LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINE�IN CELLULE E TESSUTI �

2. IMMUNOCITOCHIMICA

REAGENTI: �Anticorpi specifici diretti contro la proteina da localizzare�

GLI ANTICORPI SONO PROTEINE (IMMUNOGLOBULINE)�

Identifica la specie animale in cui �è stato prodotto l’anticorpo

Riconosce specificamente la proteina �contro cui è stato prodotto l’anticorpo e �si lega ad essa molto saldamente�

2. Iniettare la proteina in un animale che �-  riconoscerà la proteina come estranea a sé�-  produrrà anticorpi contro la proteina�

3. Isolare e purificare gli anticorpi�

METODO DIRETTO

Anticorpo primario �marcato �

METODO INDIRETTO

Anticorpo secondario �marcato

Campione�da esaminare�

REAZIONE NON

VISIBILE

Possibili alterazioni di�Anticorpo primario

PROCEDIMENTO 1. Isolare e purificare la proteina in esame

METODO INDIRETTO

Anticorpo secondario �marcato

L’anticorpo secondario è generato contro le proteine della �specie animale in cui è stato prodotto il primario

Esempio: �Anticorpo primario prodotto in coniglio �

Anticorpo secondario prodotto in capra contro il coniglio �

Anticorpi secondari marcati

METODO INDIRETTO Anticorpo secondario

marcato

L’anticorpo secondario può essere �marcato con: �

1. sostanze fluorescenti

VANTAGGI: �rapido, ottimo per colocalizzazioni, “estetico”�SVANTAGGI: �preparato non permanente, “sbiadisce”�

VANTAGGI: �preparato permanente, �amplificazione del segnale�

SVANTAGGI: �procedura più laboriosa, �meno versatile per colocalizzazioni�

METODO IMMUNO-ENZIMATICO

B SECONDARIO CON BIOTINA ENZIMA

PEROSSIDASI

+ H2O2 e DAB substrato cromogeno

B AVID

INA

B

B

PRODOTTO DI REAZIONE MARRONE

B

AVIDINA

B

B B

SEZIONE NON SI VEDE REAZIONE

B SECONDARIO CON BIOTINA

PRIMARIO

B

SEZIONE

PRIMARIO

SEZIONE

PROTEINA

METODO IMMUNO-ENZIMATICO

PRIMARIO

CONTROLLI

OMISSIONE DI PRIMARIO

OMISSIONE DI SECONDARIO

X X

PREADSORBIMENTO DEL PRIMARIO CON L’ANTIGENE

+

MARCATURE MULTIPLE: localizzare più proteine nella stessa sezione

Sono necessari: �

•  Anticorpi primari prodotti in specie animali diverse�

•  Anticorpi secondari prodotti in specie animali diverse�

•  Marcatori (Fluorocromi, Enzimi, ecc) diversi

MARCATURE MULTIPLE CON FLUOROCROMI DIVERSI�

MARCATURE MULTIPLE CON ENZIMI DIVERSI �

APPLICAZIONI DELLA

IMMUNOCITOCHIMICA

LOCALIZZAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA DI FOSFATASI ALCALINA + altre proteine

LOCALIZZAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA DI LAMININA-1 La laminina-1 è una grossa proteina EXTRACELLULARE composta da tre lunghe catene polipeptidiche (α, β, γ).

La laminina-1 è un componente delle lamine basali, situate alla base delle cellule endoteliali vascolari.

LAMINA BASALE

MUSCOLO LISCIO E

CONNETTIVO

laminina

INCUBAZIONE IN SISTEMA DI RIVELAZIONE = H2O2 + DIAMINOBENZIDINA�

-  lavaggi in tampone �-  DISIDRATAZIONE�-  MONTAGGIO DELLE SEZIONI CON PERMOUNT (= PREPARATO PERMANENTE)�-  VISIONE AL MICROSCOPIO�

LOCALIZZAZIONE IMMUNOCITOCHIMICA DI LAMININA-1 Campione = sezioni in paraffina�

B

SEZIONE

PRIMARIO

B AVID

INA

B

B

INCUBAZIONE IN SISTEMA DI RIVELAZIONE �= H2O2 + DIAMINOBENZIDINA �

-  lavaggi in tampone �-  DISIDRATAZIONE�-  MONTAGGIO DELLE SEZIONI CON PERMOUNT (= PREPARATO PERMANENTE)�-  VISIONE AL MICROSCOPIO�

Risultati attesi�