Le tribolazioni di una proteina di

membrana

Francesca ZitoIBPC CNRS UMR 7099

FeS

cyt f

b6 IV

Le proteine di membrana costituiscono il 20-30% dei genomi

completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta

ancora una sfida

genoma unano: 40-60 000 geni

60-70 %proteine solubili

30-40 %Proteine di membrana

~ 6000 strutture ~ 20 strutture

LIKMHG

CE D

N

J

F

Genetica molecolare

BiochimicaCristallografiaRMN

struttura

funzione

Biochimica Spettroscopia

P700

Fd

PC

PC

PC

D2 D1

CP47CP43

E F LHN

OTP

R

Q

CP47CP43

IJ LKWMX

II I

IVIIIIII

IIIIII IIILhcbi

LhcbiLhcbi

PQ

PQ

IV-cyt b6

ISP

cyt f

LGM

PQ

2 H2O4H+ + O2

3 H+

ADP + Pi ATP

IKM

A BH G

CE D

N

J

F

P700

A0

Fd

Qi

Qo

bh

bl

cyt b6f PSIPSII ATPsynthase

FeS

cyt f

L

F

bl

cyt b6f PSIPSII ATPsynthase(mitochondrie)

b6 IVPQ

PQ

P

4H+ + O2

Q

2 H2O

II I

3 H+

ADP + Pi ATP

Antennes

stroma

C

C NN

N

C C

Nlumen

f

Rie

ske

b6 b6 b6 b6 GLIV IVIV M

C

CN

C

N

N

[function : b6 f & bc1]

QH2QH2

QH2

2H+

2H+

e-

e-

e-

e-

bH

bL

cyt f/c1

e-

e-

Q

Rieske

PC cyt

out

Cytochrome c oxidasePS I

PS II

Complex I

luminal

instromal

cytb6+IV/cytb

[function : b6f vs. bc1]

QH2QH2

QH2

2H+

e-

e-

e-

e-

bH

bL

e-

e-

2H+

H+

H+

e-

Q

PC cytc

Rieske

PS I

PS II

cyt f

Statetransitions

Kinase ?cytb6+IV

QH2QH2

QH2

2H+

e-

e-

e-bL

e-

e-

2H+

H+

H+

bH

e-

Q

PC cyt

Cyt f

PS IIPS I

Rieske

??

out

in

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l f R b6 IV 4 kDa

SDS-PAGE analysis of Chlamydomonas b6f complexpurified in Hecameg/egg PC mixed micelles

(TMBZ + silver)

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

stroma

lumen

subIVC

Rieskeprotein

C

NPetGPet

LPetMCC C

N N N

N

cytb6

CN

PetN C

N

β-car.

Chla

bL

bH

A B CD

Fe2S2

cytf

l l l l l f R b6 IV 4 kDa

) x 2

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

stroma

lumen

subIVC

Rieskeprotein

C

NPetGPet

LPetMCC C

N N N

N

cytb6

CN

PetN C

N

β-car.

Chla

bL

bH

A B CD

Fe2S2

cytf

l l l l l f R b6 IV 4 kDa

homology to bc1

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

stroma

lumen

subIVC

Rieskeprotein

C

NPetGPet

LPetMCC C

N N N

N

cytb6

CN

PetN C

N

β-car.

Chla

bL

bH

A B CD

Fe2S2

cytf

homology to bc1

structure solved

Solubilizzazione e Purificazione

Cristallizazione

Manipolazione in soluzione

Cristallizazione di una proteina di membrana

DissociazioneAggregazione

- Détergente + Détergente

Crystals from Hecameg/PC solution Cryo-EM projection map (Stroebel & Picot, unpublished) (Breyton, 2000)

100 µm

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

EM on 2D crystals

3D crystals

Risultato della purificazione:- Pura, actifttiva.- 3mg/ 20ml di membrane.

Particolarità:- Presenza di lipidi esogeni con ruolo stabilizzatore - Variabilità.- Difficile da modificare (hydroxylapatite)

Hécameg-lipides à 4°C

Gradient de saccharose

20mM Hécameg+ 0.1 g/l lipides

25mM HG

Solubilisation

Colonne d’hydroxylapatite

Ref.: Pierre et coll (1995) J. Biol. Chem. 270, 29342-29349.

Purificazione del complesso selvatico

b6 f

100 m

Cristalli piccoli e difficili da riprodurre

100 m

Ago in fase cubica

Ref.: E. Landau & J. Rosenbuch (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14532-14535.

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

stroma

lumen

subIVC

Rieskeprotein

C

NPetGPet

LPetMCC C

N N N

N

cytb6

CN

PetN C

N

β-car.

Chla

bL

bH

A B CD

Fe2S2

cytf

His6

Purificazione di un complesso portante un etichetta poli-istidina

Colonne d’échange

d’ionsb6 f

Colonnede nickel

b6 f

FPLC

FPLC

Solubilisation

Risultato della purificazione:- Pura, attiva.- 2mg /20ml di membrane.

Particolarità:- Possibilità di lavorare senza lipidi esogeni.- Risultati riproduttibili.- Protocollo rapido e flessibile- Cristalli dopo 4 giorni

Colonne de dessalage

FPLC

100 m

500 µm500 µm

400 µm

Cyt f

Cyt b6

pt su

Rieske

SuIV

SDS-PAGEdi un cristallo

Cristallisation

Purificazione in hecameg

i cristalli non ci soddisfano

Purificazione su colonna di affinità

Buoni cristalli!

FeS

cyt f

b6 IV

FeS

cyt f

b6 IV

H

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

Crystal grown from C12-M solution in the presence of C13-stigmatellin

400 µm

Crystal in cryo-loop Diffraction pattern (ESRF line BM30A)

~200 µm

Institut de Biologie Physico-ChimiqueUMR 7099, CNRS/Université Paris-7

100 m

FeS

b6 IV

H

cyt f

FeS

b6 IV

cyt f3,1 Å

stroma

lumen

115 Å

bH

bL

Fe2S2

f

--- b6 f --- bc1

~16 Å

bH

bL

Fe2S2

f

c1

Rieske TMH

PetLPetN

PetGPetM

D

AB

C

E

F

G

Cyt f TMH

4-kDasubunits

b6

IV

Cytochrome b6f transmembrane region – view from the lumen side

[transmembrane helices, b6f + bc1]

Rieske

PetLPetN

PetGPetM

D

AB

C

E

F

G

f

H

IX

c1

QP-C

QP-CH

IX

PetL

PetN

PetMPetG

f c1

G

F

D

A

C

B

--- Chlamydomonas b6 f

--- yeast bc1(1KB9 ; Lange et al., EMBO J. 20:6591, 2001)

Rieske

E

bc1

b6f

chlorophyll a

2 Fo – Fc (contouring at 1 σ)

MGDG

chlorophyll aC13-stigmatellin

-carotene

Cys35