ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE.
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ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE
PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA
-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita).
-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi).
-PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI.
-REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.
Applicazioni delle proteine ricombinanti
Sistemi di espressione
Procariotici (E.Coli)
Eucariotici:
Saccharomyces Cerevisiae (lievito)
Cellule di insetto (Baculovirus)
Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)
Animali transgenici
Piante transgeniche
Per evitare degradazione di proteine eterologhe e per permetterne una più semplice purificazione, queste vengono prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile dell’organismo ospite.
PROTEINE DI FUSIONE
Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che ci permettono di purificare la proteina d’interesseTAG
TAG DIMENSIONE LIGANDO
GST 25 kDa glutatione
MBP 40 kDa amilosio
FLAG (DYKDDDDK) 8 aa Anticorpo monoclonale
specifico
His-tag 6-10 aa Ni2+
GST
β-Lattamasi
Dominio catalitico PTP1B
GST PT
P
PROTEINE DI FUSIONE
NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI
UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA:
-inibizione funzioni cellula-perdita energia-perdita plasmide
Forti– Alta affinità per l’RNA polimerasi– Legame forte – trascritto ad alta frequenza– Legame debole- RNA Pol si stacca, no trasc.
Regolabile– L’espressione può essere controllata dal ricercatore, tramite induttori e repressori
Lattosio
IPTG
1. TRASFORMAZIONE DEL VETTORE D’ESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE.
2. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO.
3. INDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.
4. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.
ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE
Amp
Gene di interesse
1. TRASFORMAZIONE
E. Coli
Assunzione di DNA da parte di un organismo
1. TRASFORMAZIONE
12-16 ore
37°C
2-5x109 cellule
(N = N02n)
LB: Lysogeny Broth (Luria Broth) Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce) NaCl
2. AMPLIFICAZIONE
FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano)
FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante
PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono
FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono
t
Uni
tà f
orm
anti
colo
nie
latenza
espo
nenz
iale
plateau
morte
IPTG2 ore37°C
3. INDUZIONE
DILUIZIONE
1:100
0 1 2
ore
asso
rban
za
LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA
10’
4000 rpm
supernatante
Pellet (batteri)1. Recupero batteri
2. Lisi
congelamento/scongelamento
Lisozima (1 mg/ml) (agisce sulla membrana esterna)
Sonicazione (ultrasuoni)
3. Recupero componente proteica
detergenti
30’
13000 rpm
Supernatante(proteine)
Pellet (membrane, DNA)
4. PURIFICAZIONE
AZIONE DEL LISOZIMA
PARETE Gram- LISOZIMA
Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale delpeptidoglicano.
ESTRATTO PROTEICO
+ LAVAGGI con PBS
NaClKClNa2HPO4KH2PO4
GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO
3000 RPMRIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE
Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
POZZETTI PER CARICAMENTO
STACKING GEL
SEPARATING GEL
5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA
TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8
ACRILAMIDE 5%
SDS
TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8
ACRILAMIDE > 5%
SDS
-
+
running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore.
stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza.
Loading buffer
50 mM Tris-HCl pH 6.8 2% SDS
10% Glycerol 1% b-Mercaptoethanol
12.5 mM EDTA 0.02 % Bromophenol Blue
+loading buffer
95° C
COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA
•L’ELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO•L’SDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI•IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALIPONTI DISOLFURO
+
CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA
13000 rpm
PROTEINA NATIVA
RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA
PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA
ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA
RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE LE PROTEINE NEL CAMPIONE
L’SDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN ANIONE OGNI 2 aa
LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA
La separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante.
Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma, quindi la lunghezza della catena polipeptidica, che riflette la massa, e’ l’unico determinante della velocita’ di migrazione.
IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA
25 mM Tris HCl pH 8.3192 mM Glicina0.1% SDS
Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità
pH 8.3
Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl- sono la specie più veloce
pH 6.8
pH 8.8
Cl-
Cl-Cl-
Cl-
Cl-
Cl- Cl-Cl-
Cl-
GlyGly Gly
Gly
Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica
EFFETTO STACKING
All’inizio del separating gel il pH 8.8 riporta la glicina ad un rapporto carica/massa maggiore rispetto a quello delle proteine. La glicina supera i polipeptidi, che non trovandosi più in una regione ad elevata mobilità elettroforetica rallentano notevolmentee si ritrovano compattati in una linea molto sottile. Ora le proteine si trovano tutte allo stesso livello.Nel separating la concentrazione di acrilamide è più alta, e comincia la separazionedel campione in base al peso molecolare.
Cl-Cl- Cl- Cl-
Gly PROTEINECOLORANTE
Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità.
APPLICAZIONI
1. SI PUO’ SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN
2. SI PUO’ ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIOE UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI
3. SI PUO’ SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO