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Predizione della struttura di una proteina

In generale, la sequenza amminoacidica di una proteina codifica la sua struttura tridimensionale

dovrebbe quindi essere possibile disegnare un algoritmo per predire la struttura 3D di una proteina a partire dalla sua sequenza 1D

questo è l’obiettivo più ambizioso e complesso della bioinformatica, e non è ancora stato raggiunto

i metodi sperimentali per la determinazione della sequenza di una proteina sono estremamente rapidi (l’ordine di grandezza è il giorno) e relativamente economicila risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina richiede invece l’uso di strumenti più complessi, e talvolta mesi di lavoro

PDB (Protein Data Bank) 17.000 strutture

Swiss-Prot + TrEMBL 700.000 sequenze

gran parte delle ricerche in biologia strutturale è quindi volta allo studio delle leggi fondamentali del folding delle proteine e la biologia computazionale dedica molte energie e risorse allo sviluppo di metodi per la predizione della struttura delle proteine

in molti casi è vero che solo l’analisi della struttura tridimensionale di una macromolecola può aiutarci a comprendere in quale modo e per quale motivo una determinata sequenza (avvolta in una specifica struttura) possa codificare una ben precisa funzione

vediamo per esempio la struttura 3D della chimotripsina, mettendo in evidenza i residui della triade catalitica, che non sono contigui nella sequenza proteica

perchè è interessante studiare la struttura di una proteina

la contiguità dei residui in struttura determina la funzione

Ribonuclease A - PDB 5RSA 1 KETAAAKFER QHMDSSTSAA SSSNYCNQMM KSRNLTKDRC KPVNTFVHES 51 LADVQAVCSQ KNVACKNGQT NCYQSYSTMS ITDCRETGSS KYPNCAYKTT 101 QANKHIIVAC EGNPYVPVHF DASV Ribonuclease T1 – PDB 1RLS 1 ACDYTCGSNC YSSSDVSTAQ AAGYQLHEDG ETVGSNSYPH KYNNYEGFDF 51 SVSSPYYEWP ILSSGDVYSG GSPGADRVVF NENNQLAGVI THTGASGNNF 101 VECT PR4 - W eatwin1 - PDB 1C2Z 1 QQATNVRATY HYYRPAQNNW DLGAPAVSAY CATWDASKPL SWRSGYGWTA 51 FCGPAGAHGQ ASCGKCLQVT NPATGAQITA RIVDQCANGG LDLDWDTVFT 101 KIDTNGIGYQ QGHLNVNYQF VDCRD

RNase A (A) RNase T1 (B)

Wheatwin1 (C)

Metodi per la predizione della struttura secondaria

Il metodo Chou-Fasman

Tabella 5.1. Propensione dei residui aminoacidici a formare elementi di struttura secondaria come riportato da Chou-Fasman (1978b) (C&F) e Levitt (1978) (L). La colonna “pr” classifica i residui come indifferenti (=) o stabilizzatori/destabilizzatori forti (++/--) e deboli (+/-) della struttura secondaria.

elica foglietto ripiegamento

aa C&F

L pr aa C&F

L pr aa C&F

L

Glu 1.51 1.44 ++ Val 1.70 1.49 ++ Asn 1.56 1.28

Met 1.45 1.47 ++ Ile 1.60 1.45 ++ Gly 1.56 1.64

Ala 1.42 1.29 ++ Tyr 1.47 1.25 ++ Pro 1.52 1.91

Leu 1.21 1.30 ++ Phe 1.38 1.32 + Asp 1.46 1.41

Lys 1.16 1.23 + Trp 1.37 1.14 + Ser 1.43 1.32

Phe 1.13 1.07 + Leu 1.30 1.02 + Cys 1.19 0.81

Gln 1.11 1.27 + Cys 1.19 0.74 + Tyr 1.14 1.05

Trp 1.08 0.99 + Thr 1.19 1.21 + Lys 1.01 0.96

Ile 1.08 0.97 + Gln 1.10 0.80 + Gln 0.98 0.98

Val 1.06 0.91 + Met 1.05 0.97 + Thr 0.96 1.04

Asp 1.01 1.04 = Arg 0.93 0.99 = Trp 0.96 0.76

His 1.00 1.22 = Asn 0.89 0.76 = Arg 0.95 0.88

Arg 0.98 0.96 = His 0.87 1.08 = His 0.95 0.68

Thr 0.83 0.82 = Ala 0.83 0.90 - Glu 0.74 0.99

Ser 0.77 0.82 = Ser 0.75 0.95 - Ala 0.66 0.77

Cys 0.70 1.11 = Gly 0.75 0.92 - Met 0.60 0.41

Tyr 0.69 0.72 - Lys 0.74 0.77 - Phe 0.60 0.59

Asn 0.67 0.90 - Pro 0.55 0.64 -- Leu 0.59 0.58

Pro 0.57 0.52 -- Asp 0.54 0.72 -- Val 0.50 0.47

Gly 0.57 0.56 -- Glu 0.37 0.75 -- Ile 0.47 0.51

Metodi di predizione della struttura secondaria delle proteine:

Metodi di Chou-Fasman si basa sull’analisi statistica della composizione in residui delle strutture secondarie presenti nella PDB. (http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1) GOR si basa sull’analisi statistica della composizione in residui delle strutture secondarie presenti nella PDB.(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html) AGADIR per predire la percentuale di residui in elica (http://www.embl-heidelberg.de/Services/serrano/agadir/agadir-start.html) PHD prende in input o una sequenza o un allineamento multiplo ed usa le reti neurali. (http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html) Vuole una registrazionePSIPRED utilizza un sistema di due reti neurali. (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) PREDATOR si basa sull’applicazione del metodo del k-esimo vicino che usa le reti neurali (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/predator-simple.html)JPRED3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/JPred/jpred.html) fa un consensus di vari metodi

http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/JPred/jpred.html










I migliori programmi di predizione della struttura secondaria sono stati sviluppati utilizzando metodi di apprendimento automatico (machine learning methods)

i metodi di apprendimento automatico più utilizzati in bioinformatica sono le reti neurali e gli Hidden Markov Models (HMM)

una caratteristica peculiare delle reti neurali è che sono in grado di apprendere, in un tentativo di simulare il comportamento del cervello umano

vengono addestrate utilizzando un opportuno insieme di dati detto training set (un insieme di -eliche, filamenti e elementi non- non-)

e possono poi venire utilizzate per riconoscere -eliche da filamenti e da elementi non- non-

riconoscimento del fold (fold recognition)

sequenza query

banca dati di fold possibili

allineamentosequenza

struttura+

input

output

-elica foglietto

filamento

perchè è interessante studiare la struttura di una proteina

il confronto tra sequenze proteiche può essere utilizzato per mettere in luce relazioni evolutive tra proteine e la similarità tra sequenze può essere utilizzata come una misura della distanza evolutiva tra gli organismi

come abbiamo visto, le proteine che si confrontano possono talvolta essere così diverse che diventa difficile metterne in evidenza la comune origine evolutiva attraverso il solo confronto tra sequenze

cambiamenti nella struttura delle proteine sono invece più conservativi: l’evoluzione delle proteine avviene in modi che in genere non alterano il ripiegamento (fold) della struttura proteica, che quindi può conservare tracce di un’origine comune

i metodi sperimentali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina sono:

• la cristallografia a raggi X

• la spettroscopia a risonanza magnetica e nucleare (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)

Come si può studiare la struttura di una proteina

cellula batterica

plasmide

DNA esogeno

moltiplicazione del clone

formazione di cristalli

purificazionedella proteina

diffrazioneai raggi X

NMR

HEADER TRANSCRIPTION REGULATION 25-AUG-94 1RPO 1RPO 2COMPND ROP (COLE1 REPRESSOR OF PRIMER) MUTANT WITH ALA INSERTED ON 1RPO 3COMPND 2 EITHER SIDE OF ASP 31 (INS (A-D31-A)) 1RPO 4SOURCE (ESCHERICHIA COLI) 1RPO 5AUTHOR M.VLASSI,M.KOKKINIDIS 1RPO 6REVDAT 2 15-MAY-95 1RPOA 1 REMARK 1RPOA 1REVDAT 1 14-FEB-95 1RPO 0 1RPO 7JRNL AUTH M.VLASSI,C.STEIF,P.WEBER,D.TSERNOGLOU,K.WILSON, 1RPO 8JRNL AUTH 2 H.J.HINZ,M.KOKKINIDIS 1RPO 9JRNL TITL RESTORED HEPTAD PATTERN CONTINUITY DOES NOT 1RPO 10JRNL TITL 2 ALTER THE FOLDING OF A 4-ALPHA-HELICAL BUNDLE 1RPO 11JRNL REF NAT.STRUCT.BIOL. V. 1 706 1994 1RPO 12JRNL REFN ASTM NSBIEW US ISSN 1072-8368 2024 1RPO 13REMARK 1 1RPO 14REMARK 1 REFERENCE 1 1RPO 15REMARK 1 AUTH M.KOKKINIDIS,M.VLASSI,Y.PAPANIKOLAOU,D.KOTSIFAKI, 1RPO 16REMARK 1 AUTH 2 A.KINGSWELL,D.TSERNOGLOU,H.J.HINZ 1RPO 17REMARK 1 TITL CORRELATION BETWEEN PROTEIN STABILITY AND CRYSTAL 1RPO 18REMARK 1 TITL 2 PROPERTIES OF DESIGNED ROP VARIANTS 1RPO 19REMARK 1 REF PROTEINS.STRUCT.,FUNCT., V. 16 214 1993 1RPOA 2REMARK 1 REF 2 GENET. 1RPOA 3REMARK 1 REFN ASTM PSFGEY US ISSN 0887-3585 0867 1RPO 22REMARK 2 1RPO 29REMARK 2 RESOLUTION. 1.4 ANGSTROMS. 1RPO 30REMARK 1RPO 94REMARK 999 SEQUENCE NUMBER IS ALSO THAT FROM PDB ENTRY 1RPO 95SEQRES 1 65 MET THR LYS GLN GLU LYS THR ALA LEU ASN MET ALA ARG 1RPO 96SEQRES 2 65 PHE ILE ARG SER GLN THR LEU THR LEU LEU GLU LYS LEU 1RPO 97SEQRES 3 65 ASN GLU LEU ALA ASP ALA ALA ASP GLU GLN ALA ASP ILE 1RPO 98SEQRES 4 65 CYS GLU SER LEU HIS ASP HIS ALA ASP GLU LEU TYR ARG 1RPO 99SEQRES 5 65 SER CYS LEU ALA ARG PHE GLY ASP ASP GLY GLU ASN LEU 1RPO 100

ATOM 1 N MET 1 1.132 3.053 2.801 1.00 25.53 1RPO 115ATOM 2 CA MET 1 2.398 3.546 2.283 1.00 27.85 1RPO 116ATOM 3 C MET 1 3.091 2.466 1.442 1.00 21.34 1RPO 117ATOM 4 O MET 1 2.642 1.298 1.451 1.00 19.29 1RPO 118ATOM 5 CB MET 1 3.281 3.936 3.463 1.00 23.96 1RPO 119ATOM 6 CG MET 1 3.718 2.760 4.291 1.00 27.52 1RPO 120ATOM 7 SD MET 1 4.491 3.371 5.797 1.00 26.29 1RPO 121ATOM 7 SD MET 1 4.491 3.371 5.797 1.00 26.29 1RPO 121ATOM 8 CE MET 1 3.039 3.650 6.762 1.00 25.19 1RPO 122ATOM 9 N THR 2 4.142 2.833 0.689 1.00 13.20 1RPO 123ATOM 10 CA THR 2 4.851 1.806 -0.025 1.00 12.76 1RPO 124ATOM 11 C THR 2 5.719 1.011 0.950 1.00 14.35 1RPO 125

x y z

residuo 1

residuo 2

sequenza

referenze

risoluzione

nomecomposto

autoreorganismo

num.atomotipo atomo

num. residuotipo residuo

parole-chiave myoglobin AND aplysia

utilizzo di un semplice programma di grafica molecolare RasMol

os9:Applications%20(Mac%20OS%209):RasMol%20v2.6:RasMac%20v2.6

Metodi computazionali per la predizione della struttura tridimensionale proteica:

quali sono e che grado di affidabilità offrono?

i metodi ab initio sono i più ambiziosi, ma i tempi di calcolo sono ancora TROPPO LUNGHI perché possano anche avere un interesse pratico

i metodi knowledge based sono attualmente quelli che sembrano funzionare meglio, anche se sono meno soddisfacenti dal punto di vista della comprensione ultima dei meccanismi naturali del folding delle proteine

obiettivi intermedi e meno ambiziosi

la predizione della struttura secondaria:quali segmenti della sequenza formano -eliche e

quali filamenti o anse?

il riconoscimento del fold (fold recognition o threading):

data una sequenza proteica e un insieme di possibili fold tridimensionali, è possibile identificare il fold più simile a quello davvero assunto dalla sequenza?

il modelling per omologia (homology modelling):se una proteina a struttura non nota è omologa ad

una proteina a struttura nota, possiamo assumere che le due strutture siano simili e usare l’una per generare un

modello dell’altra?

modelling per omologia (homology modelling)

La qualità del modello dipende dalla similarità tra le sequenze delle due proteine

in generale, a maggiore identità di sequenza tra due proteine, corrisponde maggiore similarità tra le corrispondenti strutture

se l’identità tra due sequenze proteiche è superiore al 30%, si può assumere che le loro strutture saranno simili

se una proteina a struttura non nota ha almeno il 30% di identità con una proteina a struttura nota, si può usare la seconda come templato per generare un modello per omologia della prima

Come nel confronto di sequenze e’ necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e’ necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficolta’ consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche’ in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loops che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l’ allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale

Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti.

L’r.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato

€

r.m.s.d= Di2 N

i=1

N

∑D = distanza tra coppie di atomi appaiatiN = numero di coppie considerate

un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati

si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s.

a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s.

a parità di r.m.s. verrà considerato migliore l’allineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati

valutazione dell’allineamento strutturale

oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

Grafico identità di sequenza/rms tra le strutture

% di residui identici nel core proteico

r.m

.s.d

.tra

ato

mi d

ella

cate

na p

rin

cip

ale

del c

ore

100 75 50 25 00,0

2,5

1,5

2,0

1,0

0,5

Lisozima di pollo

Alpha-lactalbumina di babbuino

1 KQFTKCELSQ NLYD--IDGY GRIALPELIC TMFHTSGYDT QAIVENDE-S TEYGLFQISN ALWCKSSQSP QSRNICDITC DKFLDDDITD DIMCAKKILD 1 KVFGRCELAA AMKRHGLDNY RGYSLGNWVC AAKFESNFNT QATNRNTDGS TDYGILQINS RWWCNDGRTP GSRNLCNIPC SALLSSDITA SVNCAKKIVS * * .***. . .* * .* . .* . * ..* ** * . * *.**..**.. **. ...* ***.*.* * .* *** . *****.

98 IK-GIDYWIA HKALCT-EKL EQWL--CEK- 101 DGNGMNAWVA WRNRCKGTDV QAWIRGCRL *.. *.* . * . . *. *

37% identitàdi sequenza

Predizione della struttura terziaria - diagramma di flusso

Confronto con banche dati di sequenze proteiche

Ricerche di motivi,fold recognition, ab initio

Valutazione accuratezza della predizione

Modelling per omologiausando coordinate di proteina

a struttura nota

sì

Allineamento di sequenze. E’ nota la struttura?

sì

no

no

Predizione di struttura secondaria

per costruire modelli per omologia di proteine che abbiamo una alta identità di sequenza con una proteina a struttura nota, si può utilizzare il server automatico SwissModel

SwissModel è disponibile all’indirizzo:http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html

prende in input una sequenza proteica e l’indirizzo di posta elettronica della persona che sottomette la sequenzacerca nel PDB possibili strutture che possano fare da templato (che abbiano cioè una buona identità di sequenza con la proteina query)

spedisce con la posta elettronica le coordinate del modello o le motivazioni della propria incapacità a produrne uno di buona affidabilità

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