STUDIO DELLA STRUTTURA E DELLASIMMETRIA DI UN ENZIMA TRAMITEMUTAGENESI

La tirosil-tRNA sintetasi ha delle interessanti proprietà connessealla sua simmetria:

Sebbene l’omodimero sia simmetrico nel cristallo, esso insoluzione lega solo una mole di tirosina e forma una solamole di tirosil adenilato.

Questo fenomeno, che va sotto il nome di “half of the sites reactivity”è stato studiato tramite ingegneria proteica per sapere se l’asimmetriafunzionale fosse indotta dal legame con i substrati o se fossepreesistente.

DELEZIONE DEL DOMINIO C-TERMINALE

COSTRUZIONE DEGLI ETERODIMERI

SEPARAZIONE DEGLI ETERODIMERI

Una seconda mutazione H45N può essere introdotta in unadelle due subunità degli eterodimeri per ridurre drasticamentela velocità di attivazione della tirosina in quella subunità.

I risultati mostrano che sebbene il tRNA si leghi alla subunità didimensioni normali, la sua acilazione avviene nell’altra subunità

L’asimmetria è preesistente nell’enzima in soluzione

0,5 moles of Tyr-AMPare formed atwild-type rate

0,5 moles at mutant rate

= subunità attiva= subunità inattiva

Se l’asimmetria fosse indotta dalla formazione del Tyr-AMP, alloraquesto si formerebbe e sarebbe presente solo nelle subunità selvatiche,al contrario di quanto si osserva. Inoltre si formerebbe solo una mole allavelocità del selvatico (wild type rate).

Subtilisina