche e Antropometriche ............................................................ 30

Analisi Biochimica ......................................................................................................... 31

Analisi del Tessuto Adiposo ........................................................................................... 32

Caratteristiche delle Cellule Adipocitarie ......................................................................... 32

Immunoistochimica ................................................................................................... 32

Espressione Proteica .......................................................................................... 33

Analisi Statistica ............................................................................................................ 34

Risultati ........................................................................................................................ 35

Cambiamenti Fenotipici e Metabolici Longitudinali ....................................................... 35

Caratteristiche Molecolari del Tessuto Adiposo ..................................................... 38

2

Discussione ................................................................................................................... 49

Espansione e Rimodellamento del Tessuto Adiposo…………………………………………………50

Espansione e Rimodellamento del Tessuto Adiposo……………………………………..52

Infiammazione…………………………………………………………………………………..…54

Conclusioni ................................................................................................................... 56

Bibliografia ................................................................................................................... 57

Ringraziamenti .............................................................................................................. 76

3

Riassunto

I cambiamenti endocrino-metabolici del tessuto adiposo sono fondamentali per gli

adattamenti dell’omeostasi energetica a cui va incontro l’intero organismo durante

tutta la gravidanza. Al fine di approfondire la conoscenza circa i meccanismi

molecolari che supportano il rimodellamento tissutale, abbiamo caratterizzato i

cambiamenti longitudinali del genoma del tessuto adiposo nella gravidanza

fisiologica. 11 donne sane normopeso sono state reclutate prima della gravidanza e

seguite longitudinalmente nel primo periodo (8^-12^ settimana) e nell’ultimo

periodo (36^-38^ settimana) di gravidanza. Sono state eseguite biopsie del tessuto

adiposo sottocutaneo in regione gluteale ad ogni punto dello studio. Il trascrittoma

adiposo è stato esaminato mediante l’analisi del DNA genoma con microarray.

L’espressione dei geni correlati al sistema immunitario e ai componenti della

matrice extra-cellulare è stata validata utilizzando l’analisi RT-PCR. La massa

adiposa, la dimensione e il numero degli adipociti incrementavano

significativamente nell’ultimo periodo di gravidanza rispetto ai valori prima della

gravidanza (p<0.001), mentre non si osservavano modifiche nel primo periodo di

gestazione. Il trascrittoma adiposo si modifica in gravidanza, con un 10-15% di geni

differentemente espressi rispetto al periodo pre-gravidanza. L’analisi funzionale

genica per gruppi ha rivelato che i cambiamenti molecolari nel primo periodo di

gravidanza interessano la risposta immunitaria, l’angiogenesi, il rimodellamento

della matrice e la sintesi lipidica. L’incrementata espressione dei marker macrofagici

(CD68, CD14 e il recettore del mannosio-6 fosfato) enfatizzano il reclutamento del

sistema immunitario sia nel primo che nell’ultimo periodo di gestazione. In

particolare, è attivata la via di segnale di TLR4-NFkB in relazione ai geni delle

adipochine infiammatorie e delle chemochine. Il precoce reclutamento della rete

molecolare del sistema immunitario e del metabolismo lipidico precede la comparsa

dei cambiamenti fisiologici relativi alla gravidanza del tessuto adiposo materno. Il

pattern bifasico suggerisce che l’infiammazione fisiologica è uno step precoce che

4

precede lo sviluppo dell’insulino-resistenza presente nell’ultimo periodo di

gravidanza.

5

Introduzione

La gravidanza umana è uno stato caratterizzato da numerose modifiche dell’

adiposità materna, gli adattamenti del metabolismo lipidico materno si modificano

per tutta la durata della gravidanza. Possiamo distinguere nella gravidanza

fisiologica, due momenti differenti, sia per quanto riguarda l’omeostasi metabolica

sia per quanto riguarda il rimodellamento del tessuto adiposo: il primo periodo di

gestazione e l’ultimo. Le due fasi metaboliche sono associate con adattamenti della

funzione delle cellule adipocitarie e con il rimodellamento dei tessuti, con

conseguente prevalenza di percorsi lipogenici nel primo periodo e percorsi lipolitici

nell’ultimo. L'accumulo di tessuto adiposo è il risultato di un equilibrio tra la sintesi

dei lipidi e la loro ripartizione. Conosciamo bene dalla letteratura che l’obesità

materna e il diabete gestazionale alterano gli aggiustamenti metabolici materni e

influenzano lo sviluppo placentare, embrionico e la crescita fetale. Sappiamo bene

che l’obesità materna pre-gravidica e il successivo sviluppo di diabete gestazionale

sono in continua espansione in tutto il mondo. Numerosi studi ci hanno permesso di

comprendere i meccanismi ormonali e le modifiche dell’omeostasi materna che

sottendono i cambiamenti a cui va incontro l’organismo materno nel corso della

gravidanza. Per meglio conoscere e trattare la gravidanza complicata da eccessivo

incremento ponderale o obesità è necessario comprendere i meccanismi

molecolari, ancora non noti, responsabili delle modifiche fenotipiche nel corso di

una gravidanza fisiologica. Comprendere i meccanismi molecolari ed endocrino-

metabolici nel corso della gravidanza fisiologica rappresenta il punto di partenza

imprescindibile per la comprensione, la gestione, il trattamento e il miglioramento

dell’outcome materno-fetale nella gravidanza patologica.

6

Fisiologia del Metabolismo in Gravidanza

La gravidanza è caratterizzata da un complesso rimaneggiamento endocrino-

metabolico finalizzato a garantire il necessario apporto di nutrienti al feto e

preparare adeguatamente l’organismo materno al parto e alla lattazione (1). Le

principali modifiche metaboliche che si osservano in gravidanza si possono

riassumere in una riduzione della sensibilità insulinica, un aumento della risposta -

cellulare, un modesto aumento delle glicemie, soprattutto post-prandiali, ed una

alterazione dei livelli circolanti di acidi grassi liberi, dei trigliceridi, del colesterolo e

dei fosfolipidi.

Metabolismo Glucidico

La condizione di insulino-resistenza che si instaura con il progredire della

gravidanza, più evidente a livello del tessuto muscolare e adiposo (2), è una

condizione fisiologica finalizzata alla crescita fetale. La minore utilizzazione del

glucosio insulino-mediata da parte dell’organismo materno, determina, infatti, una

maggiore utilizzazione dei substrati lipidici a fini energetici, e contemporaneamente

garantisce al feto un maggior apporto di carboidrati. Inoltre, la modesta ma più

prolungata iperglicemia postprandiale, che si sviluppa per effetto della minore

sensibilità insulinica, favorisce il flusso di nutrienti dalla madre al feto (3). Le basi

molecolari dell’insulino-resistenza periferica che si sviluppa in gravidanza,

interessano prevalentemente le tappe post-recettoriali con alterazioni

dell’attivazione del recettore insulinico e del trasporto e del metabolismo del

glucosio (4). Nella gravidanza normale la glicemia basale rimane pressoché costante

fino al terzo trimestre. Le variazioni della secrezione e dell’azione insulinica

dipendono dalle alterazioni endocrine che accompagnano la gravidanza.

7

Insulino-Resistenza

Nelle fasi iniziali della gravidanza la sensibilità insulinica sembra essere normale se

non addirittura aumentata (5). E’ con il suo progredire che si instaura una

condizione di insulino-resistenza, più spiccata a livello del tessuto muscolare che

adiposo. La riduzione della sensibilità insulinica è evento comune ed indipendente

dalla condizione di partenza. Catalano e coll. (6, 7)(Fig.1) utilizzando la tecnica del

clamp euglicemico-iperinsulinemico hanno stimato, nel terzo trimestre di

gestazione, una riduzione della sensibilità insulinica del 47% nelle donne obese e del

56% in quelle normopeso. Secondo altri studi, con il progredire della gravidanza, si

registra una riduzione della sensibilità insulinica fino al 60-80% (8)

Fig.1 The longitudinal changes in insulin sensitivity in normal glucose tolerant women as

estimated by the hyperinsulinemic euglycemic clamp. Early pregnancy 12-14 weeks and late

pregnancy 34-36 weeks; longitudinale changes over time, p=0.0001.(6)

8

La minore sensibilità insulinica che si instaura in gravidanza, sembra essere un

evento fisiologico che favorisce l’utilizzo di substrati di pronto impiego (carboidrati)

da parte del feto. La minore utilizzazione insulino-mediata di glucosio determina

infatti un prevalente impiego, ai fini energetici, di substrati lipidici (acidi grassi liberi)

da parte dei tessuti materni, risparmiando i carboidrati per il feto. La modesta ma

più prolungata iperglicemia post-prandiale che si sviluppa per effetto della minore

sensibilità insulinica favorisce il flusso di nutrienti dalla madre al feto (9, 10).

I determinanti cellulari dell’insulino-resistenza in gravidanza non sono noti. I

principali passaggi coinvolti nell’up-take insulino-dipendente di glucosio possono

essere compromessi nelle donne gravide. La riduzione della sensibilità insulinica

diventa ancor più evidente nelle donne con diabete gestazionale, sia magre che

obese. L’insulino-resistenza periferica che si instaura in corso di gravidanza è molto

simile a quella osservabile in soggetti con diabete Tipo 2. Come in quel caso, il

difetto di azione insulinica sembra coinvolgere più le tappe post-recettoriali con

alterazioni dell’attivazione del recettore insulinico e del trasporto e metabolismo

del glucosio nei tessuti insulino-sensibili. Lo studio del legame insulinico al proprio

recettore di membrana non ha dimostrato alterazioni significative sia nella

gravidanza normale che nel GDM (11, 12). Rispetto allo stato pregravidico, è stata

dimostrata invece una ridotta funzione (30-40%) dell’attività tirosino-chinasica del

recettore insulinico del muscolo scheletrico di donne obese, sia nella gravidanza

normale che in quella con GDM (13, 14).

Una riduzione dell’attività del substrato del recettore insulinico (IRS) è stata pure

segnalata. L’espressione di IRS-1 si riduce in animali da esperimento in gravidanza

(15) e la stessa osservazione è stata confermata a livello del muscolo scheletrico di

donne nelle ultime settimane di gravidanza, sia normo-tolleranti che con GDM (14).

La fosforilazione tirosinica di IRS-1 indotta dall’insulina risulta ridotta, rispetto allo

stato pregravidico, del 28% nella gravidanza normale e del 41% in quella con GDM.

Da segnalare, infine, che nelle fasi finali della gravidanza e in maggior misura in

9

quella complicata da GDM, si assiste ad una riduzione delle concentrazioni cellulari

del trasportatore insulino-dipendente del glucosio GLUT4 (16, 17).

E’ possibile che, oltre a variazioni intrinseche della funzione delle proteine della

cascata del segnale insulinico, altri fattori possano contribuire alla sua modulazione.

Recentemente è stato ipotizzato, sulla base di esperienze condotte in vitro (18), un

ruolo per le glicoproteine di differenziazione cellulare plasmatica come la PC-1 che

sono maggiormente espresse nel muscolo scheletrico di donne normo-tolleranti e

con GDM (13). La riduzione della sensibilità insulinica è risultata correlata ai livelli

del fattore di necrosi tumorale (TNF-). L’aumento di questa citochina, prodotta

dall’adipocita, è associato con un aumento della massa grassa materna (19).

Sebbene l’ormone lattogeno placentare (hPL) sia stato spesso citato come la causa

della ridotta sensibilità insulinica (20), a causa della sua produzione placentare e del

suo incremento con il progredire della gravidanza, più recentemente il ruolo delle

citochine infiammatorie e l’incremento dei livelli di acidi grassi liberi (FFA) è stato

correlato con i cambiamenti longitudinali nella sensibilità-insulinica nelle donne non

gravide (21) cosi come nelle donne in gravidanza (22). Il meccanismo cellulare

dell’insulino-resistenza in gravidanza è pertanto multifattoriale e coinvolge diverse

tappe della generazione e propagazione intracellulare del segnale insulinico .

10

Significato Adattivo dell’Insulino-Resistenza

I vantaggi adattivi dell’insulino-resistenza, dell’iperinsulinemia e della lieve

iperglicemia post-prandiale possono essere doppi. Primo, come suggerito da

Freinkel e coll. (23) , la modesta iperglicemia postprandiale serve ad aumentare la

durata del periodo in cui i livelli glicemici materni sono superiori ai livelli basali dopo

il pasto, aumentando quindi il flusso di nutrienti dalla madre al feto e favorendo

l’anabolismo fetale. Secondo, nella misura in cui l’insulino-resistenza nel muscolo

scheletrico è più spiccata rispetto a quella nel tessuto adiposo (24), la prima può

favorire il dirottamento di nutrienti ingeriti verso il tessuto adiposo, promuovendo

quindi anche l’anabolismo materno e l’immagazzinamento di energia durante

l’assunzione di cibo.

Secrezione Insulinica

Sia nella gravidanza normale che nel GDM, la secrezione insulinica aumenta

progressivamente dal primo trimestre fino a raggiungere la massima entità nel terzo

e tornare ai valori normali dopo il parto (25,26). La risposta insulinica dopo carico

orale di glucosio si associa ad un aumento del 120% della prima fase di secrezione

insulinica alla 12^-14^ settimana gestazionale. La seconda fase non sembra invece

essere particolarmente interessata, almeno nelle prime settimane di gravidanza. La

risposta insulinica ad un test di tolleranza al glucosio per via endovenosa (IVGTT)

(27) è aumentata rispetto ai valori precedenti (28) e successivi la gravidanza. I livelli

plasmatici a digiuno di proinsulina e dei suoi precursori sono aumentati nel corso

della gravidanza e ritornano ai valori normali nel post-partum. L’aumento della

proinsulina in gravidanza è certamente espressione di un blocco maturativo nel

processo di secrezione dell’insulina, secondario ad uno stress secretorio (29). Infatti

per soddisfare l’aumentata richiesta di insulina che si sviluppa in corso di

gravidanza, le isole di Langerhans vanno incontro a importanti cambiamenti

11

strutturali e funzionali caratterizzati da ipertrofia e iperplasia -cellulare (30)

(Tab.1).

Tab 1. Effetti della gravidanza sul metabolismo glucidico

Metabolismo glucidico

Glicemia

↓ Glicemia a digiuno ↑ Glicemie post prandiali

Secrezione insulinica

Dopo stimolo glucidico

1° fase

2° fase

↑ Gravidanza normale - ↑ Diabete gestazionale ↑↑ Gravidanza normale - ↑ Diabete gestazionale ↑↑ Gravidanza normale - ↑ Diabete gestazionale ↑ Gravidanza normale - ↑ Diabete gestazionale

Insulino-resistenza

Sede

Meccanismi cellulari

↑ Gravidanza normale - ↑↑ Diabete gestazionale Tessuto muscolare ↓ Attività tirosino-chinasica ↑ PC 1 ↑ IRS ↑ TNF alfa ↓ Glut 4

12

Ormoni associati alle variazioni di secrezione ed azione insulinica

Per quanto il meccanismo specifico delle variazioni di secrezione ed azione

insulinica rimanga incerto, è probabile che un contributo sostanziale sia fornito

dalle alterazioni endocrine che accompagnano la gravidanza. I cambiamenti della

funzione -cellulare avvengono in parallelo con lo sviluppo dell’unità feto-

placentare e la produzione locale di ormoni quali la somatotropina corionica umana

(HCS), il progesterone, il cortisolo, e la prolattina (Tab.2). Questi ormoni sono in

grado di indurre insulino-resistenza sia in vitro che in vivo. Nell’animale da

esperimento, inoltre, è stato ampiamente dimostrato come essi possano

influenzare la funzione delle -cellule e/o la sensibilità dei tessuti periferici

all’insulina.

Estrogeni e progesterone aumentano durante le fasi precoci della gravidanza e sono

implicati nelle alterazioni glicometaboliche materne. Sperimentalmente è stato

dimostrato che gli estrogeni aumentano la concentrazione ed il legame insulinico

(31), mentre il progesterone comporta una diminuzione della tolleranza glucidica

attraverso la diminuzione del trasporto del glucosio e del legame dell’insulina al suo

recettore. Inoltre il progesterone inibisce la soppressione insulinica della neo-

glucogenesi epatica (32). La concentrazione plasmatica di cortisolo aumenta in

gravidanza di circa il doppio rispetto allo stato non gravidico. Recenti osservazioni

hanno dimostrato che l’eccesso di glucocorticoidi induce insulino-resistenza a

livello post-recettoriale con una diminuita fosforilazione del recettore insulinico ed

una minore contenuto di IRS-1 (33). L’ormone lattogeno placentare svolge azioni

simili a quelle dell’ormone della crescita (GH) e, insieme al GH di origine placentare,

stimola la produzione di IGFs, modula il metabolismo intermedio e favorisce la

disponibilità di glucosio ed aminoacidi per il feto (34,35). Per la sua analogia con il

GH, l’hPL è stato a lungo considerato uno dei principali fattori responsabili

dell’insulino-resistenza tipica della gravidanza (31) e dell’aumento della glicemia.

13

Nella gravidanza complicata da diabete gestazionale, le alterazioni riscontrate a

carico dell’espressione dei geni della famiglia ormone della crescita/somatotropine

corioniche sarebbero responsabili dell’alterato rapporto nella produzione dei due

ormoni a favore dell’ormone della crescita (36). Dati recenti depongono per un

possibile effetto plastico sulla massa beta-cellulare esercitato dall’azione dei

lattogeni placentari (hPL, GH, PRL) (37). Studi in vivo ed in vitro hanno evidenziato

che l’hPL induce nelle isole di Langerhans gli stessi cambiamenti osservabili in

gravidanza. Questi cambiamenti sono rappresentati da un aumento della secrezione

glucosio stimolata dell’insulina e riduzione della soglia di stimolo glucidico (38,39),

un aumento della sintesi d’insulina (40), un aumento dell’utilizzo e dell’ossidazione

del glucosio (41, 42), ipertrofia ed iperplasia cellulare (43) ed un aumento del cAMP

intracellulare (44).La prolattina aumenta di 5-10 volte durante la gravidanza, ma il

suo ruolo nello sviluppo delle alterazioni metaboliche in gravidanza non è ancora

ben definito (45). La leptina, un prodotto del gene ob, è un ormone polipeptidico di

167 aminoacidi scoperto nel 1994 (46). E’ secreta dal tessuto adiposo ed agisce a

livello ipotalamico attraverso l’inibizione del fattore stimolante l’appetito

(neuropeptide Y) e l’aumento della termogenesi (47). Le concentrazioni di leptina

aumentano significativamente nel corso della gravidanza, raggiungendo un picco nel

secondo trimestre e restando elevate fino all’espletamento del parto. Le azioni

proprie della leptina sono difficilmente conciliabili con le finalità della gravidanza ed

è stato ipotizzato che la gravidanza possa rappresentare uno stato di leptino-

resistenza (48, 49). I livelli plasmatici circolanti di leptina correlano con l’insulinemia

e la massa adiposa materna e, come tali, possono essere considerati un indicatore

di insulino-resistenza ed obesità (50). Sul versante fetale, gli alti livelli di leptina

nella vena ombelicale suggeriscono che la placenta possa essere una delle maggiori

sedi di produzione di leptina fetale. Le sue concentrazioni sono correlate con il peso

alla nascita e con gli altri indici antropometrici fetali (51, 52). Gli studi disponibili

indicano che la leptina svolge un ruolo nella crescita fetale e può interferire con il

metabolismo glucidico materno, anche se i meccanismi di queste azioni non sono

ancora ben definiti.

14

Tab.2 Effetti degli ormoni della gravidanza sul metabolismo glucidico

ORMONI

AZIONE

ESTROGENI

↑ Concentrazione insulinica ↑ Legame insulina-recettore

PROGESTERONE

↓ Trasporto del glucosio ↓ Legame insulinico al recettore ↓ Soppressione insulinica della neoglucogenesi

CORTISOLO

↑ Insulino-resistenza per: _ ↓ Fosforilazione recettore insulinico _ ↓ IRS-1

LATTOGENI PLACENTARI

(hPL, GH, PRL)

↓ Sensibilità insulinica ↑ Sintesi insulinica ↓ Soglia di stimolo glucidico ↑ Secrezione insulinica ↑ Utilizzazione del glucosio ↑ cAMP intracellulare

↑ Proliferazione delle β-cellule ↑ Massa delle β-cellule

LEPTINA

↑ Insulino-resistenza (?)

15

Prima Fase di Gravidanza

Durante la prima fase di gravidanza, la tolleranza glucidica è normale o leggermente

aumentata e la sensibilità periferica (muscolo scheletrico) all’insulina e la

produzione epatica basale di glucosio sono normali (5-7). Con la tecnica del clamp

euglicemico-iperinsulinemico e mediante la tecnica dell’ IVGTT (Intravenous-

Glucose-Tolerance Test) è stato osservato che l’effetto di abbassamento della

glicemia indotto dalla somministrazione esogena di insulina, è più elevato del

normale nel primo trimestre di gravidanza rispetto al secondo e al terzo. Anche la

risposta insulinica al carico orale di glucosio è maggiore nel primo trimestre rispetto

a prima della gravidanza. Queste osservazioni sono consistenti con un 120% di

incremento alla 12^-14^ settimana di gestazione nella prima fase di secrezione

insulinica, riferendosi al cambiamento della concentrazione insulinica relativo

all’elevazione della concentrazione del glucosio da 0 a 5 minuti dopo la

somministrazione endovenosa di glucosio.

La seconda fase di secrezione insulinica, che si riferisce al tasso di rilascio insulinico

relativo all’aumento di concentrazione di glucosio da 5 a 60 minuti dopo la

somministrazione endovenosa di glucosio, non differisce significativamente nella

prima fase di gravidanza rispetto allo stato pregravidico. La causa dell’incrementata

sensibilità insulinica non è sicura perché la sensibilità insulinica periferica e la

produzione epatica di glucosio non differiscono rispetto ai valori pregravidici. Nel

primo trimestre inoltre, la glicemia basale e le concentrazioni insuliniche non

differiscono significativamente dai valori della non gravidanza (7).

La produzione epatica di glucosio, stimata utilizzando [6,6H2]glucosio non differisce

alla 12^-14^ settimana di gestazione rispetto allo stato pregravidico. Dopo un

iniziale decremento dei livelli di triacilglicerolo, acidi grassi liberi, colesterolo,

lipoproteine e fosfolipidi nelle prime 8 settimane di gestazione, si osserva un

incremento stazionario nella prima fase di gravidanza. Il colesterolo è utilizzato dalla

placenta per la sintesi degli steroidi e degli acidi grassi liberi e per la formazione

16

delle membrane. I cambiamenti nelle concentrazioni totali di colesterolo riflettono i

cambiamenti nelle varie frazioni lipoproteiche. Il colesterolo HDL incrementa a

partire dalla 12^settimana di gestazione in risposta agli estrogeni e rimane elevato

per tutta la gravidanza. Il colesterolo totale, il colesterolo LDL e le VLDL

diminuiscono nelle prime 8 settimane di gestazione per poi incrementare fino a

termine di gravidanza. I cambiamenti del metabolismo lipidico nel primo stadio di

gravidanza promuovono l’immagazzinamento del grasso materno. Nel primo

trimestre, l’incremento di estrogeni, progesterone e insulina favorisce l’accumulo

dei lipidi e inibisce la lipolisi.

L’attività di LPL (Lipoprotein-Lipasi) nel tessuto adiposo dalla regione femorale, ma

non dalla regione addominale, è elevata durante 8^-11^ settimana di gestazione.

Questo assetto metabolico sotto l’influenza di cortisolo, estrogeni e progesterone

favorisce la lipogenesi e l’accumulo di grasso (5).

17

Fase Finale di Gravidanza

Studi longitudinali sulla tolleranza glucidica in gravidanza mostrano un progressivo

incremento nella risposta insulinica indotta dai nutrienti a discapito di un minimo

peggioramento della tolleranza glucidica, consistente con una progressiva insulino-

resistenza (5-7).

La tecnica del clamp euglicemico-iperinsulinemico e l’IVGTT indicano che l’azione

insulinica nel periodo tardivo di gravidanza risulta di circa 50-70% più bassa rispetto

alle donne non gravide con normale tolleranza glucidica. Si osserva inoltre un

progressivo incremento delle concentrazioni insuliniche basali e postprandiali con

l’avanzare della gravidanza (8). La prima e la seconda fase di secrezione insulinica

sono dai 3- a 3.5- volte maggiori nell’ultimo trimestre di gravidanza (7).

Sebbene i meccanismi non siano ancora noti, le alterazioni dell’assetto metabolico

e ormonale materno sembrano responsabili della ridotta sensibilità insulinica. I

cambiamenti della risposta β-cellulare avvengono in parallelo con la crescita

dell’unità feto-placentare e la sua elaborazione del milieu ormonale. La prevalente

insulino-resistenza produce dei cambiamenti notevoli nelle concentrazioni

postprandiali dei nutrienti (es. glucosio, VLDL, aminoacidi).

L’insulino-resistenza serve ad indirizzare i nutrienti al feto. A partire dal terzo

trimestre la produzione epatica di glucosio incrementa del 16-30% per incontrare i

bisogni feto-placentari. Inoltre i cambiamenti epatici e il metabolismo adiposo

alterano le concentrazioni dei lipidi circolanti. Nella seconda metà di gravidanza, per

esempio, la clearance delle VLDL è alterata a causa della ridotta attività della LPL

nel tessuto adiposo e nel fegato e del suo aumento nella placenta. Nel terzo

trimestre di gravidanza l’ormone corionico umano promuove la lipolisi e la

mobilizzazione del tessuto adiposo. L’incremento degli acidi grassi liberi e del

glicerolo nel plasma sono correlati alla mobilizzazione nel tessuto adiposo.

18

Questo cambiamento da uno stato anabolico ad uno stato catabolico promuove

l’utilizzo dei lipidi come fonte di energia materna mentre preserva il glucosio e gli

aminoacidi per il feto. Con il digiuno prolungato (24h) si osserva una rapida

diversione del metabolismo materno verso l’ossidazione dei lipidi con l’elaborazione

dei chetoni. L’incrementata lipolisi e la chetogenesi permettono alle donne di

utilizzare i lipidi immagazzinati per sopperire ai bisogni energetici e minimizzare il

catabolismo proteico.

19

Impatto sulla concentrazione dei nutrienti materni

L’effetto integrato degli adattamenti metabolici materni descritti in precedenza si

riflette nell’andamento dei livelli circolanti di glucosio, di insulina e di trigliceridi, di

FFA e di aminoacidi durante la gravidanza. La gravidanza non si associa soltanto ad

alterazioni del metabolismo glucidico ma anche ad alterate concentrazioni di lipidi e

aminoacidi in circolo, come dimostrato da Phelps e coll. (53) (Fig.2)

Fig.2 Adapted from Phelps RL, Am J Obstet Gynecol 1981; 140:730–736). Profiles of plasma

glucose, insulin, free fatty acids (FFA), triglycerides, and two representative amino acids in

eight nonpregnant women (open symbols) and eight pregnant women with normal glucose

tolerance studied during the third trimester (closed symbols).

L’andamento delle concentrazioni di glucosio, di insulina e degli acidi grassi liberi

costituisce un’esagerazione delle normali oscillazioni tra l’anabolismo dello stato

alimentato e il catabolismo dello stato di digiuno osservabili in donne non gravide.

20

Metabolismo Lipidico

Le concentrazioni di trigliceridi nelle donne gravide aumentano di 1,5-2 volte nel

terzo trimestre rispetto alle donne non gravide. L’ipertrigliceridemia degli stadi

tardivi della gravidanza sembra derivare dalla combinazione di tre fattori (54): 1)

aumento degli FFA circolanti ed iperinsulinemia, che favoriscono la produzione di

trigliceridi da parte del fegato; 2) aumento dell’assunzione di cibo, cui consegue

un’aumentata produzione di cibo, cui consegue un’aumentata produzione di

chilomicroni da parte dell’intestino; 3) ridotta attività della lipoprotein-lipasi nel

tessuto adiposo, che determina una ridotta clearance dei trigliceridi dal circolo (55).

Il primo fattore è responsabile di buona parte dell’incremento dei trigliceridi a

digiuno osservabile nelle fasi tardive di gravidanza, mentre tutti e tre i fattori

probabilmente contribuiscono all’ipertrigliceridemia nello stato alimentato.

Sebbene esista un’ampia letteratura sui cambiamenti del metabolismo glucidico

durante la gestazione, i dati sulle alterazioni del metabolismo lipidico sono minimi

(56). Darmady e Postle (57) hanno misurato il colesterolo e i trigliceridi prima,

durante e dopo la gravidanza in 34 donne normali. Sia il colesterolo che il

triacilglicerolo diminuivano approssimativamente alla 7^settimana di gestazione e

progressivamente incrementavano fino alla fine. Il triacilglicerolo diminuiva nel

post-partum. Il decremento era più rapido nelle donne che allattavano al seno

rispetto alle altre. L’incremento degli acidi grassi liberi nell’ultimo periodo di

gestazione è stato ipotizzato essere correlato alla diminuzione della materna

insulino sensibilità presente nell’ultimo periodo di gestazione. Gli acidi grassi liberi

sono stati associati con un’eccessiva crescita fetale in particolare del tessuto

adiposo. Esiste una significativa differenza nella concentrazione artero-venosa degli

acidi grassi liberi alla nascita quanta ce n’è con la concentrazione arterovenosa di

glucosio. Knopp e coll. (58) hanno riportato che il peso alla nascita era direttamente

correlato con la concentrazione di triacilglicerolo e di acidi grassi liberi, i quali

direttamente attraversano la placenta nell’ultimo periodo di gestazione. Kleigman e

coll. (59) hanno riportato che i bambini di donne obese non soltanto avevano un

21

peso alla nascita incrementato ma anche un aumento degli acidi grassi liberi

rispetto ai neonati di madri normopeso. Studi effettuati utilizzando la metodica del

clamp euglicemico-iperinsulinemico in donne normo tolleranti (60) e in donne con

diabete gestazionale (61) hanno mostrato che esiste una ridotta capacità

dell’insulina di sopprimere gli acidi grassi liberi con il progredire della gravidanza. La

capacità di soppressione dell’insulina nelle donne con diabete gestazionale era

inferiore rispetto alle normotolleranti (61). Questi studi dimostrano che la

sensibilità insulinica ai nutrienti diminuisce in tutte le donne con l’avanzare della

gravidanza. Questo decremento della sensibilità insulinica è ulteriormente

accentuato dalla presenza di uno stato pregravidico di già ridotta insulino sensibilità

che si rende manifesto nel corso di gravidanza con lo sviluppo del diabete

gestazionale (56).

22

Metabolismo Proteico

Insieme al glucosio, che rappresenta la fonte primaria di energia per i tessuti

fetoplacentari, l’accumulo proteico è essenziale per la crescita fetale. Si stima che ci

sia un incremento di circa 500 gr nell’accumulo di proteine a partire dalla

30^settimana. Basata su una review di molti studi, Duggleby e Jackson (62) hanno

stimato che durante il primo trimestre di gravidanza la sintesi proteica è simile a

quella di donne non gravide, mentre aumenta di circa il 15% durante il secondo

trimestre e addirittura arriva al 25% di incremento nel terzo trimestre. Inoltre

esistono marcate differenze interindividuali in ogni periodo della gravidanza che

presentano una forte relazione con la crescita fetale. Gli aminoacidi possono essere

utilizzati anche per l’accumulo di proteine o ossidati come fonte di energia. In

generale nel primo periodo di gravidanza esiste un modesto cambiamento verso

l’ossidazione degli aminoacidi mentre nel terzo trimestre di gravidanza gli

aminoacidi vengono accumulati per la sintesi proteica. Studi preliminari di Catalano

e coll. (63) hanno riportato che in tutte le donne in gravidanza, la diminuzione della

sensibilità insulinica si manifesta mediante una ridotta soppressione del turnover

della leucina durante un’infusione di insulina nell’ultimo periodo di gravidanza.

Inoltre esiste un’evidenza di un incremento del turnover della leucina basale nelle

donne con diabete gestazionale rispetto al gruppo di controllo. Se questo

decremento nella sensibilità insulinica aminoacidica sia correlato alla sintesi epatica

proteica o ad un incrementato esaurimento non è ancora noto. Le concentrazioni di

aminoacidi circolanti sono ridotte nelle donne gravide rispetto alle non gravide.

L’andamento dei livelli di aminoacidi circolanti nel terzo trimestre rivela un

abbassamento delle concentrazioni postprandiali e a digiuno. I meccanismi che

possono contribuire all’ipoaminoacidemia postprandiale della gravidanza

comprendono un accelerato up-take materno di aminoacidi in risposta

all’iperinsulinemia postprandiale, alterazioni del volume di distribuzione degli

aminoacidi come risultato della ritenzione di liquidi in gravidanza, e un aumentato

23

utilizzo di aminoacidi da parte del feto durante le fasi tardive della gestazione (64).I

meccanismi alla base dell’ipoaminoacidemia in gravidanza non sono stati chiariti.

24

La composizione corporea materna riflette i cambiamenti omeostatici

La gravidanza è uno stato caratterizzato da modifiche dell’adiposità materna che

conducono ad un incremento del tessuto adiposo durante la prima fase di

gravidanza e seguito da un decremento della massa grassa nella fase tardiva di

gravidanza. (65) Queste due fasi metaboliche si associano agli adattamenti

funzionali delle cellule adipocitarie, risultando in una predominanza della via

lipogenica e lipolitica rispettivamente. La rete anabolica che caratterizza la prima

fase della gravidanza sembra essere guidata dall’insulina, comunque i meccanismi

che legano la relazione tra insulino-sensibilità e accumulo di tessuto adiposo rimane

ancora sconosciuta. L’accumulo di grasso è una delle caratteristiche più comuni

della gravidanza, si presenta sia nelle donne che negli animali. L’incremento dei

depositi di grasso avviene nel primo e secondo trimestre di gravidanza mentre

declina o addirittura si arresta nell’ultimo trimestre (66). L’accumulo di grasso

corporeo durante la prima fase si associa sia all’iperfagia che all’aumentata

lipogenesi. L’iperfagia incrementa con il progredire della gravidanza. Questo

progressivo incremento della disponibilità di substrati esogeni contribuisce

attivamente all’accumulo materno di depositi di grasso. L’incremento della sintesi

degli acidi grassi è stato scoperto in ratti gravidi quando studiati in vivo e questa

aumentata sintesi lipidica sembra contribuire attivamente all’accumulo di grasso

durante la gravidanza. Cosi come l’incremento dell’azione della LPL nel tessuto

adiposo possa contribuire all’accumulo di grasso nel primo trimestre della

gestazione, (67) la sua riduzione nel terzo trimestre contribuisce ad incrementare la

mobilizzazione del tessuto adiposo. La transizione da uno stato anabolico ad uno

catabolico nel metabolismo del tessuto adiposo materno coincide con la fase di

massima crescita fetale (65), quando cioè la madre ha bisogno di incrementare

progressivamente i supplementi per il feto. Durante il corso della gravidanza

avvengono modifiche estensive della composizione corporea materna. La massa

25

adiposa totale e il volume di sangue circolante incrementano significativamente

mentre la massa magra cambia di poco (68, 69). Il ruolo dinamico del tessuto

adiposo negli adattamenti metabolici materni in gravidanza è sottolineato dai

cambiamenti longitudinali nella massa del tessuto adiposo. C’è un range variabile

individuale nell’accumulo del tessuto adiposo che può raggiungere tra i 2 ai 10 Kg

per donna, sulla base dell’etnia, della razza e dei fattori nutrizionali e metabolici

(70,71). Nelle donne magre, l’incremento totale della massa grassa rappresenta

circa il 30% dell’incremento ponderale gestazionale (72), sebbene le donne con

obesità pre-gravidica solitamente acquistano meno peso rispetto alle donne magre

(73). Precedenti studi hanno mostrato che gravidanze non complicate con

appropriato incremento ponderale l’accumulo di grasso si manifesta durante il

secondo trimestre e rimane costante fino a termine di gravidanza (72,75). I

meccanismi sottostanti il rimaneggiamento precoce del tessuto adiposo devono

ancora essere definiti sia nella gravidanza normale che nelle gravidanze

metabolicamente compromesse.

Funzione Endocrina e Metabolica del Tessuto Adiposo

I cambiamenti della composizione corporea durante la gravidanza sono

principalmente guidati dagli adattamenti dell’omeostasi metabolica materna. Lo

scopo finale dei cambiamenti indotti dalla gravidanza è quello di incontrare la

richiesta energetica elevata dello sviluppo fetale. Il glucosio, la principale fonte di

energia usata dai tessuti fetali, deve essere reso disponibile per il trasferimento

transplacentare mentre i tessuti materni possono dipendere da altri substrati

energetici come i lipidi (75). Gli adattamenti del metabolismo lipidico seguono un

pattern bifasico ormai noto. La prima metà della gravidanza è focalizzata

sull’immagazzinamento dell’energia materna come trigliceridi del tessuto adiposo

mentre nell’ultimo periodo di gestazione i lipidi immagazzinati vengono mobilizzati

per essere utilizzati dai tessuti periferici e per preparare la lattazione (76). Questi

26

adattamenti sequenziali sono facilitati dalle modifiche nella secrezione e nell’azione

insulinica che avvengono durante il corso della gravidanza. Nel primo trimestre

l’incremento della sensibilità insulinica facilita l’anabolismo cellulare attraverso

l’attivazione della lipogenesi. Successivamente, l’insulino-resistenza si sviluppa

progressivamente fino a culminare nel terzo trimestre (77) e permettendo al

tessuto adiposo di mobilizzare i lipidi immagazzinati prima e al muscolo scheletrico

di utilizzare meno glucosio. Questi cambiamenti nell’omeostasi metabolica materna

si combinano per determinare un incremento dei livelli circolanti di insulina e

trigliceridi nell’ultimo periodo di gestazione (78). In aggiunta alle alterazioni nella

capacità di immagazzinare energia, anche la funzione endocrina del tessuto adiposo

evolve durante la gravidanza. La sintesi e la concentrazione plasmatica della leptina

e dell’adiponectina, le due principali adipochine, presentano cambiamenti

longitudinali paralleli a quelli dell’insulino sensibilità. Mentre le concentrazioni di

leptina incrementano durante il primo trimestre precocemente, si osserva una

diminuzione nell’adiponectina plasmatica durante il terzo trimestre (79,80). Le

modifiche longitudinali delle adipochine nella gravidanza fisiologica sono

ulteriormente accentuate nel contesto di una gravidanza complicata da obesità e

diabete (81,82).

27

Rimodellamento del Tessuto Adiposo

Il tessuto adiposo bianco presenta una notevole flessibilità caratterizzata da

un’importante e reversibile capacità di espansione durante la vita adulta.

Il rimodellamento della massa del tessuto adiposo richiede l’interazione di

meccanismi cellulari al fine di supportare l’incremento della misura e/o del numero

degli adipociti che lo compongono. Il turn over delle cellule del tessuto adiposo è

altamente sensibile alle variazioni dell’assetto metabolico e ormonale che

avvengono nel corso della vita, come per esempio lo sviluppo, l’invecchiamento, la

dieta o i disordini metabolici che si verificano durante la durata della vita (83-85).

Negli individui obesi, l’allargamento del tessuto adiposo richiede un attivo turn over

degli adipociti in presenza di uno stato di infiammazione cronica stimolata

dall’accumulo di macrofagi nel compartimento stromale vascolare (86,87). Come

già precedentemente mostrato in altri studi, l’infiltrazione macrofagica e

l’incrementata morte cellulare degli adipociti contribuiscono all’infiammazione nelle

donne in gravidanza con obesità pre-gravidica (88,89).

28

Lo scopo dello studio

La comprensione dei fattori e dei meccanismi che guidano il rimodellamento del

tessuto adiposo e delle modifiche endocrine in condizioni fisiologiche merita

ulteriori studi.

Lo scopo dello studio è stato quello di caratterizzare i meccanismi responsabili

dell’incremento della massa del tessuto adiposo durante una normale gravidanza.

Abbiamo condotto un’analisi longitudinale che iniziava prima e proseguiva

attraverso tutta la gravidanza, al fine di caratterizzare i tratti morfologici e

molecolari del tessuto adiposo in donne non obese. Abbiamo mostrato che i

cambiamenti molecolari che supportano il rimodellamento del tessuto adiposo

gluteale precedono i cambiamenti fenotipici nell’incremento del tessuto adiposo e

nel metabolismo lipidico che culminano nell’ultimo periodo di gestazione.

29

Soggetti e Metodi

Questo studio longitudinale è stato condotto presso il Dipartimento di Ginecologia e

Ostetricia (Ob/Gyn) del MetroHealth Medical Center, Case Western University di

Cleveland (Ohio).

Undici donne primipare sono state reclutate prima della gravidanza (P) e seguite

longitudinalmente sia nel primo trimestre di gravidanza (8-12 settimane di

gestazione) (early) (E) che nel terzo trimestre di gravidanza (36-38 settimane di

gestazione) (late) (L). Il protocollo di studio è stato approvato da Institutional

Review Board and Clinical Research Unit (CRU) Scientific Review Committee. Le

pazienti volontarie hanno firmato il Consenso Informato in accordo con le linee

guida per la protezione e privacy dei pazienti del MetroHealth Medical Center,

Cleveland, Ohio.

30

Caratteristiche Metaboliche e Antropometriche

La composizione corporea è stata valutata utilizzando l’idro-densitometria come

descritto da Catalano e coll. (90,91) nei punti dello studio P (pre-gravidanza) e E (I^

trimestre). Al punto L (III^ trimestre) il grasso corporeo è stato valutato aggiustando

per la densità della massa magra a causa dell'incremento dell’acqua corporea

totale nell’ultimo periodo di gestazione. Inoltre sono state eseguite misurazioni per

la plicometria cutanea.

Ad ogni punto dello studio le donne sono state sottoposte a clamp euglicemico-

iperinsulinemico (6). La produzione endogena di glucosio (principalmente epatica) è

stata stimata dopo un digiuno notturno di 11 ore utilizzando un’infusione costante

di glucosio marcato, [6,6-2H2] glucosio. Il turnover basale del glucosio è stato

stimato in accordo con l’equazione dello steady-state di Steele (92). La sensibilità

insulinica è stata stimata come il tasso di infusione di glucosio necessario per

mantenere l’euglicemia durante il clamp più ogni residua produzione endogena di

glucosio durante l’infusione di insulina. Il clamp euglicemico-iperinsulinemico a 2

ore è stato eseguito dopo la stima della produzione endogena epatica di glucosio

come descritto da De Fronzo e coll (93) per stimare la sensibilità insulinica

periferica. La produzione endogena di glucosio residua durante l’infusione di

insulina è stata stimata mantenendo costante l’infusione di glucosio marcato e

aggiungendo l’isotopo addizionale al 20% dell’infusione di glucosio come descritta

da Tserng e Kalhan (94). L’indice di sensibilità insulinica (ISI) è stato misurato

dividendo la sensibilità insulinica per la media di concentrazione insulinica raggiunta

durante il clamp.

31

Analisi Biochimica

Il plasma è stato separato mediante centrifugazione e congelato a -20°C fino

all’analisi. La glicemia è stata misurata mediante il metodo della glucosio ossidasi

(YSI, Yellow Springs,OH). L’insulina plasmatica è stata misurata utilizzando il kit

radio-immunologico per l’insulina umana (Linco Research, St.Charles, MO). Il limite

di sensibilità per il dosaggio dell’Insulina è di 0.2 µU/ml con un coefficiente di

variabilità (CV) del 4.4-6.8%. La leptina e l’adiponectina sono state misurate

utilizzando il kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) con CV di 3.0-6.2% e 6.2-

8.4% rispettivamente. L’Interleukina-6 e l’Interleukina-8 sono state dosate mediante

la tecnica ELISA (QuantiGlo; R&D Systems, Minneapolis, MN) con CV di 5.3-7.8% e

2.6-3.4% rispettivamente. Tutti i campioni di plasma sono stati analizzati in

duplicato.

32

Analisi del Tessuto Adiposo

Caratteristiche delle Cellule Adipocitarie

Le biopsie del tessuto adiposo (800-1200 mg) sono state ottenute per ogni donna

mediante liposuzione dei depositi di tessuto adiposo sottocutaneo nella regione

gluteale. I prelievi bioptici sono stati effettuati per ogni punto dello studio: Prima

della Gravidanza (P), nel I^Trimestre (E) e nel III^ Trimestre di Gravidanza (L). Un

frammento di tessuto è stato fissato immediatamente per l’immunoistochimica, un

frammento è stato stoccato nel nitrogeno liquido per l’elaborazione del RNA e il

rimanente tessuto è stato processato per la digestione con collagenase. Dopo la

digestione con 1 mg/ml di collagenase (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ), e

aver mantenuto il tessuto per 45’ a 37°C, la mistura è stata filtrata attraverso una

rete di garza di 100 µm. L’infranatante è stato rimosso e lo strato fluttuante degli

adipociti è stato portato a 10 ml per il conteggio e la misurazione delle dimensioni. Il

diametro degli adipociti è stato determinato utilizzando un W.F obiettivo 10x con

un righello (microcopio Olympus BH-2,Hiroshima,Japan). E’ stata eseguita una

media dei numeri da 10 campi e la cellularità è stata definita come il numero degli

adipociti per grammi di tessuto adiposo digerito (95).

Immunoistochimica

Le sezioni di tessuto adiposo erano state fissate in formalina al 10% e incluse in

paraffina. Le sezioni di 5 µm sono state colorate utilizzando l’ematossilina Gill II e

l’eosina (Sigma Aldrich). Le immagini digitalizzate sono state ottenute utilizzando

una Nikon E600 microscopio equipaggiata con una camera DXM200.

33

L’Espressione Proteica

I lisati degli adipociti sono stati preparati utilizzando il metodo di estrazione con

Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). L’espressione genica è stata analizzata mediante

l’analisi del genoma con microarray utilizzando il metodo Affymetrix U133 e la

piattaforma come descritto (96). La selezione dei trascritti significativamente

modificati è stata eseguita mediante un sistema di filtri multi-step .

Tra i geni che sono stati evidenziati come “presenti” ovvero espressi, in accordo

con l’algoritmo MAS 5.0, noi abbiamo selezionato i geni che avevano una differenza

di almeno 4.5 volte la deviazione standard. L’intensità di ibridazione dei geni

significativamente modificati è stata esaminata mediante l’analisi gerarchica dei

gruppi con il software Gene-Spring GX (Agilent Technologies, Inc, Sanata Clara,CA) e

del software Treeview (free). I geni che soddisfacevano questi criteri sono stati

selezionati sulla base di un fold change >1.52 e <-1.52 che fosse coerente in almeno

due confronti. I geni relativi al metabolismo energetico sono stati identificati

34

secondo la funzione delle proteine putative codificate prese da un pubblico

database (IPA, Ingenuity System, Redwood,CA). I cambiamenti nell’espressione

genica sono stati validati dalla real-time PCR (Roche thermocycler, RocheApplied

Science, Indianapolis, IN) con LightCycler FAstStart DNA Sybr Green 1 master mix e

primer da Integrated DNA Technoologies (Coralville,IA). I primer per le specifiche

sequenze target sono state disegnate sulle regione 3’ codificante dei geni.

Analisi Statistica

Tutti i valori sono presentati come medie +/- SEM. Le differenze tra le variabili

dipendenti sono state esaminate con l’analisi della varianza a una via o a due vie

(ANOVA). Le differenze significative medie tra i tre punti dello studio sono state

identificate con il test posthoc di Fisher’s PLSD. I dati sono stati analizzati usando il

sistema statistico StatView II (Abacus Concepts, Berkeley, CA). La significatività

statistica è stata valutata per valori di p<0.05.

35

RISULTATI

Cambiamenti Fenotipici e Metabolici Longitudinali

Le misurazioni longitudinali sono state eseguite prima della gravidanza (Pre) e poi

nel primo periodo (8^-12^ settimana di gestazione) (Early) e nell’ultimo periodo

(36^-38^ settimana) (Late).

Tab.3 Caratteristiche antropometriche e metaboliche dei soggetti in esame. Esiste

una significativa differenza statistica tra P-Pregnancy e Late Pregnancy: * p=0.0001;

^ p=0.01. Esiste una differenza significativa tra Pre-pregnancy e Early-Pregnancy

^P=0.01

Le donne in esame erano tutte normopeso e con una normale tolleranza glucidica

prima della gravidanza. Presentavano tutte un sovrapponibile incremento

ponderale nel corso di gravidanza.

Pre Pregnancy

Early Pregnancy

Late Pregnancy

Weight, (Kg) 62.8 ± 13.08 64.9 ± 13.1 77.3 ± 14.5*

BMI, (Kg/m2) 22.7 ± 4.4 23.2 ± 4.2 27.7 ± 4.7*

Body fat, (%) 25.6 ± 8.2 26.3 ± 7.3 27.1 ± 6.6

LBM, (Kg) 45.9 ± 5.2 47.05 ± 5.6 55.5 ± 6.5*

Cholesterol (mg/dl) 151 ± 22.6 162.5 ± 32.7 242.09 ± 35.9*

FFA basal (mmol/ml) 0.66 ± 0.22 0.52 ± 0.19^ 0.51 ± 0.11^

Fasting Insulin (uU/ml) 12.1 ± 3.8 9.9 ± 3.2 15.4± 6.3

ISI (mg.min-1.Kg-1) 9.80 ± 2.5 9.25 ± 1.9 6.2 ± 1.9 *

Leptin Basal (ng/ml) 12.2 ± 9.08 20.7 ± 15.5^ 25.3 ± 16.1*

36

Sia la concentrazione del colesterolo e dei trigliceridi erano incrementate

nell’ultimo periodo di gravidanza mentre gli acidi grassi liberi (FFA) erano diminuiti

rispetto al periodo prima della gravidanza. L’insulino-sensibilità risultava

significativamente ridotta nell’ultimo trimestre di gravidanza rispetto sia al primo

trimestre che al periodo prima della gravidanza. Le concentrazioni di leptina

aumentavano significativamente nel primo trimestre e rimanevano elevate fino

all’ultimo trimestre.

Le misurazioni della composizione corporea mostravano che la massa grassa

corporea totale incrementava nell’ultimo periodo di gravidanza (p<0.0001) (Fig.3A).

Fig.3A Cambiamenti morfologici nel tessuto adiposo in gravidanza. Massa adiposa

totale (fat mass), dimensione degli adipociti (adipocyte size) e numero degli adipociti

(cellularity) prima e durante la gravidanza fisiologica. Pre-P: prima della gravidanza.

Early-E: 8^-12ˆsettimana di gestazione. Late-L: 32^-36^ settimana di gestazione.

Significatività statistica:* p<0.0001 vs pre-gravidanza. I risultati sono mostrati come

medie ± SD di 11 donne

*

37

Correlatamente, abbiamo osservato un incremento nel numero degli adipociti e

nelle loro dimensioni nell’ultimo periodo di gravidanza rispetto a prima della

gravidanza mentre questi cambiamenti non si sono osservati nel primo periodo

(p<0.001) (Fig.3B).

Fig.3B Sezioni di Immunoistochimica del tessuto adiposo sottocutaneo gluteale.

Ingrandimento iniziale X20. Pre-P: prima della gravidanza. Early-E: 8^-12ˆsettimana

di gestazione. Late-L: 32^-36^ settimana di gestazione

38

Caratteristiche Molecolari del Tessuto Adiposo

Utilizzando l’analisi microarray dell’intero genoma abbiamo analizzato n=22.277

geni e abbiamo osservato che il trascrittoma del tessuto adiposo, che comprendeva

12897±417 geni, rimaneva quantitativamente stabile durante la gravidanza con

13510±197 geni espressi durante la prima fase di gravidanza e 13097±298 geni

espressi durante l’ultimo periodo di gravidanza. L’Analisi dei Componenti Principali

(PCA) ha rivelato una sovrapposizione di grandi dimensioni nel pattern di

espressione tra il periodo prima della gravidanza (P), il primo trimestre (E) e l’ultimo

periodo (L) (Fig.4A).

Fig.4A Grafico tridimensionale a dispersione dell’analisi dei componenti principali

(PCA) del trascrittoma del tessuto adiposo. Le biopsie del tessuto adiposo gluteale

sono ottenute longitudinalmente Pre-gravidanza (P), nel primo trimestre (E) e nel

terzo trimestre (L). L’analisi dei dati completi (n=22.277 geni) mostrava una larga

sovrapposizione dei profili del trascrittoma prima e durante la gravidanza.

39

I geni differentemente espressi nel primo trimestre (n=1286) e nel terzo trimestre

(n=1111) di gravidanza rappresentano il 10-15% del transcrittoma del tessuto

adiposo rispettivamente. Il confronto dell’espressione genica globale, utilizzando

l’analisi delle componenti principali, ha inoltre rivelato un distinto pattern di

espressione genica tra il primo periodo di gravidanza e l’ultimo periodo (Fig.4B).

Fig.4B L’analisi dei geni significativamente modificati nel primo (n=1286 geni) e

nell’ultimo trimestre di gravidanza (n=1111 geni) rispetto a prima della gravidanza

mostravano un distinto pattern di espressione per ogni stadio della gravidanza. Ogni

punto rappresenta un set dati del microarray.

40

Ulteriori analisi sono state effettuate sui geni significativamente modificati, basate

sulla loro funzione biologica indicando che il 65% dei cambiamenti associati alla

gravidanza erano correlati al metabolismo lipidico (26%) e al rimodellamento

tissutale (39%) (Fig.5).

Fig.5. I cambiamenti trascrizionali nel tessuto adiposo durante la gravidanza.

L’analisi funzionale dei geni basate sulle annotazioni biologiche della loro sequenza

DNA., la cui espressione è modificata durante la gravidanza rispetto a prima della

gravidanza.

41

42

[GSE37215 approvato -NCBI tracking system #16555203]

Tab.4 I geni significativamente modificati nel tessuto adiposo nella prima fase di

gestazione sono espressi in “fold change” rispetto al periodo pre-gravidanza.

43

44

Tab.5 I geni significativamente modificati nel tessuto adiposo nell’ultima fase di

gestazione sono espressi in “fold change” rispetto al periodo pre-gravidanza.

45

I geni coinvolti nel rimodellamento tissutale sono stati poi ulteriormente separati in

tre categorie funzionali principali: i mediatori della risposta immunitaria, i

componenti della matrice extra-cellulare e i fattori angiogenici (Fig.6).

Fig.6 L’analisi per cluster ha identificato 3 principali gruppi funzionali di geni up-

regolati in gravidanza rispetto a prima della gravidanza. I geni implicati nel

metabolismo, nel rimodellamento cellulare-angiogenesi e nell’attivazione

immunitaria.

46

I cambiamenti significativi nei geni che regolano le vie per la risposta infiammatoria

e per le vie del metabolismo energetico sono stati osservati nel primo periodo di

gravidanza rispetto a prima della gravidanza.

La risposta del sistema immunitario innato attivata attraverso la via di segnale del

TLR4-NFkB conduce ad un rapido incremento nell’espressione genica e proteica di

TLR4 così come di TNF-alpha,IL-6, e delle piccole chemochine della famiglia CXCL

(Fig.7 A,B).

Fig.7A Cambiamenti trascrizionali relativi alla gravidanza nel tessuto adiposo-TLR4

network. Geni implicati nella via di segnale del TLR4 selezionati dalla lista in Tab.4.

I valori di mRNA dal tessuto adiposo sono stati misurati con l’analisi quantitativa

Real Time PCR nel primo periodo di gravidanza (E). I valori di controllo (Ct) sono stati

normalizzati per actina e espressi come fold change vs prima della gravidanza.

Significatività statistica: *p<0.05; prima della gravidanza: barre grigie, primo

trimestre (E): barre blu, con n=6 determinazioni indipendenti.

47

Fig.7B Analisi longitudinale immuno-enizimatica della proteina TLR4 contenuta nel

tessuto adiposo prima della gravidanza (P), nel primo trimestre (E) e nell’ultimo

periodo di gestazione (L).

Riguardo i geni implicati nella via metabolica, quelli coinvolti nel facilitare

l’accumulo dei lipidi attraverso la differenziazione adipocitaria e la lipogenesi erano

i più attivati nel primo trimestre di gravidanza (Fig. 8 A,B).

Fig.8 Cambiamenti trascrizionali correlati alla gravidanza nelle vie metaboliche del

tessuto adiposo. Geni coinvolti nella via metabolica selezionati da Tab.5. I valori di

mRNA dal tessuto adiposo sono stati misurati con l’analisi quantitativa Real Time

48

PCR nel primo periodo di gravidanza (E). I valori di controllo (Ct) sono stati

normalizzati per actina e espressi come fold change vs prima della gravidanza.

Significatività statistica: *p<0.05; prima della gravidanza: barre bianche; primo

trimestre (E): barre blu, con n=6 determinazioni indipendenti.

L’elevata espressione genica dei fattori di trascrizione appartenenti alle famiglie di

FOXO,PPARƴ,CREB e SERB era indicativa per una differenziazione adipocitaria.

L’incremento del recettore per VLDL e LDL related-protein 1, fatty acid synthase

(FAS), acetyl CoA caroboxylase (ACC) e stearoyl-CoA desaturase (SCD) che

catalizzano l’up-take degli acidi grassi liberi, la sintesi e l’allungamento delle loro

catene erano segni evidenti di una attiva lipogenesi. I componenti della matrice

extra-cellulare con proprietà strutturali (elastina, collagene) e proprietà di adesione

cellulare (laminina, fibronectina) erano fortemente espressi nel primo periodo di

gravidanza e includevano l’elevata espressione delle metalloproteasi (MMPs) per

incrementare la plasticità tissutale attraverso il rilascio di insulin-like growth factor

1 (IGF-1). L’attivazione concomitante di diversi fattori angiogenici (VEGF,TGF-beta,

ANG, FGFR2) suggeriva che il processo di neovascolarizzazione era associato con il

rimodellamento di matrice.

49

Discussione

Il nostro studio dimostra un’espansione del tessuto adiposo durante la gravidanza

che combina l’incremento del numero delle cellule (iperplasia) con l’incremento

della loro dimensione (ipertrofia).

Questo è in accordo con i dati mostrati per i depositi di grasso nella parte inferiore

del corpo nelle donne in gravidanza (97,98) ma differisce dai meccanismi descritti

nell’obesità dove l’ipertrofia si manifesta prima dell’iperplasia. La crescita

iperplastica appare geneticamente regolata mentre l’ipertrofia è più regolamentata

dalla nutrizione (99). Comunque sia, la crescita è anche dipendente da ogni

deposito e dal gene che definisce i precursori della proliferazione degli adipociti

(100). Il depot sottocutaneo della regione gluteale in gravidanza si espande in

maniera preferenziale rispetto al viscerale (73), è accessibile alla biopsia e più

incline ai cambiamenti infiammatori del deposito viscerale mesenterico o omentale

(101). Comunque, ulteriori studi effettuati sul tessuto viscerale permetterebbero di

comprendere il disegno globale dell’intero tessuto adiposo.

50

Espansione e Rimodellamento del Tessuto Adiposo

I nostri dati rivelano che gli adattamenti del tessuto adiposo in una gravidanza

fisiologica si sviluppano in maniera temporale con un insieme di cambiamenti

molecolari che precedono l’espansione antropometrica della massa adiposa.

L’espansione del tessuto adiposo è un processo complesso che si basa su di un

cross-talk molecolare tra differenti tipi cellulari della frazione stromale-vascolare

intorno agli adipociti (102,103). In accordo con questo concetto, il nostro studio

suggerisce che l’espansione del tessuto adiposo indotta dalla gravidanza coinvolge

una combinazione di vie di segnale condivise dai pre-adipociti, dalle cellule

immunitarie e endoteliali. La flessibilità della matrice cellulare che circonda gli

adipociti gioca un ruolo centrale nella regolazione dell’espandibilità del tessuto. Il

rimodellamento delle componenti della matrice extra-cellulare è accelerato in

numerose malattie metaboliche ed è associato con i cambiamenti del milieu

ormonale (86,102). L’incremento delle metalloproteinasi, fibronectina e laminina

accelerano la differenziazione pre-adipocitaria nel tessuto adiposo ipertrofico degli

individui obesi (104,105). Dall’altro lato l’angiogenesi, necessaria per i

rimodellamento del tessuto adiposo, può essere facilitato dalle metalloproteinasi e

dalle collagenasi (106). VEGF-A e il suo principale partner funzionale,

l’angiopoietina, sono essenziali per iniziare il programma di angiogenesi (107,108).

Quindi, l’incremento combinato dei fattori di crescita (IGF2, FGFR2) e dei fattori

angiogenici (VEGF, TGF-β) è in linea con il contributo dei meccanismi angiogenici al

complessivo rimodellamento del tessuto adiposo nel primo periodo della gestazione

(109). Il microambiente che circonda gli adipociti può anche essere modellato dalla

produzione di adipochine che esercitano sia un effetto paracrino che una funzione

endocrina propriamente detta. TNF-α e IL-6 mostrano un’incrementata espressione

sia nel primo trimestre di gravidanza che nell’ultimo periodo e possono quindi

regolare l’espressione di altri geni che contribuiscano all’azione negativa

dell’insulina (110). L’incrementata espressione di LepR è in accordo con il ruolo di

stimolazione della leptina sull’angiogenesi mentre la mancata regolazione del gene

51

della leptina è coerente con l’aumento dei livelli plasmatici di leptina in gravidanza,

essendone la placenta il principale produttore (111).

52

Biologia degli Adipociti

Il 29% di incremento della massa grassa misurata nell’ultimo periodo di gravidanza è

stata associata con un attivo rimodellamento del tessuto adiposo. L’attivazione

dell’ormone endoteliale lipoprotein-lipasi (LPL) nell’ultimo periodo di gravidanza,

suggerisce un’accelerata idrolisi dei trigliceridi circolanti in acidi grassi liberi (FFA),

rendendoli disponibili per l’up-take cellulare. I nostri risultati supportano l’elegante

studio di Herrera e coll. che ha dimostrato il ruolo cruciale di LPL nell’incrementare

l’immagazzinamento dei lipidi nel tessuto adiposo dei ratti in gravidanza (65).

L’elevata espressione di molti altri geni che direttamente influenzano la lipogenesi e

la differenziazione adipocitaria sta ad indicare che queste vie sono reclutate nel

primo periodo della gravidanza al fine di incrementare l’immagazzinamento lipidico

sia negli adipociti maturi che in quelli di nuova sintesi (Fig.9)

Fig.9 Diagramma della via metabolica molecolare identificata con l’analisi gene

ontology dei geni differentemente regolati nel primo trimestre di gravidanza.

Il fattore di trascrizione forkhead FOXO, isoforma 1, uno dei principali regolatori

dell’omeostasi energetica del tessuto adiposo, è un dei geni indotti nel primo

periodo di gravidanza. L’attivazione di FOXO1 potrebbe contribuire alla regolazione

delle dimensioni degli adipociti in risposta all’eccessivo introito calorico (112,113).

53

Così come FOXO1 è un ligando diretto di PPARƴ, cosi esso può contribuire alla

regolazione delle dimensioni degli adipociti e delle vie adipogeniche (114,115). I

geni sensibili ai nutrienti come cEBP-α, SREBP1 e PPARƴ, che rappresentano i

regolatori obbligatori della prima e ultima fase del programma di differenziazione

adipocitaria (116-118), sono inoltre attivati nella prima fase di gestazione. Nel suo

complesso, i cambiamenti nei meccanismi metabolici indicano che il maggior

accumulo adipocitario e l’incrementata differenziazione di nuovi adipociti, iniziano

ad uno stadio precoce della gravidanza per permettere l’ampliamento della massa

adiposa totale. Queste scoperte enfatizzano il concetto che i meccanismi

molecolari del processo adipogenico iniziano ben prima della comparsa dei classici

marker fenotipici. I nostri dati suggeriscono inoltre una somiglianza tra i meccanismi

della fisiologica espansione del tessuto adiposo in gravidanza e la patologica

espansione nell’obesità. Un esempio è il precoce incremento della proteina

secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1), un modulatore endogeno della via di

Wnt/β-catenin che raggiunge il picco nei pazienti con una moderata obesità e

gradualmente si riduce nei soggetti con obesità morbigena (119).

54

Infiammazione

I segni della presenza di un’infiammazione molecolare sono presenti nel tessuto

adiposo a partire dalle prime fasi di gravidanza fino a termine. La gravidanza è

inoltre in sé e per sé una condizione infiammatoria, probabilmente iniziata per

consentire l’immunotolleranza verso il feto da parte della madre (120). I gruppi

funzionali di geni correlati alla regolazione immunitaria rappresentano circa il 30%

di tutti i geni significativamente modificati in gravidanza se comparati allo stato

pregravidico. L’espressione genica incrementata dei marker macrofagici CD14,

CD68, HLA-DR, HLA-DQ e del recettore del mannosio sono in accordo con un

recente report circa i cambiamenti infiammatori nel tessuto adiposo nei topi

nell’ultimo periodo di gravidanza (121). Il Toll-like receptor 4 (TLR4) così come

l’mRNA dei modulatori a valle della via di segnale del TLR4 erano significativamente

incrementati nelle prime fasi di gravidanza. TLR4 appartiene ad una famiglia di

recettori di membrana reclutati nella prima risposta del sistema immunitario innato

attraverso il legame della porzione Lipid A del lipopolisaccaride (LPS) rilasciato dai

batteri Gram negativi (122). (Fig.10)

Fig.10 Diagramma della via molecolare relativa all’attivazione di TLR4 identificata

con l’analisi gene ontology.

55

I fattori ambientali che possono innescare il reclutamento della via del sistema

immunitario innato nella prima fase di gravidanza non sono conosciuti. L’attivazione

del segnale di trasduzione di TLR4 è stata proposta come il link molecolare tra

obesità indotta dalla dieta e l’incrementata insulino-resistenza (122,123). I

cambiamenti nutrizionali come l’iperfagia materna o la disfagia che avvengono nel

primo periodo della gravidanza sono i candidati potenziali che potrebbero

impattare i recettori del tessuto adiposo e la loro stessa funzione (124). Sempre su

questa linea, i cambiamenti dei microbioti sono stati documentati in relazione

all’incremento del peso gestazionale e potrebbero avere un impatto sulla via di

segnale del TLR4 in gravidanza (125). Il riconoscimento dei batteri da parte del

recettore SAA, CD36, può avviare il processo infiammatorio in risposta

all’approvvigionamento di grasso (126,127). Le proteine della fase acuta

appartenenti alla famiglia delle SAA, sono marker di un basso grado di

infiammazione e di obesità e promuovono il rimodellamento endoteliale in parte

attraverso la mediazione della via di segnale del TLR4 (128-130).

56

Conclusioni

Mentre una considerevole letteratura ha definito l’infiammazione come una

componente obbligatoria del rimodellamento del tessuto adiposo nell’obesità e in

altre patologie questo report è la prima indicazione del reclutamento della via

infiammatoria nella gravidanza umana fisiologica.

Il precoce incremento del tessuto adiposo e la risposta immunitaria precedono la

comparsa dei cambiamenti fenotipici materni della composizione corporea e

dell’azione insulinica. Il pattern bifasico rivela come l’infiammazione fisiologica

rappresenti uno step precoce verso lo sviluppo della fisiologica insulino-resistenza

che raggiunge l’apice durante l’ultimo periodo della gravidanza. (Fig.11)

Fig.11 L’attivazione dei pattern trascrizionali suggerisce che la rete molecolare da differenti

tipi cellulari adiacenti contribuisce al rimodellamento del tessuto adiposo durante la

gravidanza. I componenti della matrice extra-cellulare e i fattori angiogenici sono necessari

alla crescita vascolare e adipocitaria. I geni lipogenici e i fattori di trascrizione sono richiesti

per la differenziazione cellulare e l’immagazzinamento dei lipidi. I macrofagi infiltrati tra le

cellule stromali producono citochine pro-infiammatorie, IL-6, IL-8 e TNF che possono sia

incrementare la neovascolarizzazione che facilitare lo sviluppo di insulino-resistenza.

57

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Ringraziamenti

Seduta alla mia scrivania e occupata nelle ultime correzioni della tesi, ancora non mi rendo

conto di esser giunta al termine di questo cammino. Guardandomi alle spalle vedo quante

cose nella mia vita sono cambiate. Questo mio percorso è iniziato molti anni fa. Non sempre

è stato tutto semplice ma, sicuramente, l’esperienza universitaria è stata e rimarrà unica.

Il mio primo grazie va al Prof. Stefano Del Prato, per avermi incitata in questi anni a

migliorare gli aspetti della professione medica, per avermi dato le basi per affrontare sfide

coraggiose e per aver riso spesso alle mie battute.

Voglio esprimere la mia più profonda gratitudine al mio mentore, il Dr. Graziano Di Cianni,

per la sua guida, comprensione, pazienza e incoraggiamento nei passati anni. Il suo

illimitato sostegno è stata la maggior forza trainante durante il mio percorso di medico e la

mia formazione come persona.

Il mio più affettuoso e generoso grazie va alla Dr.ssa Laura Volpe, per il suo continuo e

instancabile appoggio, la straordinaria professionalità e il suo entusiasmo contagioso. Mi ha

ispirata nel corso di questi lunghi anni a diventare un medico e una persona migliore.

Grazie di cuore alla Dr.ssa Rosa Giannarelli. Non mi è mai mancato il suo affetto e la sua

comprensione. Non dimenticherò mai i suoi insegnamenti, né le colazioni che mi ha pagato

dopo ogni turno di notte.

Un grazie sincero alla Dr.ssa Bertolotto. In questi ultimi anni abbiamo condiviso difficoltà e

soddisfazioni. La ringrazio per quello che è stato e per quello che sarà.

Voglio ringraziare di cuore la Dr. Sylvie Hauguel de-Mouzon. Mi ha incoraggiata a sviluppare

un pensiero indipendente e competenze scientifiche che mi hanno preparata ad affrontare

sfide future. Senza di lei questo lavoro non sarebbe stato realizzato. Voglio ringraziare il Dr.

Patrick Michael Catalano. La grandezza di un uomo risiede nella sua capacità di essere

umile. Ha messo a mia disposizione la sua conoscenza e la sua professionalità nell’intento

unico di insegnare.

Grazie, mille volte, ai miei strutturati: Dr.Aragona, per aver condiviso con me sorrisi, musica

e citazioni; Dr.Campi per i momenti esilaranti e folli; Dr.ssa Ciccarone, per gli incontri-

scontri costruttivi per entrambe; Dr.Coppelli, per aver condiviso con me l’affetto per la

Giannina e le ore di guardia; Dr.ssa Dardano, per tu sai cosa; Prof. Marchetti, per il

confronto con una realtà diversa e le sue opportunità; Dr. Miccoli, per lo sguardo severo e

attento durante i miei passi in tutti questi anni; Dr.Penno, per le risate, i momenti di svago e

le buone parole sempre spese per me; Dr.Piaggesi, per il confronto spigoloso e la crescita

professionale; Dr.ssa Rizzo, per lo sguardo benevolo ma sempre un po’critico, come quello

di una mamma. E al Prof. Benzi, per i primi insegnamenti e gli abbracci affettuosi.

Un enorme grazie alla Dr.ssa Cristina Bianchi. Collega prima, capa poi, amica sempre.

Grazie di cuore al Personale Infermieristico e Para-Infermieristico della nostra U.O. per gli

insegnamenti, le ramanzine, le ore trascorse insieme. Grazie per esservi presi cura non solo

della specializzanda ma anche di Veronica. Non lo dimenticherò mai.

Grazie ai Podologi, ai Biologi, ai Ricercatori per l’aiuto tecnico e gli insegnamenti preziosi.

Siete stati tutti degli ottimi maestri.

Grazie a quelle due persone che mantengono il nostro Dipartimento unito e funzionale, e

con le quali è sempre un piacere fare due chiacchere: Lia e Giulia.

Il ringraziamento più sentito va ai colleghi specializzandi e agli amici di sempre. Avete

trasformato la Scuola di Specializzazione in un percorso di vita. Grazie ad Alessia e Chiara,

nel passato come nel presente. Grazie a Francesca Panki, sempre presente. Grazie ad

Alessandra e Ilaria, angeli custodi e a Cristina L,non solo disquisizioni scientifiche. Grazie ad

Anna e Francesca Palu’, le grandi del gruppo. Grazie a Nicolò e Marco, inimitabili. Grazie ad

Andrea. Grazie a Isabella e Dario, piccoli già grandi. Grazie a Elisabetta S e Rossella, non solo

medicina direi. Grazie a Emilia, una piccola me con un cuore più grande del mio. Grazie a

Marianna e Elisabetta I, poco tempo insieme ma spero buono. Grazie alle nuove

generazioni Monia e Mario. E Grazie a Miriam, la vita può separarci, il bene poi continuerà.

Grazie ai colleghi medici che ho incontrato in questo percorso. Ho imparato che la

conoscenza condivisa acquista più valore. Ho imparato che il confronto leale e aperto

accresce tutti. Ho imparato che diventare un buon medico richiede tempo e sacrifici.

Un grazie pieno di affetto va a Savvina. Splendida compagna di viaggio. Maestra di gioia e

allegria.

E ovviamente il mio grazie va a tutti i pazienti che ho incontrato. Alcuni di loro mi hanno

insegnato a fare il medico, altri hanno cambiato la mia visione della malattia.

Il mio pensiero va, infine, al mio babbo, alla mia mamma e a David senza i quali non sarei

mai potuta giungere a questo punto. Grazie, per il sostegno a volte tacito e a volte esplicito,

indispensabile per superare i numerosi ostacoli incontrati in questo cammino. Siete sempre

stati la fonte di coraggio per affrontare ogni difficoltà.

Grazie a Marco. Hai ridato un significato nuovo alla parola futuro.

Un grazie a tutti coloro che, quaggiù sulla terra o lassù in cielo, instancabilmente illuminano

il mio cammino.

Considero il mio percorso ancora un work in progress, ma tutto quello che di buono ho

fatto e tutto quello che ho imparato, lo devo al micro-mondo dell’U.O. di Diabetologia di

Pisa.

Ho ricevuto più di quel che ho dato, da tutti quanti, ed è tanta la gratitudine che le parole

ormai non bastano più a descriverla.

Grazie a Eleonora e Margherita. Mi raccontate del mio passato. Siete nel mio presente. V’immagino nel mio futuro.