La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteinaLa messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteinarichiede la possibilitagrave dirichiede la possibilitagrave di

1 Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO ENZIMATICO)

2 Misurare la quantitagrave di proteine totali nel campione

3 Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse

mg o U di prot di interesse nella frazionemg o U di prot di interesse nella frazionemg o U di prot di interesse allrsquoinizio della purificazionemg o U di prot di interesse allrsquoinizio della purificazioneResaResa =

U di proteina di interesse nella frazioneU di proteina di interesse nella frazionemg di protine totali nella frazionemg di protine totali nella frazione

AAss ==

proteine totali (mg)

Enzima (mg)

Resa

Purezza ()

U totali As

(Umg)

Omogenato 1000 100 100 10 10000 10

1deg stadio

purificazione

5000

2deg stadio

purificazione

2500

3deg stadio

purificazione

1980

SaggioSaggiocolorimetricocolorimetrico Stima da SDS-PAGEStima da SDS-PAGE Valore ipotetico proteina Valore ipotetico proteina

pura = 100 Umgpura = 100 UmgSaggio di attivitagraveSaggio di attivitagrave

enzimaticaenzimatica

Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche sotto lrsquoinfluenza di un campo elettricosotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico

Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabiliMolte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabilie quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione e quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione come specie elettricamente carichecome specie elettricamente cariche

Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso ilmigrano verso il catodocatodo o lrsquoo lrsquoanodoanodo a seconda che possiedano una a seconda che possiedano una carica positiva (carica positiva (cationicationi) o negativa () o negativa (anionianioni))

Lrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoLrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoin un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagravein un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagrave

I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (comprendono la carica della molecola (qq) il gradiente di voltaggio del ) il gradiente di voltaggio del campo elettricocampo elettrico ((EE) la resistenza di attrito del mezzo di supporto () la resistenza di attrito del mezzo di supporto (ff))

Il prodotto dei parametri q ed E (Il prodotto dei parametri q ed E (q x Eq x E) fornisce la forza misurata in ) fornisce la forza misurata in newtonnewton che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica oppostaopposta

La forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricaLa forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricadipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla viscositagrave del tamponeviscositagrave del tampone

La velocitagrave (La velocitagrave (vv)) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico egrave data dunque dalla seguente equazioneegrave data dunque dalla seguente equazione

v Eqv Eq f f

Comunemente egrave adoperato il termine Comunemente egrave adoperato il termine mobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica ( (μμ) dello) delloione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoelettrico (vE)elettrico (vE)

Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loroelettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loromobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica

Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali diversediverse

Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilitagrave elettroforeticacomponenti in base alla loro mobilitagrave elettroforetica

Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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mg o U di prot di interesse nella frazionemg o U di prot di interesse nella frazionemg o U di prot di interesse allrsquoinizio della purificazionemg o U di prot di interesse allrsquoinizio della purificazioneResaResa =

U di proteina di interesse nella frazioneU di proteina di interesse nella frazionemg di protine totali nella frazionemg di protine totali nella frazione

AAss ==

proteine totali (mg)

Enzima (mg)

Resa

Purezza ()

U totali As

(Umg)

Omogenato 1000 100 100 10 10000 10

1deg stadio

purificazione

5000

2deg stadio

purificazione

2500

3deg stadio

purificazione

1980

SaggioSaggiocolorimetricocolorimetrico Stima da SDS-PAGEStima da SDS-PAGE Valore ipotetico proteina Valore ipotetico proteina

pura = 100 Umgpura = 100 UmgSaggio di attivitagraveSaggio di attivitagrave

enzimaticaenzimatica

Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche sotto lrsquoinfluenza di un campo elettricosotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico

Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabiliMolte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabilie quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione e quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione come specie elettricamente carichecome specie elettricamente cariche

Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso ilmigrano verso il catodocatodo o lrsquoo lrsquoanodoanodo a seconda che possiedano una a seconda che possiedano una carica positiva (carica positiva (cationicationi) o negativa () o negativa (anionianioni))

Lrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoLrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoin un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagravein un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagrave

I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (comprendono la carica della molecola (qq) il gradiente di voltaggio del ) il gradiente di voltaggio del campo elettricocampo elettrico ((EE) la resistenza di attrito del mezzo di supporto () la resistenza di attrito del mezzo di supporto (ff))

Il prodotto dei parametri q ed E (Il prodotto dei parametri q ed E (q x Eq x E) fornisce la forza misurata in ) fornisce la forza misurata in newtonnewton che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica oppostaopposta

La forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricaLa forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricadipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla viscositagrave del tamponeviscositagrave del tampone

La velocitagrave (La velocitagrave (vv)) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico egrave data dunque dalla seguente equazioneegrave data dunque dalla seguente equazione

v Eqv Eq f f

Comunemente egrave adoperato il termine Comunemente egrave adoperato il termine mobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica ( (μμ) dello) delloione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoelettrico (vE)elettrico (vE)

Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loroelettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loromobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica

Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali diversediverse

Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilitagrave elettroforeticacomponenti in base alla loro mobilitagrave elettroforetica

Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche sotto lrsquoinfluenza di un campo elettricosotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico

Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabiliMolte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabilie quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione e quindi ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione come specie elettricamente carichecome specie elettricamente cariche

Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche Sotto lrsquoinfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso ilmigrano verso il catodocatodo o lrsquoo lrsquoanodoanodo a seconda che possiedano una a seconda che possiedano una carica positiva (carica positiva (cationicationi) o negativa () o negativa (anionianioni))

Lrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoLrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoin un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagravein un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagrave

I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (comprendono la carica della molecola (qq) il gradiente di voltaggio del ) il gradiente di voltaggio del campo elettricocampo elettrico ((EE) la resistenza di attrito del mezzo di supporto () la resistenza di attrito del mezzo di supporto (ff))

Il prodotto dei parametri q ed E (Il prodotto dei parametri q ed E (q x Eq x E) fornisce la forza misurata in ) fornisce la forza misurata in newtonnewton che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica oppostaopposta

La forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricaLa forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricadipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla viscositagrave del tamponeviscositagrave del tampone

La velocitagrave (La velocitagrave (vv)) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico egrave data dunque dalla seguente equazioneegrave data dunque dalla seguente equazione

v Eqv Eq f f

Comunemente egrave adoperato il termine Comunemente egrave adoperato il termine mobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica ( (μμ) dello) delloione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoelettrico (vE)elettrico (vE)

Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loroelettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loromobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica

Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali diversediverse

Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilitagrave elettroforeticacomponenti in base alla loro mobilitagrave elettroforetica

Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Lrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoLrsquoelettroforesi egrave dunque il processo per cui molecole cariche si separanoin un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagravein un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilitagrave

I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico I fattori che influenzano la mobilitagrave di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (comprendono la carica della molecola (qq) il gradiente di voltaggio del ) il gradiente di voltaggio del campo elettricocampo elettrico ((EE) la resistenza di attrito del mezzo di supporto () la resistenza di attrito del mezzo di supporto (ff))

Il prodotto dei parametri q ed E (Il prodotto dei parametri q ed E (q x Eq x E) fornisce la forza misurata in ) fornisce la forza misurata in newtonnewton che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica oppostaopposta

La forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricaLa forza frizionale f la quale rallenta il movimento della molecola caricadipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dipende dalle dimensioni della molecola dalla sua forma dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lrsquoelettroforesi e dalla viscositagrave del tamponeviscositagrave del tampone

La velocitagrave (La velocitagrave (vv)) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico egrave data dunque dalla seguente equazioneegrave data dunque dalla seguente equazione

v Eqv Eq f f

Comunemente egrave adoperato il termine Comunemente egrave adoperato il termine mobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica ( (μμ) dello) delloione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoelettrico (vE)elettrico (vE)

Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loroelettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loromobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica

Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali diversediverse

Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilitagrave elettroforeticacomponenti in base alla loro mobilitagrave elettroforetica

Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Comunemente egrave adoperato il termine Comunemente egrave adoperato il termine mobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica ( (μμ) dello) delloione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoione che equivale alla velocitagrave dello ione diviso lrsquointensitagrave del campoelettrico (vE)elettrico (vE)

Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loroelettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loromobilitagrave elettroforeticamobilitagrave elettroforetica

Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni Anche molecole con carica elettrica uguale ma con dimensioni molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali molecolari differenti si separeranno per effetto di forze frizionali diversediverse

Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche Se il campo elettrico egrave rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli abbiano raggiunto gli elettrodi si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilitagrave elettroforeticacomponenti in base alla loro mobilitagrave elettroforetica

Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono Una volta terminata la separazione dei campioni questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale allaDirettamente proporzionale alla CARICA NETTACARICA NETTA

Inversamente proporzionale alleInversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARIDIMENSIONI MOLECOLARI

catodocatodo anodoanodo

ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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ElettroforesiElettroforesi

- +

+ + - +

- + - -

Velocitagrave diVelocitagrave dimigrazionemigrazione

Direttamente proporzionale al rapportoDirettamente proporzionale al rapporto CARICA MASSACARICA MASSA

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

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Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

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Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

+++++++

-------

Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazioneIl tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazionedelle molecole che devono essere separatedelle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Elettroforesi su GELElettroforesi su GEL quando il campo elettrico quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto avevano raggiunto

Aggiunta del FissativoAggiunta del Fissativo

Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Gli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione liberaGli studi pionieristici sullrsquoelettroforesi furono condotti in soluzione libera

Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicaApparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodicain particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere in particolar modo gli effetti negativi della diffusione potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesilimitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lrsquoelettroforesi

Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto Ciograve fu realizzato facendo avvenire lrsquoelettroforesi su un supporto meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone meccanico poroso il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deldi corsa ed allrsquointerno del quale si realizzava lrsquoelettroforesi degli ioni deltampone e del campionetampone e del campione

Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il

mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo mezzo di supporto) privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave di temperatura pH e osmolaritagrave e dovrebbe avere una porositagrave controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso

Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gelOggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano geldi di poliacrilammidepoliacrilammide o di o di agarosio agarosio

Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantiLe dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importantipercheacute contribuiscono al percheacute contribuiscono al coefficiente di attrito coefficiente di attrito ((ff))

Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al Lrsquoeffetto di setaccio del mezzo di supporto insieme al rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a rapporto caricamassa delle molecole contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campionedeterminare la separazione delle molecole del campione

COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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COMPONENTI PRINCIPALICOMPONENTI PRINCIPALI

AlimentatoreAlimentatore

Cella elettroforeticaCella elettroforetica

1 Per elettroforesi su gel verticale1 Per elettroforesi su gel verticale

2 Per elettroforesi su gel orizzontale 2 Per elettroforesi su gel orizzontale

Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante Se durante una elettroforesi egrave applicato un voltaggio costante lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della lrsquointensitagrave di corrente per effetto della diminuzione della resistenza aumenta determinando un aumento del calore resistenza aumenta determinando un aumento del calore sviluppato (si veda sviluppato (si veda la legge di Ohm VI=Rla legge di Ohm VI=R))Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante In questo modo si eliminano le una corrente costante In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore fluttuazioni di calore

Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) dal loro punto isoelettrico (pI)

Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lrsquoelettrodo di carica oppostalrsquoelettrodo di carica opposta

Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellrsquointervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pImaggioranza di esse ha un pIlt8lt8

Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migreragrave in un campo elettrico verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)verso lrsquoanodo (elettrodo positivo)

La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleLa tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecoleproteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio proteiche egrave lrsquoelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) dodecil solfato (SDS-PAGE)

La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sullrsquoelettrico si basa essenzialmente sullrsquoeffetto setaccioeffetto setaccio

LrsquoLrsquoSDS-PAGESDS-PAGE consente la separazione di molecole con un consente la separazione di molecole con un rapporto caricamassa identico ma di dimensioni rapporto caricamassa identico ma di dimensioni

molecolari diversemolecolari diverse

NellrsquoNellrsquoSDS-PAGESDS-PAGE la matrice del gel egrave una sostanza reticolata la matrice del gel egrave una sostanza reticolata che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno che agisce come un setaccio in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in diminuire la mobilitagrave elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensionirelazione alle loro dimensioni

Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di dellrsquoelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellrsquoelettroforesi di acidi nucleiciacidi nucleici

Lrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gelLrsquoacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel

La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la La porositagrave del gel di poliacrilammide puograve essere regolata variando la percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le percentuale di acrilammide eo il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammidecatene di acrilammide

Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente Lrsquoacrilammide allo stato liquido egrave una potente neurotossinaneurotossinaPertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideche prevedono lrsquoutilizzo di acrilammideQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraQuando pesate o utilizzate la polvere indossate una mascheraLe soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminatedi essere eliminateOgni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossiciapposito per rifiuti tossiciUna volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave Una volta polimerizzata lrsquoacrilammide perde tossicitagrave

I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantitagrave di NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)NNrsquo-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide)

La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide La bis-acrilammide composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado legate da un gruppo metilene egrave utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (di formare legami crociati (cross-linking agentcross-linking agent))

I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eI monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda eoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideoccasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammideIn tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per In tal modo nella catena egrave introdotto un secondo sito per lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami lrsquoestensione Ciograve fa sigrave che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definitacrociati a struttura ben definita

AcrilammideAcrilammide Bis-acrilammideBis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio Il processo di polimerizzazione dellrsquoacrilammide egrave un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e di catalisi radicalica ed inizia con lrsquoaggiunta di ammonio persolfato e della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) della base NNNrsquoNrsquo-tetrametilendiammina (TEMED) Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola produzione del corrispondente radicale libero (cioegrave una molecola con un elettrone spaiato) nel modo seguentecon un elettrone spaiato) nel modo seguente

Se rappresentiamo il radicale libero con RSe rappresentiamo il radicale libero con R ed il monomero di ed il monomero di acrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelacrilammide con M possiamo schematizzare la polimerizzazione nelmodo seguentemodo seguente

RR + M + M rarr RMrarr RMRMRM + M rarr RMM + M rarr RMMRMMRMM + M rarr RMMM + M rarr RMMM ecc ecc

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

Lrsquoammonio persolfato Lrsquoammonio persolfato egrave lrsquoestere disolfato egrave lrsquoestere disolfato

dellrsquoacqua ossigenata e dellrsquoacqua ossigenata e omolisa rapidamente a omolisa rapidamente a

radicali instabili radicali instabili (radicali solforici)(radicali solforici)

Il TEMED egrave unrsquoammina Il TEMED egrave unrsquoammina terziaria che reagisce terziaria che reagisce con questi radicali a con questi radicali a

formare radicali liberi formare radicali liberi TEMED che a loro volta TEMED che a loro volta

reagiscono con reagiscono con lrsquoacrilammide inducendonelrsquoacrilammide inducendone

la polimerizzazione la polimerizzazione

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione insieme tra loro da legami crociati derivanti dallrsquoinserzione occasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideoccasionale allrsquointerno della catena di molecole di bis-acrilammideDal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla Dal momento che lrsquoossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono soluzione tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da degassate prima dellrsquouso Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lrsquoossigeno disciolto lrsquoossigeno disciolto

GEL DI POLIACRILAMMIDEGEL DI POLIACRILAMMIDE(molto idrofilico =gt(molto idrofilico =gt

trattiene grosse quantitagrave di acqua)trattiene grosse quantitagrave di acqua)

AcrilammideAcrilammide bis-acrilammidebis-acrilammide

TEMED (iniziatore)TEMED (iniziatore)

(catalizzatore)(catalizzatore)

Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Ersquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideErsquo un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammideIn questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza In questo caso al posto dellrsquoammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavinariboflavinaLa soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La soluzione egrave illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel

Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essereLe dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono esserecontrollate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando controllate variando la quantitagrave di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiil grado di legami trasversali per ottenere pori piugrave strettiIn genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si In genere il grado di legami trasversali egrave mantenuto costante mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravevaria la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porositagravePer un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di Per un gel di una data composizione si avragrave una distribuzione statistica di dimensioni dei poridimensioni dei pori

Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave minimo mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori saragrave ritardataritardataIn ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni particolare ambito di dimensioni

Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

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Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Percentuale di Percentuale di acrilammideacrilammide

Ambito ottimale di Ambito ottimale di dimensioni dimensioni

molecolari (Da)molecolari (Da)

5-125-12 20000-15000020000-150000

10-1510-15 10000-8000010000-80000

gt15gt15 lt15000lt15000

NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 NB la percentuale di bis-acrilammide egrave fissa e corrisponde a circa il 5 dellrsquoacrilammidedellrsquoacrilammide

Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

- Na+

Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Per semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoPer semplificare lrsquoanalisi di miscele di proteine egrave possibile fare in modoche la separazione elettroforetica si basi solo sulle che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensionidimensioni delle delle catene polipeptidichecatene polipeptidiche

Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Ciograve si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Sodio Dodecil SolfatoSolfato (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si (SDS) Tale detergente si lega con forza alle proteine le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDSripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS

In media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDSIn media ogni due amminoacidi saragrave presente una molecola di SDS

Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH Poicheacute ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche adoperati per lrsquoelettroforesi la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestiterivestite saragrave molto piugrave negativa di quella delle catene non rivestite

Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per Inoltre il rapporto caricamassa saragrave essenzialmente identico per proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la proteine diverse dal momento che il rivestimento di SDS domina la caricacarica

La separazione delle catene polipeptidiche La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente denaturate e rivestite di detergente

si baseragrave quasi esclusivamente si baseragrave quasi esclusivamente sulle sulle dimensioni delle molecole proteichedimensioni delle molecole proteiche

proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

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Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

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bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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proteinaproteina

Sodio Dodecil SolfatoSodio Dodecil SolfatoCH3(CH2)10CH2OSO3

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La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

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Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

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Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

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bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

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bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela egrave essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoliessenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli

La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come La parte superiore del gel di poliacrilammide nota come stacking gelstacking gel egrave egrave versata direttamente al di sopra del versata direttamente al di sopra del resolving gelresolving gel

Lo Lo stacking gelstacking gel ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle ha delle proprietagrave che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gelresolving gel

In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolvingresolving gelgel in maniera efficace e riproducibile in maniera efficace e riproducibile

Lo Lo stacking gelstacking gel egrave polimerizzato con una piccola percentuale di egrave polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave acrilammide e di bis-acrilammide per assicurare unrsquoalta porositagrave ed egrave tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68tamponato con tampone Tris-HCl a pH 68

Il Il resolving gelresolving gel contiene invece una percentuale piugrave alta di contiene invece una percentuale piugrave alta di acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88acrilammide ed egrave tamponato con Tris-HCl a pH 88

Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 83 con glicina come controione

Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Quando la glicina del tampone di corsa entra nello Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stackingstacking gel a pH 68 saragrave principalmente gel a pH 68 saragrave principalmente nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione nella sua forma zwitterionica neutra con una piccola frazione (1) in forma di ione glicinato carico negativamenteglicinato carico negativamente

Ciograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di correnteCiograve impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente

Gli ioni ClGli ioni Cl-- restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente restano trasportatori efficienti di corrente a pH 68 e migrano rapidamente verso lrsquoanodoverso lrsquoanodo

Durante questa elettroforesi nello Durante questa elettroforesi nello stackingstacking gel la concentrazione degli ioni Cl gel la concentrazione degli ioni Cl-- scende scende drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di drasticamente allrsquoestremitagrave catodica del gel formando un gradiente crescente di concentrazione verso lrsquoanodoconcentrazione verso lrsquoanodo

Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante i quali hanno rapporti caricamassa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Clmaggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -- devono adesso migrare per devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Clportare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl -- e davanti alla glicina e davanti alla glicina

A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il A mano a mano che procede lrsquoelettroforesi le molecole proteiche che raggiungono il resolving gelresolving gel sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le sono ritardate notevolmente consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerleseguono di raggiungerle

Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo Il volume del campione di proteine ldquopresentatordquo al gel di risoluzione saragrave molto piugrave piccolo del volume caricato inizialmente sullo del volume caricato inizialmente sullo stackingstacking gel gel

Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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Quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocitagrave altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico

Percheacute ciograve avvenga egrave necessario che gli ioni glicinato piugrave lenti siano soggetti ad un campo elettrico piugrave intenso rispetto agli ioni Cl- piugrave veloci

Il campo elettrico egrave inversamente proporzionale alla conduttivitagrave la quale a sua volta egrave proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente

Il risultato egrave che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl- siano piugrave concentrati dei complessi SDS-proteina i quali a loro volta siano piugrave concentrati del glicinato

Dal momento che la quantitagrave di complessi SDS-proteina egrave molto inferiore alla quantitagrave di ioni glicinato questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl-

bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

bull La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolaresetaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel dovuti alle dimensioni dei pori del gel

bull Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre Le proteine piugrave piccole passano piugrave facilmente allrsquointerno dei pori del gel mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionalile proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali

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bull Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione per effetto del pH piugrave alto (68 nello (68 nello stacking gel stacking gel e 88 nel e 88 nel resolvingresolving gegel) diviene completamente ionizzato l) diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilitagravee quindi aumenta la propria mobilitagrave

bull Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni ClDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl -- migrano piugrave migrano piugrave velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manieravelocemente rispetto ai complessi SDS-proteina i quali migrano in manierainversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolariinversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari

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