INGEGNERIAPROTEICA

L’ingegneria proteica è stata usata per due scopi:

1) La dissezione della struttura e dell’attività di unaproteina esistente, attraverso alterazioni sistematichee l’esame dei cambiamenti delle proprietà.(esempio: tirosil-tRNA sintetasi)

2) La produzione di “nuove” proteine per la medicina eper l’industria.(esempio: subtilisina)

Per comprendere il meccanismo catalitico di un enzimanon basta identificare tutti gli intermedi di reazione, mabisogna conoscere la natura e l’energia delle interazionitra proteina e substrati, intermedi, stati di transizione,prodotti. L’energia di queste interazioni è infatti usataper abbassare l’energia di attivazione e per determinare la specificità.

L’ingegneria proteica è uno strumento di indagine eccellente,in quanto può essere usata per alterare sistematicamente le interazioni tra proteina e substrato e le interazioni all’internodella proteina, al fine di analizzarne le proprietà allosterichee strutturali.

LA TIROSIL-tRNA SINTETASI

Questo fu il primo enzima ad essere studiato, nel 1982, tramite ingegneria proteica. Allora, il suo meccanismo cataliticoera del tutto sconosciuto, nonostante fosse nota la strutturacristallografica.

La tirosil-tRNA sintetasi di Bacillus stearotermophilus è unomodimero e catalizza l’aminoacilazione del tRNATyr in due passaggi:

E + Tyr + ATP E•Tyr-AMP + PPi

E•Tyr-AMP + tRNA Tyr-tRNA + E + AMP

Nel primo la tirosina viene attivata formando un complesso enzima-tirosiladenilato molto stabile. Nel secondo la Tyr viene trasferitaal tRNATyr.

Il meccanismo della reazione di attivazione, consiste in un attacconucleofilo del carbossilato della Tyr sul fosfato dell’ATP chegenera un intermedio pentacovalente. Quest’ultimo elimina ilpirofosfato (come sale del Mg2+). Il fosforo inverte la suaconfigurazione.E’ stata risolta la struttura cistallografica dei complessi E•Tyr e E•Tyr-AMP.

I REQUISITI CHE DEVONO ESSERE SODDISFATTIPER CONDURRE DEGLI STUDI SISTEMATICI DIMUTAGENESI SITO-SPECIFICA SONO:

La proteina deve essere disponibile in forma ricombinante

La struttura cristallografica deve essere stata risolta con unarisoluzione elevata.

I valori assoluti delle costanti di velocità devono essere noti.Preparazioni diverse di enzima danno valori diversi, per viadella presenza di quantità variabili di enzima inattivo.E’ necessario quindi normalizzare i valori ottenuti tramitetitolazione dei siti attivi. Gli studi allo stato pre-stazionario nonsono soggetti a queste variazioni e non soffrono della contaminazionedi piccole quantità di enzima selvatico.

Regole per produrre mutanti che possano dare risultatiinterpretabili:

1) Le mutazioni devono essere isosteriche o comportare una delezione;

2) Evitare di creare cariche interne non bilanciate;

3) Eliminare il minor numero di interazioni;

4) Non creare nuove interazioni che causino una riorganizzazionelocale della struttura;

5) tutte queste regole possono essere infrante se necessario.

Residui della tirosil-tRNA sintetasi che formano legami idrogenocon il tirosil adenilato.

Strategia: profili dell’energia libera e diagrammi di energia differenziali

La misura del profilo di energia libera (in realtà delle differenze dienergia libera) della reazione catalizzata dalle forme selvatica e mutanti dell’enzima comporta la misura delle seguenti costantidi equilibrio e di velocità:

Quindi i profili vengono calcolati utilizzando le teorie dellatermodinamica e dello stato di transizione. Dalla differenza deiprofili dell’enzima selvatico e delle forme mutanti si ottengonodei diagrammi di energia differenziali:

Diagramma di energia differenziale

Energia di legame apparentedel gruppo eliminato dallamutazione

Attivazione della tirosina:

1) Dimostrazione della complementarietà tra enzima e stato ditransizione

Thr40

His45

Thr40 e His45 formano un sito di legame per il fosfato dell’ATP nello stato di transizione:

Attivazione della tirosina:

2) Scoperta della complementarietà tra enzima ed intermedi:bilanciamento delle costanti di equilibrio interne;sequestro degli intermedi instabili.

Cys35

His48

Ci sono due buone ragioni per la complementarietà traenzima ed intermedi di reazione:

1) La complementarietà cambia la costante di equilibriodi reazioni sfavorevoli.

Tyr + ATP Tyr-AMP + PPi da 3,5•10-7 a 2,3

il tirosiladenilato deve essere presente ad elevateconcentrazioni nell’enzima perché deve reagire conil tRNA.

2) La resa delle reazione viene ad essere aumentata perchéil sequestro degli intermedi molto reattivi minimizza lereazioni collaterali. Il tirosiladenilato è molto reattivoed idrolizza rapidamente.

Attivazione della tirosina:

3) Rilevamento del processo di adattamento indotto.

Residui presenti sulloop “KMSK” chelegano lo stato di transizione

La flessibilità e l’adattamento indottorappresentano un compromesso tracomplementarietà tra enzima e statodi transizione e libero accesso deisubstrati al sito attivo.

IL MECCANISMO CATALITICO DELL’ATTIVAZIONEDELLA TIROSINA

Dai risultati dei diagrammi di energia differenziale si evince che

la catalisi non è realizzata da alcun residuo in particolare ma dal

numeroso insieme di residui che costituiscono il sito attivo.

Essa non viene attuata tramite un classico meccanismo di

catalisi acido-base o nucleofila, ma è il risultato della sola

energia di legame.

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